辜洪嬌， 陳曉華， 孔田玉， 胡 歡， 劉寧寧， 熊旭明， 張振輝△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2心血管疾病研究所， 廣東 廣州 510260)

去泛素化酶USP14調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷*

辜洪嬌1， 陳曉華1， 孔田玉1， 胡 歡1， 劉寧寧2， 熊旭明1， 張振輝1△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2心血管疾病研究所， 廣東 廣州 510260)

目的： 觀察抑制泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)的活性對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。方法: 體外培養(yǎng) H9c2 心肌細(xì)胞，用H2O2(25 μmol/L)處理2 h，建立心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。將細(xì)胞分為對(duì)照(control，CON)組、模型組(H2O2組)、USP14抑制劑IU1處理組(IU1組)和IU1處理后建模組(IU1+H2O2組)。MTS法檢測(cè) H9c2心肌細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生和細(xì)胞存活率；Western blot法檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶家族相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果: 與CON組相比，H2O2組細(xì)胞活力、細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞內(nèi)ROS含量、Bax/Bcl-2、P53、p-ERK1/2、p-JNK和p-P38的蛋白水平顯著增加(P<0.05)；與H2O2組比較，IU1+H2O2組細(xì)胞活力、細(xì)胞存活率顯著增加，細(xì)胞內(nèi)ROS含量、Bax/Bcl-2、P53、p-ERK1/2、p-JNK和p-P38蛋白水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論: 抑制USP14活性可以減輕氧化應(yīng)激條件下H9c2 心肌細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能與抑制絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)活化和下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)。

泛素特異性蛋白酶14； IU1； 氧化應(yīng)激； 細(xì)胞凋亡； 絲裂原活化蛋白激酶

心肌急性缺血、缺氧、再灌注等異?？蓪?dǎo)致心肌的急性損傷，從而引起許多心血管疾病如充血性心力衰竭、心肌梗死、心肌病等的發(fā)生，其中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷是這些疾病發(fā)生過(guò)程中重要的參與者[1]。體內(nèi)ROS增多可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死或者凋亡，因此，如何減輕心肌細(xì)胞在氧化應(yīng)激中的急性損害一直是當(dāng)前研究者關(guān)注的重點(diǎn)之一。

去泛素化酶(deubiquitinating enzyme，DUB)作為泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)的重要組成成分，可調(diào)節(jié)靶蛋白泛素化進(jìn)程，參與腫瘤與癌癥[2]、代謝與應(yīng)激[3]、感染與免疫[4]、干細(xì)胞與發(fā)育調(diào)控[5]等體內(nèi)相關(guān)病理生理過(guò)程。泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)是一種重要的去泛素化酶，參與人體內(nèi)多種蛋白質(zhì)的降解及多種信號(hào)通路的調(diào)控[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，用USP14的選擇性抑制劑IU1抑制USP14活性后，可能通過(guò)降低糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β)的磷酸化水平發(fā)揮抗心肌肥厚的作用[7]。促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是心肌細(xì)胞中一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與介導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。USP14對(duì)急性心肌氧化損傷的生物學(xué)作用目前尚不清楚，本研究用不同濃度的IU1預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞，探討抑制USP14活性是否減輕過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞急性損傷，其作用機(jī)制是否與MAPK信號(hào)通路(P38、JNK和ERK1/2)和凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2、P53的變化相關(guān)。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；高糖DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco；MTS檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega；活性氧、凋亡等檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司；IU1、H2O2購(gòu)自Sigma；抗p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、Bax、Bcl-2、P53等抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology。取大鼠H9c2心肌細(xì)胞，用含10%胎牛血清的 DMEM完全培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞活力的檢測(cè) 取H9c2細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔細(xì)胞數(shù)為1×105)，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為：對(duì)照(control，CON)組、H2O2(25 μmol/L)處理組、IU1(25 μmol/L、50 μmol/L)處理組和IU1預(yù)處理后加H2O2組(IU1+H2O2組)，每組至少3個(gè)復(fù)孔。H2O2作用2 h后，每孔培養(yǎng)板加入MTS試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A)值。設(shè)對(duì)照組為100%，計(jì)算其余各組與對(duì)照組的比值。

2.2 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%融合狀態(tài)時(shí)按上述分組處理、收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌2次。按凱基凋亡檢測(cè)試劑盒中說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

2.3 ROS水平的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后按以上分組方法處理細(xì)胞，PBS 洗滌1 次，根據(jù)凱基活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提示處理細(xì)胞，以激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2.4 不同濃度的H2O2作用后USP14蛋白的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%融合狀態(tài)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)H2O2處理組。分組處理2 h后，裂解細(xì)胞，提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，蛋白經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉， USP 14 I 抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜3次，II 抗室溫孵育1 h，PBST洗膜后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，以GAPDH 作為內(nèi)參照蛋白。

