孫 媛, 曾 瑤, 閆寶佐， 李海云

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642)

有輪瑞利絳蟲(圓葉目：戴維科)精子的超微結(jié)構(gòu)

孫 媛, 曾 瑤, 閆寶佐， 李海云

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642)

【目的】構(gòu)建有輪瑞利絳蟲Raillietinacesticllus精子的超微結(jié)構(gòu)示意圖。【方法】利用透射電鏡技術，對寄生于雞消化道的有輪瑞利絳蟲的精子形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征進行觀察?！窘Y(jié)果】有輪瑞利絳蟲的精子呈絲狀，兩端漸尖，具有冠狀體，無線粒體，具有“9+1”類型的軸絲。精子從頭至尾可劃分為5區(qū)：I區(qū)，頭部，具冠狀體；II區(qū)，皮層微管明顯，圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁出現(xiàn)；III區(qū)，大量電子致密顆粒出現(xiàn)；IV區(qū)，細胞核出現(xiàn)；V區(qū)，尾部，軸絲游離。有輪瑞利絳蟲和棘槽瑞利絳蟲R.echinobothrida的精子具有1個冠狀體，其他6種已報道的戴維科絳蟲的精子均有2個冠狀體；而有輪瑞利絳蟲和棘槽瑞利絳蟲精子冠狀體的旋轉(zhuǎn)角度不同，分別是40°～55°和35°?！窘Y(jié)論】精子頭部冠狀體的數(shù)目和旋轉(zhuǎn)角度可以將有輪瑞利絳蟲和其他7種戴維科絳蟲區(qū)分開來。

有輪瑞利絳蟲； 精子； 超微結(jié)構(gòu); 透射電鏡; 冠狀體

利用精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)生過程構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生關系，在扁形動物系統(tǒng)學的研究中得到了廣泛應用。Justine[1-2]研究了11個目56種絳蟲精子的結(jié)構(gòu)和發(fā)生過程，歸納了真絳蟲精子結(jié)構(gòu)的共源性狀，闡述了精子結(jié)構(gòu)及其發(fā)生過程在絳蟲系統(tǒng)學研究中的意義。Levron等[3]利用62種絳蟲精子的超微結(jié)構(gòu)特征，分析了12個目絳蟲的系統(tǒng)發(fā)生關系，詳述了精子形態(tài)結(jié)構(gòu)在絳蟲分類學研究中的重要作用。截止到目前，已有100余種絳蟲的精子的研究報道[2-3]，涉及到槽首目Bothriocephalidea，鯉蠢目Caryophyllidea，圓葉目Cyclophyllidea，二葉目Diphyllidea，裂頭目Diphyllobothriidea，單槽目Haplobothriidea，日帶目Nippotaeniidea，原頭目Proteocephalidea，佛焰苞槽目Spathebothriidea，四槽目Tetrabothriidea，四葉目Tetraphyllidea和錐吻目Trypanorhyncha等絳蟲。有輪瑞利絳蟲Raillietinacesticillus隸屬于圓葉目戴維科Davaineidae瑞利屬Raillietina，主要寄生于鳥類消化道，常見宿主為雞和火雞。目前，國內(nèi)外已報道5種瑞利屬絳蟲精子的完整結(jié)構(gòu)，分別是比爾瑞利絳蟲R.baeri[4]，棘槽瑞利絳蟲R.echinobothrida[5]，微棘瑞利絳蟲R.micracantha[6]，R.tunetensis[7]和維納哥瑞利絳蟲R.vinagoi[8]。本文從養(yǎng)殖雞消化道中收集有輪瑞利絳蟲，利用透射電鏡對其精子結(jié)構(gòu)進行研究，并和已有的戴維科絳蟲精子結(jié)構(gòu)進行比較分析，歸納總結(jié)戴維科絳蟲精子超微結(jié)構(gòu)的特點，旨在豐富絳蟲精子形態(tài)特征數(shù)據(jù)，促進絳蟲學相關研究的深入開展。

