鄧琴琴， 王夢(mèng)洪， 裴兆輝

(1南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)二科， 江西 南昌 330009； 2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

EPO通過(guò)激活PI3K/Akt途徑上調(diào)HSP70的表達(dá)對(duì)低溫下心衰大鼠起保護(hù)作用*

鄧琴琴1， 王夢(mèng)洪2 △， 裴兆輝1

(1南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)二科， 江西 南昌 330009；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

目的： 評(píng)價(jià)紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)對(duì)低溫環(huán)境下心衰大鼠的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法: 80只SD大鼠隨機(jī)分5組，分別為對(duì)照組(CON組)、心衰低溫組(HFLT組)、心衰常溫組(HFNT組)、心衰低溫EPO組(HFLT+EPO組)和心衰低溫LY294002組(HFLT+EPO+LY組)。然后將所有大鼠放置于氣候箱中(CON、HFLT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組為低溫環(huán)境；HFNT組為常溫)。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠心功能，然后處死大鼠并留取心臟標(biāo)本，TUNEL法測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，熒光定量PCR測(cè)心肌組織中Fas和PI3K mRNA的表達(dá)，Western blot測(cè)大鼠心肌組織中熱休克蛋白70(HSP70)、Akt和p-Akt的水平。結(jié)果: 低溫下心衰大鼠心功能明顯低于常溫下心衰大鼠，HFLT+EPO組大鼠心功能較HFLT組明顯改善，給予LY294002干預(yù)后HFLT+EPO+LY組大鼠心功能明顯低于HFLT+EPO組；HFLT組及HFNT組凋亡指數(shù)均高于CON組(P<0.01)，HFLT組凋亡指數(shù)又明顯高于HFNT組(P<0.05)，HFLT+EPO組凋亡指數(shù)明顯低于HFLT組(P<0.01)。Fas mRNA在HFLT組心肌組織中的表達(dá)明顯高于HFNT組，PI3K mRNA在HFLT組和HFNT組心肌組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，HFLT+EPO組心肌組織中Fas的mRNA表達(dá)明顯低于HFLT組(P<0.01)和HFLT+EPO+LY組(P<0.05)，而PI3K的mRNA表達(dá)則明顯高于HFLT組和HFLT+EPO+LY組(P<0.05)。HFLT+EPO組大鼠心肌組織中p-Akt和HSP70的水平明顯高于HFLT組和HFLT+EPO+LY組(P<0.05)，CON、HFLT和HFNT組大鼠心肌組織中p-Akt和HSP70的蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。所有大鼠心肌組織中Akt的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)論: EPO活化PI3K/Akt后，上調(diào)內(nèi)源性保護(hù)途徑中HSP70的表達(dá)并抑制細(xì)胞凋亡，從而對(duì)低溫下的心衰大鼠心臟起保護(hù)作用。

紅細(xì)胞生成素； 低溫； 心力衰竭； PI3K/Akt信號(hào)通路

大量研究表明低溫會(huì)加重心力衰竭(heart fai-lure，HF)患者的臨床癥狀，增加住院率和死亡率[1-2]。研究表明加重的原因可能與低溫引起的感冒有關(guān)[3]。為進(jìn)一步增加心衰患者對(duì)低溫的抵抗力，需要尋找新的藥物進(jìn)一步改善患者的心功能。紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)具有促進(jìn)造血、抗凋亡、抗炎、促干細(xì)胞遷移等多種功能，最近發(fā)現(xiàn)其對(duì)心肌細(xì)胞尚有保護(hù)作用，但EPO在低溫環(huán)境下對(duì)心肌細(xì)胞是否具有保護(hù)作用研究甚少，本實(shí)驗(yàn)使用心衰大鼠模型研究EPO對(duì)低溫環(huán)境下心衰大鼠是否起保護(hù)作用，并通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt途徑探討EPO對(duì)低溫環(huán)境下心衰大鼠的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性純種SD大鼠80只，體重250～270 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 試劑及儀器 TRIzol RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real Master Mix均購(gòu)自天根公司；TUNEL試劑盒、LY294002及二甲基亞砜均購(gòu)自Promega；阿霉素及EPO均購(gòu)自Sigma；兔抗熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)單克隆抗體及羊抗Akt、p-Akt單克隆抗體均購(gòu)自Abcam；小鼠抗β-actin單克隆抗體及HRP標(biāo)記的 II 抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司；ECL超敏發(fā)光劑為T(mén)hermo產(chǎn)品；蛋白抽提試劑盒購(gòu)自北京普利來(lái)公司。751-GM紫外分光光度計(jì)(上?；萜辗治鰞x器有限公司)；超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán)公司)；水平電泳槽、垂直板蛋白電泳裝置(Bio-Rad)；熒光定量PCR儀(Beckman)；顯微鏡(Olympus)；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Heraeus)；蛋白轉(zhuǎn)移裝置(北京六一儀器廠)；氣候箱(南京艾賽特科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立及分組 雄性SD大鼠80只，體重250～270 g，隨機(jī)分5組：對(duì)照(control，CON)組8只；心衰低溫(heart failure in low temperature，HFLT)組20只；心衰常溫(heart failure in low temperature，HFNT)組20只；心衰低溫EPO組(HFLT+EPO組)14只；心衰低溫LY294002(LY)組(HFLT+EPO+LY組)18只。(1) HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組均予腹腔注射阿霉素制作大鼠心衰模型(每周2次，每次2.5 mg/kg，共5周)，CON組予同體積的生理鹽水5周； (2) 造模后，HFLT+EPO+LY組尾靜脈注射LY294002(0.3 mg·kg-1·d-1)，CON、HFLT、HFNT和HFLT+EPO組均予尾靜脈注射同體積的生理鹽水；30 min后，HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組腹腔注射EPO(4 000 U·kg-1·d-1)，CON、HFLT和HFNT組均予同體積的生理鹽水；然后將所有大鼠放置于氣候箱中(CON、HFLT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組為4 ℃，3 h；HFNT組溫度與外界溫度相同，3 h)，整個(gè)過(guò)程重復(fù)4 d。