2.5 Bax、Bcl-2、P53及MAPK通路相關(guān)蛋白的檢測(cè) H9c2 細(xì)胞分組同2.1。Western blot步驟與USP14檢測(cè)步驟一致。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，2組間差異采用t檢驗(yàn)，多組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抑制USP14活性可降低由H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷

如圖1所示，H2O2(25 μmol/L)處理2 h后，心肌細(xì)胞活力顯著低于CON組(P<0.05)；IU1(25、50 μmol/L)+H2O2處理組的細(xì)胞存活率較H2O2處理組明顯升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)；而IU1單獨(dú)處理組與CON組比較，細(xì)胞活力無(wú)明顯變化。

2 抑制USP14活性可增加H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞存活率

如圖2所示，細(xì)胞存活率為第3象限細(xì)胞所占比值。25 μmol/L H2O2作用于大鼠心肌細(xì)胞2 h后，其存活率明顯低于CON組(P<0.05)；與H2O2組相比，IU1(25 μmol/L、50 μmol/L)+H2O2處理組存活率明顯升高(P<0.05)。

Figure 1.The changes of the viability of H9c2 cells induced by H2O2and/or IU1. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsH2O2group.

圖1 不同濃度IU1作用對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力的影響

Figure 2.The effect of IU1 at different concentrations on the survival rate of H2O2-induced H9c2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsH2O2group.

圖2 不同濃度IU1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響

3 抑制USP14活性可降低H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平

圖3顯示，與CON組相比，H2O2組的平均熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)；與H2O2組相比，IU1+H2O2處理組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)，即心肌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著降低。

Figure 3.The effect of IU1 at different concentrations on the intracellular ROS expression in H2O2-induced H9c2 cells. MFI： mean fluuoreacence intensity. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsH2O2group.

圖3 不同濃度IU1作用對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

4 不同濃度H2O2作用H9c2細(xì)胞后USP14蛋白的表達(dá)變化

圖4結(jié)果顯示，不同濃度H2O2(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)處理2 h后，H9c2心肌細(xì)胞的USP14蛋白表達(dá)與CON組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 4.The effects of H2O2at different concentrations on the expression of USP14 in the H9c2 cells. Mean±SD.n=5.

圖4 不同濃度H2O2作用H9c2細(xì)胞后USP14的表達(dá)

5 抑制USP14活性可降低H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和P53蛋白的表達(dá)

圖5結(jié)果顯示，與CON組相比，H2O2組的凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值和P53的蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IU1+H2O2處理組與H2O2組相比，Bax/Bcl-2比值和P53的蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

6 抑制USP14活性對(duì)p-ERK1/2、p-JNK和p-P38水平的影響

如圖5所示，與CON組相比，H2O2組的p-ERK1/2、p-JNK和p-P38蛋白水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IU1+H2O2處理組與H2O2組相比p-ERK1/2、p-JNK和p-P38的蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 5.The effect of IU1 at different concentrations on the protein expression in H2O2-induced H9c2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsH2O2group.

圖5 不同濃度IU1作用對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白水平的影響

討 論

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是急性心肌損傷的主要病理機(jī)制之一。正常的生理情況下，H2O2作為ROS的成分之一，參與體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡等許多重要的細(xì)胞過(guò)程，過(guò)量的ROS可直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用損傷細(xì)胞[8]。

許多研究已證實(shí)在結(jié)直腸癌、上皮性卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝內(nèi)膽管癌等腫瘤中均有USP14高表達(dá)的現(xiàn)象，USP14可能在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中具有明顯促進(jìn)作用[9-10]。然而有研究表明，某些DUBs在凋亡的調(diào)控中具有促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的雙重復(fù)雜作用，USP14作為一種重要的去泛素化酶，可以通過(guò)調(diào)節(jié)靶蛋白的穩(wěn)定性來(lái)影響蛋白的功能(其靶蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子以及酶等)，同時(shí)也可以通過(guò)調(diào)節(jié)如NF-κB、MLK3、Wnt、UPR等多種相關(guān)信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、DNA損傷等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[11-12]。USP14在凋亡過(guò)程的調(diào)控中可能具有促進(jìn)或抑制凋亡的雙重作用，而USP14行使相關(guān)功能也可能與細(xì)胞所處的環(huán)境有關(guān)。

本研究中使用不同濃度的H2O2作用H9c2細(xì)胞后USP14蛋白的表達(dá)與正常細(xì)胞相比，并無(wú)明顯差異，但抑制USP14活性能顯著改善H2O2對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。為進(jìn)一步探討去泛素化酶USP14調(diào)控心肌細(xì)胞抗氧化損傷的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度(25 μmol/L、50 μmol/L)的IU1抑制USP14活性，觀察H9c2細(xì)胞內(nèi)增殖、凋亡及MAPKs通路的變化情況。