1 材料與方法

1.1 材料

有輪瑞利絳蟲取自雞腸道。雞腸道于廣州市長湴菜市場及廣州市五山菜市場等地獲得。將雞腸道剖開，將有絳蟲寄生者浸泡于自來水中，待蟲體自然脫落后，用解剖針將其挑起，置于9 g·L-1的生理鹽水中沖洗干凈備用。

1.2 透射電鏡樣品的制備

取所需的絳蟲蟲體片段，先用4 ℃的w為2.5%的戊二醛溶液固定4 h以上，再經(jīng)4 ℃的w為1%的四氧化鋨溶液固定1 h(戊二醛溶液和四氧化鋨溶液都用pH 7.4的0.2 mol·L-1磷酸緩沖液配制)，雙固定后經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗6次，梯度酒精(φ為50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，Leica UCT超薄切片機切片，切片厚90 nm，切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，TECNAI G2 12分析型透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

透射電鏡下，有輪瑞利絳蟲的精巢近似圓形，其內(nèi)充滿大量成熟的線性精子(圖1A)。精子呈現(xiàn)兩端漸尖的絲狀結(jié)構(gòu)，整條精子均有質(zhì)膜下皮層微管包圍，前端存在1個繞在精子頭部的冠狀體，無線粒體，具有“9+1”類型的軸絲。軸絲由1根位于中央的微管和9對位于外周的微管組成，中央微管由鞘膜套包繞，鞘膜套發(fā)出9條纖維細絲，與外周的9對微管相連，形成車輪狀的微管系統(tǒng)。軸絲有圍軸鞘包圍，胞質(zhì)含有電子致密顆粒和蛋白質(zhì)樣橫隔壁結(jié)構(gòu)，后者兩端分別連接著圍軸鞘和皮層微管。細胞核螺旋狀纏繞軸絲。

Ac:頂錐, Ax:軸絲,Cm:皮層微管,Cb:冠狀體,edg:電子致密顆粒, Fl: 游離軸絲,Ps:圍軸鞘,Pse:精子后端,Sz:精子, W:橫隔壁, N:細胞核；A:精巢縱切面示精子、精子后端(標尺=2 μm)；B:Ⅰ區(qū)縱切面示精子頂錐和冠狀體(標尺=0.5 μm)；C:Ⅱ區(qū)縱切面示軸絲、皮層微管、圍軸鞘和蛋白質(zhì)橫隔壁(標尺=0.2 μm)；D:Ⅲ區(qū)橫切面示高密度電子顆粒、皮層微管(標尺=0.2 μm)；E:Ⅳ區(qū)縱切面示細胞核(標尺=0.5 μm)；F:Ⅳ區(qū)橫切面示細胞核(標尺=0.2 μm)；G:Ⅴ區(qū)橫切面示皮層微管、游離軸絲(標尺=0.5 μm)；H:精子橫切面示Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ區(qū)(標尺=0.5 μm)；I:精子橫切面示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ區(qū)(標尺=0.5 μm)。

圖1 透射電鏡下有輪瑞利絳蟲的精子

Fig.1 Transmission electron microscopy observation ofRaillietinacesticllusspermatozoon

根據(jù)精子微細結(jié)構(gòu)特征的不同，可將精子從頭至尾分成5區(qū)，其各區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征如下：

Ⅰ區(qū)：直徑約為250～350 nm，冠狀體的存在標志著精子頭部的位置。精子的頂端有1個形似帽子的頂錐連接著精子的頭部(圖1B)。精子頭部后面緊接著出現(xiàn)1個冠狀體纏繞在精子表面(圖1B、1C)，旋轉(zhuǎn)角度為40°～55°，厚度約為100 nm，軸絲從精子頭部區(qū)域開始延伸，此區(qū)域內(nèi)沒有圍軸鞘?？v切面中，精子外層的皮層微管形成電子致密表層。橫切面可見軸絲位于斷面中央，為“9+1”模式(圖1C、1H)。

Ⅱ區(qū)：直徑約為350～450 nm，冠狀體消失，皮層微管明顯，橫切面呈明顯螺旋排列在精子質(zhì)膜下，開始出現(xiàn)圍軸鞘包圍軸絲(圖1C)。胞質(zhì)中有電子密度較低的顆粒且分布較均勻，在精子的這一區(qū)段出現(xiàn)了少量的蛋白質(zhì)樣橫隔壁，間隔長短不一(圖1C、1I)。這一區(qū)域精子的橫切片形狀存在一些差異，有圓形及不規(guī)則形狀(圖1I)。

