沈海濤， 吳 娜， 王 煜， 陳之光， 劉振寧， 趙 敏△

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 1急診科， 2內(nèi)分泌科， 遼寧 沈陽 110004)

?；撬釋Π俨菘葜卸敬笫竽I損傷的作用及機制研究*

沈海濤1， 吳 娜2， 王 煜1， 陳之光1， 劉振寧1， 趙 敏1△

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院1急診科，2內(nèi)分泌科， 遼寧 沈陽 110004)

目的： 探討不同劑量牛磺酸對百草枯中毒大鼠腎臟氧化應激和炎癥反應的影響。方法: 選取48只雄性SD大鼠隨機分為陰性對照組、百草枯染毒組、百草枯染毒+小劑量?；撬峤M和百草枯染毒+大劑量?；撬峤M。采用生化檢測儀檢測大鼠血清肌酐及尿素氮水平；比色法檢測血標本中丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平評估氧化應激狀態(tài)；另以ELISA法檢測血標本中IL-6及細胞間黏附分子1(ICAM-1)水平評估炎癥反應；DHE熒光探針檢測腎臟活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平；Western blot法檢測大鼠腎臟標本絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)中p-P38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2的蛋白水平；并以real-time PCR法檢測大鼠腎臟內(nèi)TNF-α、TGF-β1及IL-6的mRNA 水平。結(jié)果: 百草枯中毒大鼠血清肌酐及尿素氮增高，?；撬岣深A后降低了中毒大鼠的肌酐及尿素氮水平，且大劑量?；撬峤M的肌酐及尿素氮水平更低。?；撬岬母深A不僅明顯減輕了腎臟組織的氧化應激與炎癥反應，同時也降低了百草枯中毒大鼠腎臟的MAPK活性。結(jié)論: ?；撬岣深A能減輕百草枯中毒大鼠的腎損傷，其作用機制可能與下調(diào)了腎臟MAPK活性、減輕了腎臟氧化應激及炎癥反應有關。

?；撬?； 百草枯； 腎臟； 氧化應激； 炎癥因子

近年來，百草枯(paraquat，PQ)中毒因其極低的中毒濃度成為臨床中常見農(nóng)藥中毒之一，因病程發(fā)展迅速，病情兇險，且一直沒有找到特效解毒劑，所以在臨床上病死率非常高[1]。百草枯除草效果好，不污染環(huán)境，因此在世界范圍內(nèi)廣泛應用。百草枯因其性價比極高，在我國市場發(fā)展迅猛，我國作為農(nóng)業(yè)大國，是目前全世界生產(chǎn)和使用百草枯最多的國家。百草枯中毒損傷的靶器宮包括肺臟、腎臟、肝臟等。其中，急性腎臟損傷可發(fā)生在百草枯中毒的早期，嚴重時可表現(xiàn)為急性腎功能衰竭,甚至死亡[2]。腎臟最重要的生理功能是排泄，正常情況下毒物及炎性物質(zhì)可以從腎臟大量排出體外。然而百草枯中毒時，一旦損傷腎臟，會導致排泄毒物及炎性物質(zhì)的能力減弱，引起百草枯及炎性物質(zhì)在體內(nèi)蓄積，而加重對肺臟及肝臟等器官的損傷[3]。因此，在百草枯中毒時，能否對腎臟的功能進行維護性治療占有很重要的地位，腎臟功能的完整是保證其它臟器有效治療的基礎。

目前認為百草枯中毒與機體氧化應激反應有關[4]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒大鼠腎臟損傷與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)中的c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase， JNK)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)及P38 MAPK有關[5]。本實驗采用腹腔注射百草枯的方式建立百草枯中毒大鼠，同時給予抗氧化劑?；撬?taurine，Tau)干預，通過檢測大鼠機體及腎臟的氧化應激水平，從核酸及蛋白水平檢測MAPK及其下游炎癥因子表達情況，來探討?；撬釡p輕百草枯中毒大鼠腎臟損傷的機制。