MAPKs是心肌細(xì)胞中一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，起著整合胞內(nèi)信號(hào)，并將胞漿信號(hào)與表達(dá)程序偶聯(lián)在一起的作用，參與介導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。其主要有3個(gè)亞族，P38 MAPK、JNK/SAPK以及ERK1/2?？傮w上說(shuō)，ERK1/2主要由生長(zhǎng)因子活化，對(duì)細(xì)胞的增殖和存活起著重要的作用，P38和JNK通路可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，有研究表明，不同的細(xì)胞中這些通路作用的機(jī)制更為復(fù)雜[13]。某些情況下，P38 和JNK短暫的活化可提供一個(gè)生存信號(hào)，而持續(xù)的活化則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這些信號(hào)通路的平衡共同決定細(xì)胞的生存或死亡。我們?cè)谏鲜鲅芯恐邪l(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，可能同時(shí)激活MAPK通路的3個(gè)亞族，通過(guò)特異性拮抗USP14的活性，對(duì)這3個(gè)亞族均有抑制作用，但具體的機(jī)制并不清楚，仍需進(jìn)一步探討。

在心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體起關(guān)鍵作用，Bcl-2 家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax比值變化可直接影響線粒體膜的極性，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，最終激活細(xì)胞調(diào)亡。抑癌基因p53在正常細(xì)胞中表達(dá)水平很低，在缺血、缺氧損傷中，P53表達(dá)增加，ROS合成增加，形成氧化應(yīng)激，從而破壞線粒體的氧化磷酸化[14]。在某些類(lèi)型的細(xì)胞中，P53蛋白可直接激活Bcl-2家族基因表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常細(xì)胞相比，H2O2處理細(xì)胞存活率顯著下降，而P38、JNK和ERK1/2磷酸化水平均顯著升高，同時(shí)P53、Bax和細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高，Bcl-2表達(dá)下降；用IU1抑制USP14活性后，細(xì)胞存活率顯著升高，P38、JNK和ERK1/2的磷酸化水平明顯降低，同時(shí)P53、Bax和細(xì)胞內(nèi)的ROS含量顯著下降，Bcl-2表達(dá)升高。

綜上所述，抑制去泛素化酶USP14的活性可在體外較好的抗氧化損傷所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制ERK1/2、JNK/SAPK及P38 MAPK信號(hào)通路活化、下調(diào)凋亡蛋白P53和Bax、上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

USP14 regulates H2O2induced oxidative stress in H9c2 cells

GU Hong-jiao1, CHEN Xiao-hua1, KONG Tian-yu1, HU Huan1, LIU Ning-ning2, XIONG Xu-ming1, ZHANG Zhen-hui1

(1DepartmentofCriticalCareMedicine，2GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260,China.E-mail:drzhzhh@126.com)

AIM: To evaluate the effect of inhibiting ubiquitin-specific protease 14 (USPl4) activity on oxidative stress induced by H2O2of H9c2 cells. METHODS: The H9c2 cells were incubated with H2O2at 25 μmol/L for 2 h to establish the oxidative stress injury model. The cells were divided into control group, H2O2group, IU1 group (25 μmol/L or 50 μmol/L) and IU1+ H2O2group. The H9c2 cells activity was measured by MTS assay. The level of intracellular reactive oxygen species (ROS) and cell survival rate were analyzed by flow cytometry assay. The changes of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family related proteins were detected by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the cell activity and the viability rate in H2O2group were decreased (P<0.05), while the intracellular ROS, the protein levels of Bax/Bcl-2, P53, p-ERK1/2, p-JNK and p-P38 were increased (P<0.05). Compared with H2O2group, the cell activity and the viability rate of the H9c2 cells in IU1+H2O2group were increased (P<0.05), while the intracellular ROS, the protein levels of Bax/Bcl-2, P53, p-ERK1/2, p-JNK and p-P38 were decreased (P<0.05). CONCLUSION: Inhibition of USPl4 activity reduces the oxidative stress injury of the H9c2 cells. The mechanism may be related to inhibition of the MAPK signaling and down-regulation of apoptosis related proteins.

Ubiquitin-specific protease 14; IU1; Oxidative stress; Apoptosis; Mitogen-activated protein kinase

1000- 4718(2017)07- 1209- 05

2016- 11- 03

2017- 03- 17

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No. 81201453；No. 81400231)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2013010014887)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2014A020212330)；廣州市珠江科技新星專項(xiàng)(No. 201506010071)

R541； R363.1+4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.009

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