Ⅲ區(qū)：直徑約為350～400 nm，切面可見精子外層的皮層微管明顯增厚，螺旋形排列在外。精子橫斷面基本上都是圓形，軸絲位于橫斷面的中央。蛋白質(zhì)樣橫隔壁將胞質(zhì)均勻分成許多小室，其中充滿了大量的電子致密顆粒(圖1D)，蛋白質(zhì)樣橫隔壁兩端分別連接著圍軸鞘和皮層微管(圖1I)。

Ⅳ區(qū)：直徑約為350 nm，此區(qū)域最明顯的特征是出現(xiàn)了極高電子密度的細胞核?？v切面上，核呈不規(guī)則螺旋形纏繞著軸絲(圖1E)。圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁逐漸消失。根據(jù)其橫切面的形狀可以分為馬蹄形、新月形以及橢圓形。斜切面可見軸絲偏向一邊，同時皮層微管不完整(圖1F、1H、1I)。

Ⅴ區(qū)：直徑小于350 nm，為精子的尾部(圖1A)。皮層微管仍然螺旋排列在外，一些橫切面上，軸絲偏向一邊，而另一些橫切面沒有見到軸絲，胞質(zhì)中的電子致密顆粒逐漸減少直至消失。還有一些橫切面可見由不連續(xù)皮層微管包圍的軸絲和完全裸露的軸絲(圖1G)?？v切面可見軸絲逐漸從皮層微管中游離出來。因此可以推斷精子軸絲在靠近精子尾端的過程中逐漸從胞質(zhì)中偏移，從而使軸絲裸露出來。

根據(jù)各區(qū)段的超微結(jié)構(gòu)特征，將有輪瑞利絳蟲R.cesticllus精子與已報道的7種戴維科絳蟲精子進行比較分析(表1)，精子頭部冠狀體的數(shù)目和旋轉(zhuǎn)角度可以將有輪瑞利絳蟲和其他7種戴維科絳蟲區(qū)分開來。除了有輪瑞利絳蟲和棘槽瑞利絳蟲R.echinobothrida具有1個冠狀體以外，其他6種戴維科絳蟲的精子均有2個冠狀體；而有輪瑞利絳蟲和棘槽瑞利絳蟲R.echinobothrida在冠狀體的旋轉(zhuǎn)角度上不同，分別是40°～55°和35°。

以精子各組成部分的微細結(jié)構(gòu)特征為基礎，初步構(gòu)建了有輪瑞利絳蟲成熟精子的結(jié)構(gòu)示意圖(圖2)，從圖2中可以看出，精子呈絲狀，從頭至尾5個區(qū)域區(qū)分明顯。

表1 戴維科絳蟲精子的超微結(jié)構(gòu)特征Tab.1 Ultrastructural characteristics of spermatozoons of Davaineidae cestodes

圖2 有輪瑞利絳蟲成熟精子的結(jié)構(gòu)示意圖

Fig.2 Schematic diagram of the structure of a mature spermatozoon ofRaillietinacesticllus