材 料 和 方 法

1 試劑、儀器及動物

百草枯純品和?；撬峒兤?Sigma)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的比色法試劑盒購中國南京建成公司；白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)及細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的ELISA試劑盒購于Uscnlife；dihydroethidium (DHE)試劑盒購于Santa Cruz；抗磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗體、抗磷酸化JNK(p-JNK)抗體、抗磷酸化P38(p-P38)抗體及抗β-actin抗體均購于Santa Cruz； TRIzol試劑盒和定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于日本TaKaRa公司。熒光顯微鏡(BX41, Olympus)。清潔級Sprague-Dawley雄性大鼠，周齡6～8周，體重區(qū)間200～250 g，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供。大鼠適應性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)的溫度控制20～25 ℃，濕度控制40%～70%，晝夜節(jié)律控制12 h，自由進食水。該實驗方案經(jīng)過中國醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(倫理號為2015PS302K)。

2 實驗方法

2.1 動物分組 選取48只雄性Sprague-Dawley大鼠按照隨機分組原則分為陰性對照(negative control，Con)組、百草枯染毒組(PQ)、百草枯染毒+小劑量牛磺酸組(L-Tau組)及百草枯染毒+大劑量?；撬峤M(H-Tau組)。染毒組大鼠腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液(配制濃度及方法為10 g/L溶于生理鹽水)；陰性對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水；百草枯染毒+小劑量牛磺酸組大鼠腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液，6 h后予小劑量牛磺酸(200 mg·kg-1·d-1)經(jīng)灌胃針注入；百草枯染毒+大劑量牛磺酸組大鼠腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液，6 h后予大劑量牛磺酸(400 mg·kg-1·d-1)灌胃。

2.2 血清中肌酐及尿素氮水平的測定 百草枯腹腔注射后72 h，大鼠禁食12 h后，麻醉大鼠，右心室取血，離心后置-80 ℃冰箱凍存。使用全自動生化學檢測儀(HITACHI)檢測大鼠肌酐及尿素氮水平。

2.3 血清中氧化應激及炎癥因子水平的測定 將凍存血清置于室溫中解凍，按試劑盒說明書步驟采用比色法檢測血中MDA及SOD水平，采用ELISA法檢測大鼠血標本中所含IL-6及ICAM-1的水平。

2.4 腎臟組織中活性氧簇水平的檢測 通過腎臟冰凍切片的DHE熒光顯像來評價腎臟組織ROS水平。百草枯腹腔注射后72 h，大鼠完全進入麻醉狀態(tài)后，迅速開腹剝離并取出腎臟，經(jīng)生理鹽水充分洗凈，置入液氮速凍完全后置于-80 ℃冰箱保存用以備檢測。DHE熒光探針的操作方法參照我們之前文獻中的描述[6],取一部分腎臟組織做冰凍切片，經(jīng)PBS充分清洗后，將10 μmol/L的DHE熒光探針溶于PBS溶液中，之后將混勻的溶液加到之前所切的組織塊上，將組織塊完全覆蓋住，再置于37 ℃避光孵育30 min；完成后以PBS反復沖洗切片組織3次已達到將DHE液完全洗凈的程度，甘油封片后通過熒光顯微鏡成像對比不同組織所呈現(xiàn)熒光強度的差異，并留取圖片。應用軟件IPP 6.0檢測各組圖片熒光密度，熒光密度即可反映各組氧化應激水平，從而比較各組大鼠腎臟的氧化應激水平。

2.5 Western blot法檢測腎臟MAPK蛋白的表達 腎臟組織勻漿，制成勻漿液，離心,測定蛋白濃度，每管50 μg蛋白分裝。BCA 法進行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取20 μL加樣；使用10% SDS-PAG在150 V、30 mA條件下電泳1.5 h； 50 V條件下轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)2 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加 I 抗，4 ℃過夜; TBS沖洗5 min×3次，加入 II 抗(1∶500)室溫下孵育2 h，用0.1% TBST沖洗15 min×3次，ECL顯影掃描，條帶灰度值以IPP 6.0測定。

