訾永宏,李小寶,陳紅梅

(1延安大學(xué)附屬醫(yī)院普外科,延安 716000;2延安職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系;*通訊作者,E-mail:ziyonghong2016@163.com)

RNAi沉默Arl4c對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116增殖能力的影響

訾永宏1*,李小寶1,陳紅梅2

(1延安大學(xué)附屬醫(yī)院普外科,延安 716000;2延安職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系;*通訊作者,E-mail:ziyonghong2016@163.com)

目的 探討利用RNA干擾技術(shù)沉默Arl4c基因?qū)Y(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株增殖的影響。 方法 將Arl4c基因的si-RNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞,采用RT-PCR、Western blot鑒定干擾效果,以HCT116細(xì)胞沉默Arl4c基因組為實(shí)驗(yàn)組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞和空白的HCT116細(xì)胞為對(duì)照組,分別采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法、細(xì)胞倍增時(shí)間、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默Arl4c基因后,HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)速度、細(xì)胞周期、克隆形成能力的改變。 結(jié)果 沉默Arl4c基因后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯下降,G1期細(xì)胞增多、S期細(xì)胞減少,空白對(duì)照、空質(zhì)粒對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均倍增時(shí)間分別為(4.718±0.212)h,(4.981±0.24)h和(6.0±0.137)h;空白對(duì)照、空質(zhì)粒對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組平均細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為121±9.00，117±10.00和80±9.00。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照、空質(zhì)粒對(duì)照組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 Arl4c基因的沉默能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖,可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

RNA干擾; 基因沉默; Arl4c; 結(jié)腸癌; HCT116

結(jié)腸癌是胃腸道常見(jiàn)的腫瘤,嚴(yán)重危害著人類生命健康,隨著診斷技術(shù)及治療的進(jìn)步,5年生存率僅為50%。結(jié)腸癌的發(fā)生是多基因多階段的過(guò)程,現(xiàn)代靶向技術(shù)的不斷進(jìn)步,使得對(duì)結(jié)腸癌相關(guān)基因的探討變得更有意義[1]。ADP-核糖基化樣因子4C(ADP-ribosylation factor-like 4C,Arl4c)是Arl家族的成員,是ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor,Arf)的亞家族成員之一[2],在細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有重要作用。越來(lái)越多的研究表明,Arl4c與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3,4]。本實(shí)驗(yàn)前期也發(fā)現(xiàn)Arl4c在結(jié)腸癌中過(guò)表達(dá)[1],但其對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程中的具體作用目前還不十分清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討Arl4c對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116生物學(xué)表型的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑與儀器

HCT116細(xì)胞購(gòu)自中南大學(xué)細(xì)胞中心,由本課題組保存。0.25% Trypsino為長(zhǎng)沙研科生物科技有限公司產(chǎn)品(中國(guó)),RPMI1640培養(yǎng)基為Gibico公司產(chǎn)品(美國(guó)),新生小牛血清為Biology Industries公司產(chǎn)品(以色列),pGCsi/U6/GFP載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因有限公司,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,細(xì)胞培養(yǎng)板為Corning公司產(chǎn)品(美國(guó)),轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent為上海英維捷基貿(mào)易有限公司產(chǎn)品,Anti-Arl4c McAb、HRP-Rabbit anti Mouse IgG為上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司產(chǎn)品(中國(guó))。細(xì)胞培養(yǎng)箱為Thermor公司產(chǎn)品(美國(guó)),倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品(日本),酶標(biāo)儀為Bio-TK公司產(chǎn)品(美國(guó))。

1.2 pGC/U6/GFP/si-Arl4c重組載體構(gòu)建

從基因Bank中提取Arl4c基因(序列號(hào):NM_001282431),設(shè)計(jì)、合成Arl4c的干擾序列:5′-GGAGGTTCTTCTACTCGCC-3′,并定向克隆入pGCsi/U6/GFP載體,以空載體pGCsi/U6/GFP(Mock)為對(duì)照。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將待轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)其密度至80%左右,轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行:具體操作如下:將2 μl脂質(zhì)體2000加入48 μl無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基中輕輕混勻,37 ℃靜置5 min;在49 μl RPMI1640無(wú)血清培養(yǎng)基中分別加入1 μg重組質(zhì)粒pGC/U6/GFP/si-Arl4c和1 μg對(duì)照質(zhì)粒pGC/U6/GFP(Mock),輕輕混勻,室溫靜置5 min;將上述兩種混合液,輕輕混勻,37 ℃溫箱中孵育20 min;D-Hanks液將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗滌1次,加入450 μl無(wú)抗生素的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基,再加入含有重組質(zhì)粒的混合溶液,輕輕混勻,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h;棄上清,并換新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h,棄上清并傳代,加入含400 μg/ml G418的培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。

1.4 RT-PCR鑒定干擾效果

總RNA抽提及RT-PCR按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄按FERMENTAS公司的試劑盒說(shuō)明書操作。逆轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃ 60 min,70 ℃ 10 min,反應(yīng)終止后冰上冷卻,-20 ℃保存。PCR條件:95 ℃ 1 min預(yù)變性;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。其中人Arl4c的正向引物為:5′-CATCTACGTGGTGGACTCGG-3′,反向引物為:5′-TGAGGGACTTCCTGCGTTTC-3′,產(chǎn)物大小293 bp。其中人GAPDH的正向引物為:5′-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3′,反向引物為:5′-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3′,產(chǎn)物大小231 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 Western blot鑒定干擾效果