3 討論與結(jié)論

有輪瑞利絳蟲隸屬于圓葉目戴維科，其成熟精子具有絳蟲的共源性狀，比如缺乏線粒體，頭部具有冠狀體，軸絲結(jié)構(gòu)為“9+1”模式等。通過比較有輪瑞利絳蟲和其他已報道的7種戴維科絳蟲精子的主要特征，戴維科絳蟲精子的超微結(jié)構(gòu)特征可大致歸納如下：1) 精子一般可分為5個區(qū)域，頭部具有頂錐；2) 冠狀體數(shù)目1～2個，旋轉(zhuǎn)角度35°～55°；3) 具有圍軸鞘包圍軸絲，具有蛋白質(zhì)樣橫隔壁；4) 細胞核一般位于Ⅳ區(qū)，螺旋纏繞軸絲；5) 具有皮層微管，環(huán)繞精子縱軸螺旋排列于胞膜下方；6) 精子的Ⅰ區(qū)～Ⅱ區(qū)或Ⅲ區(qū)細胞質(zhì)中具有電子致密顆粒。冠狀體的存在標志著絳蟲精子的頭部位置，圓葉目絳蟲冠狀體的數(shù)目各科差異較大，如膜殼科 Hymenolepididae絳蟲精子的冠狀體數(shù)目較多，有8個或12個，而裸頭科 Anoplocephalidae絳蟲精子的冠狀體數(shù)目有1 、2 、5 、7 個不等[4]。戴維科絳蟲精子的冠狀體數(shù)目較穩(wěn)定，有輪瑞利絳蟲和棘槽瑞利絳蟲具有1個冠狀體，余下的戴維科絳蟲的精子具有2個冠狀體。有學者認為絳蟲精子的冠狀體數(shù)目有科屬的特異性[11]，如圓葉目復孔科Dipylidiidae、中絳科Mesocestoidae及帶科Taeniidae絳蟲精子的冠狀體數(shù)目僅為1個[4]。迄今，共發(fā)現(xiàn)19個絳蟲目[12]，其中12個目的絳蟲精子超微結(jié)構(gòu)見諸報端，更多的絳蟲精子結(jié)構(gòu)尚待研究，而伴隨著新的絳蟲精子超微結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的出現(xiàn)，以上各科絳蟲精子冠狀體數(shù)目亦可能會有新的發(fā)現(xiàn)，因上述觀點需要大量的精子數(shù)據(jù)將冠狀體數(shù)目與科屬一一對應。

絳蟲精子結(jié)構(gòu)中其他共源性狀還包括：圍軸鞘的有無，蛋白質(zhì)樣橫隔壁的有無，電子致密顆粒的有無及頂錐形態(tài)與后部結(jié)構(gòu)特征等。已報道的戴維科8種絳蟲的精子均同時具有圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁結(jié)構(gòu)，位置不同。本研究中有輪瑞利絳蟲精子的圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁同時從Ⅱ區(qū)開始出現(xiàn)，延續(xù)至Ⅳ區(qū)；微棘瑞利絳蟲精子的圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁位于Ⅱ～Ⅲ區(qū)[6]；維納哥瑞利絳蟲[8]與Paroniellareynoldsae絳蟲[10]精子的圍軸鞘開始出現(xiàn)于Ⅱ區(qū)，而蛋白質(zhì)樣橫隔壁始出現(xiàn)于Ⅲ區(qū)；比爾瑞利絳蟲、棘槽瑞利絳蟲和R.tuetensis精子的圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁開始出現(xiàn)于Ⅲ區(qū)[4-5, 7]。Justine[2]認為成熟絳蟲精子的圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁是一組相關性狀，如裸頭科擴張莫尼茨絳蟲精子的細胞質(zhì)中2種結(jié)構(gòu)均不存在[13]，然而圓葉目鏈帶科Catenotaeniidae細小鏈帶狀絳蟲Catenotaeniapusilla[14]、裸頭科球點狀斯泰爾斯絳蟲Stilesiaglobipunctata[15]、裸頭科絳蟲Mathevotaeniaherpestis[16]和四槽目四溝科 Tetrabothriidae絳蟲Tetrabothriuserostris[17]等的精子超微結(jié)構(gòu)僅有圍軸鞘而無蛋白質(zhì)樣橫隔壁。顯然圍軸鞘與蛋白質(zhì)樣橫隔壁是否伴隨著出現(xiàn)還有待進一步的研究。