2.6 Real-time PCR法檢測腎臟組織IL-6、ICAM-1及TGF-β1 的mRNA水平 按TRIzol試劑盒說明書提取各組大鼠腎臟勻漿的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄反應，將RNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，將合成好的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。在PCR儀上進行變性、退火、擴增反應，PCR反應完畢后分析產(chǎn)物熔解曲線判斷反應的特異性，以2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。IL-6的上游引物序列為5’-TCGAGCCCACCGGGAACGAA-3’，下游引物序列為5’-GCAACTGGACCGAAGGCGCT-3’；ICAM-1的上游引物序列為5’-CCTTCCTCACCGTGTACTGG-3’，下游引物序列為5’-AGCGTAGGGTAAGGTTCTTGC-3’；TGF-β1的上游引物序列為5’-TAATGGTGGACCGCAACAACG-3’，下游引物序列為5’-CTTGCTGTACTGTGTGTCCAG-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物序列為5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。采集到的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析并用Tukey法進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠血清肌酐及尿素氮水平

百草枯染毒組血清肌酐及尿素氮水平較對照組明顯增高(P<0.05)；小劑量?；撬峒按髣┝颗；撬岣深A均使染毒大鼠血清肌酐和尿素氮水平降低，相對來說大劑量牛磺酸干預組血清肌酐和尿素氮水平的降低程度更為顯著(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The changes of serum creatinine and urea nitrogen levels in the rats with different treatments. Mean±SD.n=12.#P<0.05vsCon group;*P<0.05vsPQ group;△P<0.05vsL-Tau group.

圖1 大鼠肌酐及尿素氮水平的比較

2 血清中MDA、SOD、IL-6及ICAM-1水平的變化

與陰性對照組相比較，百草枯染毒組的SD大鼠血標本中MDA水平明顯增高，牛磺酸干預使其降低(P<0.05)。相反，百草枯染毒組大鼠血標本中SOD水平較正常組降低，大劑量?；撬岣深A使其增高(P<0.05)，但小劑量?；撬岵挥绊慡OD水平。我們進一步計算MDA/SOD值，發(fā)現(xiàn)百草枯中染毒組大鼠的MDA/SOD值明顯增高(P<0.05)，大劑量及小劑量?；撬岣深A后均使MDA/SOD降低，且大劑量組降低得更顯著(P<0.05)。血清中IL-6及ICAM-1水平均較百草枯染毒組增高，?；撬岣深A使IL-6及ICAM-1降低，且大劑量的?；撬崾蛊浣档偷酶@著(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The levels of oxidative stress and inflammatory factors in the serum of the rats. Mean±SD.n=12.#P<0.05vsCon group;*P<0.05vsPQ group;△P<0.05vsL-Tau group.

圖2 大鼠血清中氧化應激及炎癥因子水平的比較

3 腎臟組織中的ROS含量

百草枯染毒使大鼠的腎臟ROS含量明顯增高，?；撬崾菇M織中ROS降低，且大劑量?；撬嶙饔酶@著(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.ROS content in the kidney of the rats (×40). Mean±SD.n=12.#P<0.05vsCon group;*P<0.05vsPQ group;△P<0.05vsL-Tau group.

圖3 大鼠腎臟ROS水平的比較

4 腎臟組織中MAPK蛋白表達的變化

百草枯染毒使大鼠腎臟中p-ERK1/2、p-JNK及p-P38蛋白水平明顯增高，?；撬岣深A后使其蛋白水平降低。相比小劑量?；撬?，大劑量牛磺酸干預后p-ERK1/2與p-JNK的蛋白水平下降更明顯(P<0.05)，但p-P38并無顯著差異，見圖4。

Figure 4.The changes of the MAPK protein content in the renal tissues of the rats with different treatments. Mean±SD.n=12.#P<0.05vsCon group;*P<0.05vsPQ group;△P<0.05vsL-Tau group.

圖4 大鼠腎臟MAPK蛋白含量的比較

5 腎臟組織中IL-6、ICAM-1及TGF-β1的mRNA水平

百草枯中毒后，腎臟組織中IL-6、ICAM-1及TGF-β1的mRNA水平較正常時增高，?；撬岣深A后使mRNA的增高程度減弱(P<0.05),且大劑量?；撬嶙饔酶鼮槊黠@(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The mRNA levels of inflammatory cytokines in the rat kidneys. Mean±SD.n=12.#P<0.05vsCon group;*P<0.05vsPQ group;△P<0.05vsL-Tau group.