2.2 超聲心動(dòng)圖檢查 選用GE Vivid 7彩色多譜勒超聲診斷儀，高頻探頭(12 MHz)，寬頻線陣，Gain 50 dB，深度2.5 cm。置于氣候箱后2 h進(jìn)行，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定于木板上，胸部脫毛，接心電圖，取大鼠胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension at end-diastole ，LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension at end-systole，LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌組織中HSP70、p-Akt和Akt的水平 稱取100 mg大鼠心肌組織剪碎，加入1 mL的裂解液勻漿(所有步驟均在冰上操作)。10 000×g離心10 min 后加入蛋白抽提試劑2 mL。10 000×g離心10 min后。溶液分為2層，中間為一層白色的蛋白膜。去除蛋白膜上下兩層液體，室溫干燥5 min，加入300 μL 4% SDS及300 μL 2×上樣緩沖液充分混勻，95 ℃加熱變性10 min。取制備的蛋白樣品12 μL進(jìn)行10% SDS-PAGE,蛋白分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉封閉1 h ；分別加入抗HSP70、p-Akt、Akt、α-actin 等 I 抗(除HSP70為1∶10 000外，其余均為1∶400稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗孵育4 h。用ECL發(fā)光劑，暗室曝光后凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析處理。

2.4 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。左心室組織固定、包埋、切片；脫蠟；體積分?jǐn)?shù)0.3%的H2O2封閉30 min；20 mg/L蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白；加TUNEL反應(yīng)液，37 ℃孵育70 min；加入抗熒光素抗體；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片。以不加TdT酶者為陰性對(duì)照，分別以用Dnase1(10 mg/L)消化的左心室心肌切片為陽(yáng)性對(duì)照。正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡心肌細(xì)胞核呈棕黃色。每只大鼠觀察4張切片，每張切片在40倍視野下，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野的凋亡細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的百分率即凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

2.5 熒光定量PCR測(cè)定心肌Fas和PI3K的mRNA表達(dá) 取100 mg左右的心肌組織加入約1 mL TRIzol，用RNA 提取試劑盒提取心肌總RNA，隨后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。Fas 的上游引物為5’-CGCCTATGGTTGTTGACC-3’，下游引物為5’-CTCCAGACATTGTCTCC-3’，擴(kuò)增片段為477 bp；PI3K的上游引物為5’-AGATGCTTTCAAACGCTAT-3’；下游引物為5’-GCTGTCGCTCACTCCA-3’，擴(kuò)增片段為359 bp；GAPDH的上游引物為5’-AGGCCGGCTTCGCGGGCG-3’，下游引物為5’-CTCGGGAGCCACACGCAG-3’，產(chǎn)物為450 bp。在ABI 7500型全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增并檢測(cè)熒光。擴(kuò)增參數(shù)： 94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s， 53 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線的測(cè)定，反應(yīng)條件： 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min， 95 ℃ 15 s。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 14.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)?zāi)┐婊畲笫?0只，其中CON組8只，HFLT組和HFLT+EPO組剩9只，HFLT+EPO+LY組余10只，HFNT組剩14只。11只大鼠在造模期間死于心力衰竭，其中CON組無(wú)死亡，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組分別死亡3、4、2和2只，另有19只死于氣候箱中，CON組無(wú)死亡，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組各分別死亡8、2、3和6只。