有輪瑞利絳蟲精子的細胞質(zhì)中具有電子致密顆粒物質(zhì)，由于絳蟲精子不含線粒體，有學者認為是顆粒物質(zhì)或糖原顆粒，為精子的運動提供能源[9]。致密顆粒物質(zhì)的有無與圍軸鞘的存在有一定的關聯(lián)：Justine[2]和Ndiaye[18]指出當絳蟲精子細胞質(zhì)中含有顆粒物質(zhì)時，圍軸鞘缺失；相反，當顆粒物質(zhì)缺失時，圍軸鞘存在于細胞質(zhì)中。如擴張莫尼茨絳蟲的精子具有顆粒物質(zhì)，而圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁均缺失[13]；圓葉目帶科帶狀帶絳蟲Taeniataeniaeformis的精子具有圍軸鞘和蛋白質(zhì)樣橫隔壁，而細胞質(zhì)中無任何顆粒物質(zhì)存在[19]。然而，包括有輪瑞利絳蟲在內(nèi)的戴維科絳蟲精子的細胞質(zhì)中顆粒物質(zhì)與圍軸鞘同時存在；Marigo等[20]報道的圓葉目囊宮科Dilepididae粗頭節(jié)軟體帶絳蟲Molluscotaeniacrassiscolex的精子亦同時具有顆粒物質(zhì)和圍軸鞘。Miquel等[6]認為戴維科絳蟲精子里的顆粒物質(zhì)即糖原顆粒，而非Justine[2]所指的電子致密顆粒。為了更好地解釋這些顆粒物質(zhì)，需要細胞化學方法[3]等更多研究方法和更多的絳蟲精子超微結(jié)構(gòu)研究的數(shù)據(jù)。

本研究中有輪瑞利絳蟲精子的后端具有游離軸絲，即軸絲不是延伸至尾部末端，而是從精子尾部細胞質(zhì)中偏移出去變成游離的軸絲。在已有的戴維科瑞利屬絳蟲精子研究中，僅有棘槽瑞利屬絳蟲[5]精子的尾部也存在游離軸絲。此前Li等[13]在對擴展莫尼茨絳蟲的研究中首次發(fā)現(xiàn)了精子尾部的游離軸絲結(jié)構(gòu)。精子發(fā)生和精子超微結(jié)構(gòu)特征表明其對絳蟲系統(tǒng)發(fā)生的研究非常有意義，對于圓葉目絳蟲的發(fā)育生物學的研究和種類的鑒定需要進行更多更全面的精子超微結(jié)構(gòu)研究。

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【責任編輯 莊 延】

Ultrastructure of spermatozoon of Raillietina cesticillus (Cyclophylidea: Davaineidae)

SUN Yuan, ZENG Yao, YAN Baozuo, LI Haiyun

(College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To illustrate the ultrastructure of the spermatozoon ofRaillietinacesticllus. 【Method】Transmission electron microscope was used to observe the morphorlogy and structure of the spermatozoon ofR.cesticllusparasitized in chicken intestine.【Result】The spermatozoon ofR.cesticllusis filiform, tapers at both ends, has crested-like body and lacks the mitochondria. It has axonemes with the “9+1” pattern. Based on longitudinal sections ofR.cesticllusspermatozoon, five regions could be distinguished. RegionⅠcorresponds to the anterior extremity of the spermatozoon, having a crested-like body. RegionⅡ is characterized by the presence of cortical microtubules, a periaxonemal sheath and intracytoplasmic walls. Region Ⅲ has plenty of electro-dense granules. Region Ⅳ is characterized by the presence of the nucleus. RegionⅤcorresponds to the posterior end of the spermatozoon, having free flagellums. The spermatozoons ofR.cesticllusandR.echinobothridaeach has one crested-like body, while the spermatozoons of all other six reported davaineid cestode each has two crested-like bodies. The rotation angle of the crested-like body ofR.cesticllusis 40°to 55°, other than 35° forR.echinobothrida. 【Concluison】The number and rotation angle of the crested-like body of the spermatozoon head can descriminateR.cesticllusfrom other seven reported Davaineidae cestode.

Raillietinacesticillus; spermatozoon; ultrastructure; transmission electron microscope； crested-like body

2016- 09- 28 優(yōu)先出版時間：2017- 06-21

孫 媛(1980—)，女，講師，博士，E-mail:sunyuan@scau.edu.cn；通信作者:李海云(1966—)，女，教授，博士，E-mail:hyli@scau.edu.cn

國家自然科學基金(41106129)；廣東省自然科學基金(06025794)

Q954.61

A

1001- 411X(2017)04- 0057- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1924.020.html

孫 媛, 曾 瑤, 閆寶佐， 等.有輪瑞利絳蟲(圓葉目：戴維科)精子的超微結(jié)構(gòu)[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2017,38(4):57- 61.