圖5 大鼠腎臟炎癥因子mRNA水平的變化

討 論

在之前的實驗中，我們曾給予大鼠一次性腹腔注射不同劑量的百草枯，分別為每公斤體重10 mg、20 mg、30 mg、40 mg及50 mg百草枯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每公斤體重20 mg的百草枯劑量死亡率極低，同時可以獲得得滿意的中毒率[7]。因此，在本實驗中，我們用該劑量來構建百草枯中毒大鼠模型。我們發(fā)現(xiàn)?；撬岬母深A降低了百草枯中毒大鼠的肌酐，同時也抑制了中毒大鼠的JNK活化、減輕了氧化應激及炎癥反應，而且在一定濃度范圍內(nèi)，?；撬岬倪@種保護作用與其劑量成正比。

本研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒大鼠腎臟功能受損，肌酐清除率下降，同時腎臟組織內(nèi)的ROS水平升高，PCR發(fā)現(xiàn)IL-6及ICAM-1的mRNA水平也有所增高。ROS是線粒體在氧化還原過程中產(chǎn)生的具有強氧化活性的物質(zhì)，是反映體內(nèi)氧化應激水平的直接指標之一[8]。IL-6及TNF-α作為細胞因子，受體廣泛分布于大部分細胞，在炎癥反應中介導了非常重要的通路[9]。我們發(fā)現(xiàn)，?；撬岬母深A減輕了百草枯中毒大鼠的腎損傷，且大劑量?；撬嵝Ч黠@。同時?；撬岬母深A減弱了百草枯中毒大鼠腎臟ROS水平，IL-6和TNF-α的mRNA水平，本研究中?；撬嵋矞p輕了機體血清中的氧化應激及炎癥反應。抗氧化劑?；撬釡p弱了氧化應激，同時減輕了炎癥反應，說明氧化應激啟動了百草枯所致的腎損傷。MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要調(diào)控作用，能被多種炎性刺激所激活，參與介導細胞應激反應、免疫反應和細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細胞間的功能同步等多種過程；ERK1/2可以被生長因子、細胞因子等所激活，參與細胞增殖、分化與凋亡等，有研究報道抑制ERK活性則可以抑制凋亡；而作為MAPK家族的最主要成員，JNK的作用也不容忽視，它可將細胞外刺激介導為細胞內(nèi)的多種反應。激活JNK通路的主要配體是細胞因子，在某些應激刺激之下也可激活，從而起到促進或抑制細胞黏附，調(diào)節(jié)著效應細胞的增殖、分化以及凋亡進程。在未受應激刺激或細胞因子激活的細胞中，JNK主要存在于胞質(zhì)內(nèi)，少量存在于細胞核內(nèi)。在相應的細胞因子激活或者應激反應刺激后， JNK大量活化并轉(zhuǎn)運入細胞核內(nèi)，與特定基因結(jié)合從而引起效應基因的表達變化[10]。本研究中大鼠百草枯中毒模型的腎臟組織內(nèi)JNK尤其是磷酸化亞型的活性增加，這與陳達等[5]的研究一致。除此之外，本研究中我們還發(fā)現(xiàn)?；撬崮芙档桶俨菘葜卸敬笫竽I臟的JNK與ERK活性，同時減輕其機體及腎臟的氧化應激及炎癥反應，且大劑量?；撬岬淖饔酶鼜?。而p-P38在?；撬岣深A下有所下降，但大劑量?；撬岵⑽慈〉妙愃朴贘NK的抑制作用，說明牛磺酸的主要作用位點可能不在于此。由此我們推斷，?；撬崮鼙Ｗo百草枯中毒大鼠的腎功能，主要與抑制JNK和ERK激活、下調(diào)氧化應激及炎癥反應有關。而且在本實驗所應用的劑量范圍內(nèi)，?；撬釋Π俨菘葜卸敬笫蠹毙阅I損傷的拮抗作用隨劑量的增加而得到強化。