2 心臟超聲測(cè)定結(jié)果

與CON組相比，HFLT組經(jīng)阿霉素處理后，LVIDd和LVIDs明顯增加(P<0.01)，EF和FS明顯降低(P<0.01)；與HFNT組相比，HFLT組LVIDd、LVIDs增加(P<0.05)，EF和FS降低(P<0.05)，顯示低溫能進(jìn)一步使心功能惡化；與HFLT組相比，HFLT+EPO組的EPO處理能降低LVIDd和LVIDs(P<0.01)，增加EF和FS(P<0.01)；與HFLT+EPO組相比，HFLT+EPO+LY組LVIDd和LVIDs減低(P<0.05)，EF和FS增加(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

3 TUNEL法測(cè)定結(jié)果

光鏡下CON組偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)為4.21±0.88，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組均可見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞(其細(xì)胞核為棕褐色)，凋亡指數(shù)分別為28.79±3.10、23.56±2.20、11.45±1.50和24.63±2.33。CON組無(wú)明顯心肌細(xì)胞凋亡，HFLT組及HFNT組均有明顯的細(xì)胞凋亡，且凋亡指數(shù)均高于CON組(P<0.01)，HFLT組凋亡指數(shù)又明顯高于HFNT組(P<0.05)，HFLT+EPO組凋亡指數(shù)明顯低于HFLT組(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.Ultrasonic cardiogram of the rats in each group.

圖1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)5組SD大鼠心臟功能的超聲心動(dòng)圖

表1 各組SD大鼠心功能指標(biāo)情況

LVIDd: left ventricular internal dimension at end-diastole; LVIDs: left ventricular internal dimension at end-systole; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening.**P< 0. 01vsCON;#P<0.05，##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

Figure 2.Apoptosis of left ventricular myocardial tissues from the rats in each group (TNUEL, the scale bar=20 μm). Mean±SD.n=4.*P<0.01vsCON;#P<0.05，##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

圖2 TUNEL法檢測(cè)5組SD大鼠左室心肌細(xì)胞凋亡情況

4 qPCR檢測(cè)結(jié)果

與CON組相比，HFLT組Fas的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)，PI3K的mRNA表達(dá)下降(P<0.01)；與HFNT組相比，HFLT組的低溫處理能提高Fas的mRNA表達(dá)(P<0.05)，但對(duì)PI3K的mRNA表達(dá)無(wú)影響；與HFLT組相比，HFLT+EPO組的EPO處理能降低Fas的mRNA表達(dá)(P<0.01)，增加PI3K的mRNA表達(dá)(P<0.01)；與HFLT+EPO組相比，HFLT+EPO+LY組Fas的mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，PI3K的mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 5組SD大鼠左室心肌組織PI3K和Fas的mRNA表達(dá)水平

Table 2.The mRNA expression of PI3K and Fas in left ventri-cular myocardial tissues from the rats in each group (Mean±SD)

GroupnFasmRNAPI3KmRNACON80.32±0.111.07±0.15HFLT90.87±0.13**0.95±0.37HENT140.68±0.25#1.01±0.22HFLT+EPO90.55±0.12##2.92±0.34##HFLT+EPO+LY100.69±0.16△1.59±0.13△

**P<0. 01vsCON;#P<0.05,##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

5 Western blot檢測(cè)結(jié)果

與HFLT組相比，HFLT+EPO組的EPO處理明顯增加大鼠心肌組織中p-Akt和HSP70的水平(P<0.01)，而HFLT+EPO+LY組的LY294002處理則能削弱EPO的上述作用(P<0.05)；CON、HFLT和HFNT組p-Akt和HSP70的表達(dá)幾乎一樣，顯示低溫和阿霉素處理對(duì)p-Akt和HSP70的水平無(wú)影響；所有大鼠心肌組織中Akt的水平無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3。

討 論

最近人們發(fā)現(xiàn)氣候，尤其是溫度能夠?qū)π乃セ颊弋a(chǎn)生影響，大量研究表明低溫能夠使心衰患者的住院率及死亡率明顯增加，且原因可能是因?yàn)榈蜏厥剐乃セ颊叩男墓δ軔夯?Chang等[4]的研究證實(shí)了這一點(diǎn)，以低溫刺激心衰大鼠，大鼠的心功能出現(xiàn)進(jìn)一步下降，而且心力衰竭的過(guò)程中常伴隨著心肌細(xì)胞的凋亡[5]。本研究通過(guò)利用阿霉素及氣候箱模擬構(gòu)建低溫條件下大鼠心力衰竭模型，證實(shí)了低溫能夠使心衰大鼠心功能明顯下降并導(dǎo)致死亡，但對(duì)正常大鼠無(wú)明顯影響。故本研究以低溫環(huán)境下心衰大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，尋找低溫環(huán)境下除傳統(tǒng)治療心衰藥物外的新型藥物。