根據(jù)細(xì)胞蛋白提取說(shuō)明抽提細(xì)胞蛋白質(zhì)。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,分別制備濃度為10%的分離膠和濃度為5%濃縮膠;各取50 μg蛋白樣品,按比例加入適量5%的巰基乙醇,100 ℃煮沸變性5 min。電泳:初始電壓60 V,約30 min,將電壓調(diào)至100 V,約2 h;轉(zhuǎn)膜:100 V轉(zhuǎn)膜約1 h。轉(zhuǎn)膜完成后,NC膜用含5%的脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜。封閉后的NC膜經(jīng)PBST洗板3次×5 min,加入含1 ∶400的Anti-Arl4c McAb,搖床上室溫反應(yīng)2 h,將膜取出PBST洗3次×5 min,加1 ∶3 000稀釋的兔抗小鼠HRP-Rabbit anti Mouse IgG,搖床上室溫下避光反應(yīng)60 min;PBST洗板3次×5 min,暗室曝光、顯影、定影,掃描。

1.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

以Arl4c基因沉默組的HCT116細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞和空白的HCT116細(xì)胞為對(duì)照組,每組細(xì)胞均按5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h;每孔再加入MTT至終濃度為5 g/L,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄上清,加入DMSO 200 μl;待藍(lán)紫色結(jié)晶顆粒充分溶解后,測(cè)OD490值。然后以O(shè)D值為縱軸,時(shí)間為橫軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。

1.7 細(xì)胞倍增時(shí)間測(cè)定

以Arl4c基因沉默組的HCT116細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞和空白的HCT116細(xì)胞為對(duì)照組,每組細(xì)胞均按103/孔接種于24孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h;用胰酶消化并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算每組細(xì)胞的平均倍增時(shí)間。倍增時(shí)間公式如下:TD=t[lg2/(lgNt-lgN0)],其中,TD為細(xì)胞倍增時(shí)間;t為培養(yǎng)時(shí)間;N0,Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時(shí)的細(xì)胞數(shù)。

1.8 平板克隆形成能力測(cè)定

以Arl4c基因沉默組的HCT116細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞和空白的HCT116細(xì)胞為對(duì)照組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種6孔板,每孔加入1 000個(gè)細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2周;棄上清,PBS洗板2次,甲醇固定15 min;Giemsa染色15 min,水洗,空氣干燥;顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù),細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的計(jì)數(shù)為1個(gè)克隆數(shù)。每個(gè)濃度組細(xì)胞均設(shè)3個(gè)平行樣,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均克隆形成數(shù)。

1.9 細(xì)胞周期的測(cè)定

以Arl4c基因沉默組的HCT116細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞和空白的HCT116細(xì)胞為對(duì)照組,每組細(xì)胞均按5×l03接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,貼壁后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次,再用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h;胰酶消化,離心收集細(xì)胞,PBS洗2次,PI染色30 min,流式細(xì)胞儀分析,并按以下公式計(jì)算其增殖指數(shù)(proliferative index,PI)。公式為PI=(G2M+S)/(G0/1+S+G2M)×l00%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HCT116/si-Arl4c、HCT116/si-M細(xì)胞系的構(gòu)建

結(jié)果顯示,Arl4c mRNA在HCT116/pGC/U6/GFP/si-Arl4c細(xì)胞中表達(dá)明顯降低,而在HCT116和HCT116/pGC/U6/GFP細(xì)胞的Arl4c mRNA水平變化不明顯,分別將HCT116/pGC/U6/GFP/si-Arl4c和HCT116/pGC/U6/GFP細(xì)胞系命名為HCT116/si-Arl4c和HCT116/si-M(見(jiàn)圖1A)。進(jìn)一步采用Western blot方法分別檢測(cè)HCT116,HCT116/si-Arl4c和HCT116/si-M細(xì)胞中Arl4c蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,Arl4c蛋白在HCT116/si-Arl4c細(xì)胞中表達(dá)明顯降低(見(jiàn)圖1B),結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相一致。成功建立沉默Arl4c的細(xì)胞系,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

以Arl4c基因沉默組的HCT116細(xì)胞(HCT116/si-Arl4c)為實(shí)驗(yàn)組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞(HCT116/si-M)和空白的HCT116細(xì)胞為對(duì)照組,用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其生長(zhǎng)速度。結(jié)果表明,與對(duì)照組細(xì)胞HCT116、HCT116/si-M相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞HCT116/si-Arl4c的生長(zhǎng)速度明顯下降(見(jiàn)圖2)。

2.3 細(xì)胞倍增時(shí)間

HCT116、HCT116/si-M和HCT116/si-Arl4c細(xì)胞平均倍增時(shí)間為分別為(4.718±0.212)h、(4.981±0.24)h和(6.0±0.137)h,與對(duì)照組HCT116、HCT116/si-M細(xì)胞相比,沉默Arl4c基因后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng),與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