目前普遍認為百草枯中毒與機體氧化應激反應有關。百草枯所致的臟器損傷程度取決于氧自由基、還原物質(zhì)及臟器氧含量三者之間的互相作用[11]。因此，積極探尋百草枯中毒的發(fā)病機制及抗氧化治療藥物已成為目前國際研究的熱點。目前維生素C及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)等抗氧化劑已應用于臨床。研究顯示，NAC可以通過抑制MDA水平增高及GSH降低，影響肺泡上皮細胞誘導型一氧化氮合酶表達水平和NO合成，從而減輕肺組織細胞凋亡及DNA損傷[12-14]。維生素C可降低經(jīng)PQ處理的小鼠胚胎干細胞的總ROS水平[15]。但NAC及維生素C對百草枯腎損傷的保護作用尚不明確。而?；撬釓V泛分布于動物組織和器官內(nèi)，因此來源充足，價格便宜，如能證實此藥有改善百草枯中毒腎損傷的作用，在一定程度上阻止百草枯中毒的發(fā)病和進展，將會帶來巨大的經(jīng)濟效益。?；撬岵粌H可以通過清除氧自由基而達到抗脂質(zhì)過氧化的作用，還可以通過多通路的作用從而抑制細胞凋亡并抑制細胞鈣超載，并可穩(wěn)定線粒體內(nèi)部結(jié)構和功能從而使氧化還原反應得以正常進行[16]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸能減輕百草枯中毒大鼠的肺損傷[17-18]。 Nagata等[19]的研究發(fā)現(xiàn)?；撬崮芨纳瓢俨菘葜卸敬笫蟮哪I功能，但是其機制尚未明確。牛磺酸是否能減輕腎臟的氧化應激及炎癥反應尚未見相關報道。通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)牛磺酸可以減輕氧化應激及炎癥反應，可能與抑制JNK及ERK1/2的激活有關。

百草枯中毒的治療目前尚無特效解毒劑，其主要治療手段包括防止百草枯繼續(xù)吸收、促進百草枯通過自體代謝或血液凈化排出、激素、抗氧化藥物綜合治療及支持對癥等。研究不同的抗氧化劑，尋求多靶點、多層次的干預治療，將為百草枯的藥物治療提供一定的理論依據(jù)。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of taurine on kidney injury induced by paraquat poisoning in rats

SHEN Hai-tao1, WU Na2, WANG Yu1, CHEN Zhi-guang1, LIU Zhen-ning1, ZHAO Min1

(1DepartmentofEmergency,2DepartmentofEndocrinology,ShengjingHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China.E-mail:zhaom@sj-hospital.org)

AIM: To study the effects of taurine at different doses on renal oxidative stress and inflammation induced by paraquat in rats. METHODS: Male SD rats (n=48) were randomly divided into 4 groups: negative control group, paraquat group, paraquat + low-dose taurine group, and paraquat + high-dose taurine group. The serum levels of creatinine and urea nitrogen were detected by a biochemical analyzer. The levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were measured by colorimetry. The plasma concentrations of IL-6 and intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 were detected by ELISA. Renal reactive oxygen species (ROS) was checked by fluorescence probe dihydroethidium (DHE). The protein levels of renal p-P38 MAPK, p-ERK1/2 and p-JNK were determined by Western blot. The mRNA expression of TNF-α, IL-6 and TGF-β1 was detected by real-time PCR. RESULTS: Serum creatinine and urea nitrogen increased after paraquat poisoning, and decreased after feeding with taurine in poisoned rats, with better result in high-dose taurine group. Taurine reduced the oxidative stress and inflammation in the renal tissue, and also reduced the protein levels of p-JNK, p-ERK1/2 and p-P38 in the kidney of paraquat-poisoned rats. CONCLUSION: Taurine attenuates renal injury induced by paraquat poisoning in rats. The mechanism may be related to reducing renal MAPK activity, oxidative stress and inflammatory response.

Taurine; Paraquat; Kidney; Oxidative stress； Inflammatory factors

1000- 4718(2017)07- 1295- 06

2016- 10- 28

2017- 02- 10

國家自然科學基金面上項目(No. 81671898)；遼寧省教育廳項目(No. LK201603； No. LK201633)

R595.4； R363.1+3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.023

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△通訊作者 Tel: 18940251619; E-mail: zhaom@sj-hospital.org