Figure 3.The protein levels of HSP70, p-Akt and Akt in left ventricular myocardial tissues from the rats with different treatments. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

圖3 5組SD大鼠左室心肌組織HSP70、p-Akt及Akt蛋白的表達(dá)

EPO是一種由腎臟分泌的糖蛋白，能與特異性的促紅細(xì)胞生成受體結(jié)合，刺激紅細(xì)胞的增殖與分化[6]，早期主要用于治療慢性貧血，然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素不僅能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成且能夠?qū)π募〖?xì)胞及心臟功能起保護(hù)作用[7]。而van der Meer等[8]進(jìn)一步證實(shí)在大鼠的心臟內(nèi)存在功能性促紅細(xì)胞生成素受體，且在大鼠心臟的缺血再灌注期，給予EPO能夠顯著改善左室功能，減輕心肌組織的損傷。

PI3K/Akt信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，已經(jīng)證實(shí)它可以介導(dǎo)多種細(xì)胞的保護(hù)作用，包括心肌細(xì)胞。有文獻(xiàn)表明Akt活化后可上調(diào)HSP70的表達(dá)，而熱休克蛋白是公認(rèn)的保護(hù)性蛋白，HSP70是其重要成員之一，低溫、缺氧等均可誘導(dǎo)其產(chǎn)生并對(duì)大鼠心肌細(xì)胞起保護(hù)作用[9-10]。此外另有研究表明PI3K/Akt在抵抗Fas調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡中起著主要作用[11]，即PI3K/Akt對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用的機(jī)制還可能與其抗心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，本研究結(jié)果提示低溫環(huán)境下心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，射血分?jǐn)?shù)明顯降低，說(shuō)明心衰大鼠的心功能在低溫的刺激下進(jìn)一步下降，進(jìn)一步的研究表明低溫下心衰大鼠心肌細(xì)胞中Fas的 mRNA表達(dá)明顯升高，HSP70及PI3K的mRNA表達(dá)則未見(jiàn)明顯升高，與Tanonaka等[9]的研究不符，這可能是因?yàn)樾乃ゴ笫筝^正常大鼠對(duì)低溫刺激的反應(yīng)性降低所致，由此可見(jiàn)低溫不能誘導(dǎo)心衰大鼠心肌細(xì)胞中HSP70的升高并對(duì)大鼠心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。而經(jīng)EPO處理后心衰大鼠心肌細(xì)胞中HSP70和PI3K的mRNA表達(dá)明顯升高，F(xiàn)as的mRNA表達(dá)則明顯降低，同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，射血分?jǐn)?shù)明顯升高，說(shuō)明心功能得到明顯改善，而LY294002則可阻斷這一作用。由此可見(jiàn)EPO的心肌細(xì)胞保護(hù)機(jī)制是由PI3K/Akt途徑介導(dǎo)的。

綜上所述，EPO能改善心衰大鼠的心功能，進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)低溫的耐受力，除治療貧血外也是一種高效的心臟保護(hù)劑。其作用基礎(chǔ)可能是通過(guò)激活PI3K/Akt途徑，增加HSP70的表達(dá)、抗心肌凋亡等保護(hù)受損的心肌，這其中是否還有其它信號(hào)通路的參與，尚需進(jìn)一步的考證。相信隨著對(duì)EPO作用及其機(jī)制的深入研究，EPO及其衍生物必將成為心臟保護(hù)治療的一種新方法。

[1] Gotsman I, Zwas D, Admon D, et al. Seasonal variation in hospital admissi-on in patients with heart failure and its effect on prognosis [J]. Cardiology, 2010, 117(4):268-274.

[2] Warren-Gash C, Bhaskaran K, Hayward A, et al. Circulating influenza virus, climatic factors, and acute myocardial infarction: a time series study in England and Wales and Hong Kong[J]. J Infect Dis, 2011, 203(12):1710-1718.

[3] von Klot S, Zanobetti A, Schwartz J. Influenza epidemics, seasonality, and the effects of cold weather on cardiac mortality. Influenza epidemics, seasonality, and the effects of cold weather on cardiac mortality[J]. Environ Health, 2012, 11:74.

[4] Chang Q, Natelson BH, Ottenweller JE, et al. The role of stressor intensity in influencing the course of heart disease in cardiomyopathic hamsters[J]. Pros Soc Exp Biol Med, 1996, 212(3):248-255.

[5] 米亞非， 李小鷹， 江 建， 等. rAAV-1SERCA2a 轉(zhuǎn)染改善心力衰竭犬心功能及其機(jī)制探討[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(2):208-213.

[6] Silva M, Benito A, Sanz C, et al. Erythropoietin can induce the expression of Bcl-xLthrough Stat5 in erythropoietin-dependent progenitor cell lines[J]. J Biol Chem, 1999, 274(32):22165-22169.

[7] 張新金， 馬業(yè)新， 文 淵， 等. 促紅細(xì)胞生成素通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2009, 25(2):293-298.

[8] van der Meer P, Lipsic E, Henning RH, et al. Erythropoietin improves left ventricular function and coronary flow in an experimental model of ischemia-reperfusion injury[J]. Eur J Heart Fail, 2004, 6(7):853-859.

[9] Tanonaka K, Yoshida H, Toga W, et al. Myocardial heat shock proteins during the development of heart failure[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 283(2):520-525.

[10]張偉華， 王麗娜， 李全鳳， 等. 熱休克蛋白70對(duì)H2O2誘發(fā)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2004, 20(3):402-406.

[11]Oaaki M, Kase S, Adachi K, et al. Inhibition of the PI3K-Akt signaling path-way enhances the sensitivity of Fas-mediated apoptosis in human gastric carcinoma cell line, MKN-45[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2004, 130(1):8-14.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Erythropoietin protects rats with heart failure in hypothermia by activating PI3K/Akt pathway and upregulating the expression of HSP70

DENG Qin-qin1, WANG Meng-hong2， PEI Zhao-hui1

(1TheSecondDepartmentofCardiology,NanchangThirdMunicipalHospital,Nanchang330009,China2DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wmh666888@sina.com)

AIM: To investigate the effect oferythropoietin (EPO) on the rats with heart failure (HF) in hypothermia and to explore its underlying mechanism. METHODS: The Sprague-Dawley rats (n=80) were randomly divided into five groups: control group (CON group), HF in low-temperature group (HFLT group), HF in normal temperature group (HFNT group), HF with EPO in low temperature group (HFLT+EPO group), and HF with EPO and LY2940002 in low temperature group (HFLT+EPO+LY group). All rats were housed in artifitial climate chamber. The animals in CON, HFLT, HFLT+EPO and HFLT+EPO+LY groups were under the low-temperature environment， while those in HFNT group were under normal temperature. The heart function was evaluated by echocardiography. The rats were then executed and the hearts were harvested. The apoptosis of myocytes was assessed by TUNEL method. The mRNA expression of Fas and PI3K was detected by fluorescence quantitative PCR (qPCR) and the protein levels of HSP70, Akt and p-Akt in the myocardial tissues were determined by Western blot. RESULTS: The rat cardiac functions in HFLT group were significantly deteriorated compared with HFNT group. The cardiac functions in HFLT+EPO group were improved compared with HFLT group. The cardiac functions in HFLT+EPO+LY group were significantly pejorated compared with HFLT+EPO group. The apoptotic index of the myocardium in HFLT group and HFNT group was significantly higher than that in CON group (P<0.01). The apoptotic index of the myocardium in HFLT group was significantly higher than that in HFNT group (P<0.05).The apoptotic index of the myocardium in HFLT+EPO group was significantly lower than that in HFLT group (P<0.01).The mRNA expression of Fas in HFLT group was significantly higher than that in HFNT group, and no obvious difference of the mRNA expression level of PI3K between HFLT group and HFNT group was observed. The mRNA expression of PI3K in HFLT+EPO group was significantly lower than that in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05), and that in HFLT+EPO group was significantly higher than that in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05). The protein levels of p-Akt and HSP70 in HFLT+EPO group was also higher than those in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05), and no obvious difference of the protein levels of p-Akt and HSP70 in CON, HFLT and HFNT groups was found. The protein level of Akt had no significant difference in each group. CONCLUSION: The pathway of PI3K/Akt may be one of the cardioprotective ways of EPO. EPO activates the PI3K/Akt pathway， upregulates the experssion of HSP70 (an endogenous protective factor) and inhibits the apoptosis, thus protecting the cardiac functions in the rats with HF in hypothermia.

Erythropoietin; Hypothermia; Heart failure; PI3K/Akt signaling pathway

1000- 4718(2017)07- 1203- 06

2016- 09- 20

2017- 05- 16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81260293)

R363.1+23； R541.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.008

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0791-88692501； E-mail： wmh666888@sina.com