1.HCT116細(xì)胞;2.HCT116/si-M細(xì)胞;3.HCT116/si-Arl4c細(xì)胞圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGC/U6/GFP/si-Arl4c和pGC/U6/GFP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Identification of cells with stable transfection of pGC/U6/GFP/si-Arl4c and pGC/U6/GFP by RT-PCR and Western blot

圖2 MTT法檢測(cè)Arl4c沉默組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Figure 2 Cell proliferation curve of HCT116 with or without Arl4c silencing by MTT assay

與HCT116和HCT116/si-M比較,*P<0.05圖3 沉默Arl4c基因后HCT116細(xì)胞的平均倍增時(shí)間Figure 3 The cells double times of HCT116 with or without Arl4c knockdown

2.4 克隆形成能力

結(jié)果顯示:HCT116、HCT116/si-M、HCT116/si-Arl4c細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為121±9.00，117±10.00、80±9.00,沉默Arl4c基因后,明顯減弱了HCT116細(xì)胞的克隆形成能力,與對(duì)照組HCT116、HCT116/si-M比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

圖4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Results of colony formation

2.5 細(xì)胞周期的分布

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組HCT116/si-Arl4c細(xì)胞與對(duì)照組HCT116、HCT116/si-M相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞HCT116/si-Arl4c G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少(見(jiàn)圖5,6),其結(jié)果與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)相一致。

圖5 Arl4c基因沉默后HCT116細(xì)胞周期檢測(cè)Figure 5 Changes of cells cycle of HCT116 after Arl4c gene silencing

圖6 Arl4c沉默后HCT116細(xì)胞的周期分布Figure 6 Distribution of cell cycle of HCT116 cells after Arl4c gene silencing

3 討論

Arl4c也稱為Arl7,是含有192個(gè)氨基酸的屬于小GTP酶的蛋白[5]。Arl4c是Arf和Arl家族成員中特殊的成員,其特殊性在于其是唯一mRNA表達(dá)由肝臟X受體-類視黃醇X受體激動(dòng)劑或人巨噬細(xì)胞中的膽固醇負(fù)載誘導(dǎo),Arl4c可能在AI(apoA-I)依賴性膽固醇分泌過(guò)程中起作用并且可以通過(guò)與微管的相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)水泡運(yùn)輸[6]。Arl4c蛋白在其C-末端含有核定位信號(hào),在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中都可以存在,其功能和定位取決于它們受控的GTP的結(jié)合和水解[7]。研究顯示Arl4c可能在膽固醇代謝紊亂中起著重要的作用[8]。

前期研究發(fā)現(xiàn)Arl4c在結(jié)腸癌組織中高表達(dá),在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中高表達(dá),且Arl4c的表達(dá)在結(jié)腸癌不同性別、不同年齡、不同臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而在不同病理分化的患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4],這提示Arl4c可能在結(jié)腸癌的發(fā)生及早期發(fā)展中起到重要作用。因此,本研究利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)特異性地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HTC116中Arl4c基因的表達(dá),通過(guò)MTT、細(xì)胞倍增時(shí)間、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)研究Arl4c對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HTC116增殖的影響,結(jié)果Arl4c表達(dá)的降低能明顯地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HTC116的增殖,減弱結(jié)腸癌細(xì)胞HTC116的克隆形成能力,這說(shuō)明Arl4c在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。Fujii等[3]研究顯示Arl4c在肺癌中高表達(dá),而在正常肺組織中未見(jiàn)表達(dá),認(rèn)為Arl4c參與肺癌的發(fā)生,并且可能用于抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的新的靶向治療,同時(shí)認(rèn)為Arl4c表達(dá)的增加是由于APC、β-連環(huán)蛋白及Ras的遺傳改變,使得Wnt和EGF信號(hào)通路被活化,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。由于Wnt/β-catenin和EGF/Ras信號(hào)通路的改變引起Arl4c表達(dá)異常導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Arl4c在肺腫瘤和舌腫瘤樣本中高表達(dá),而在相對(duì)應(yīng)的非腫瘤樣本中不表達(dá),且腫瘤樣本中Arl4c基因3′端非翻譯區(qū)DNA甲基化現(xiàn)象明顯減弱。10-11易位甲基胞嘧啶雙加氧酶(TET)可介導(dǎo)DNA去甲基化,在肺癌細(xì)胞NCI-H520中高表達(dá),敲除NCI-H520細(xì)胞中TET基因可減少5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)的表達(dá)水平,并且促進(jìn)3′端非翻譯區(qū)DNA甲基化,降低Arl4c的表達(dá),同時(shí)減弱了Arl4c介導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力[9]。這說(shuō)明Arl4c與腫瘤細(xì)胞的功能密切相關(guān)。Arend等[10]研究認(rèn)為Ar14c是通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白通路參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,這一轉(zhuǎn)化途徑是腫瘤發(fā)生的起始事件。

總之,干擾Arl4c基因表達(dá)可引起結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯,從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖倍增能力的降低,提示Arl4c在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,這為以Arl4c為靶點(diǎn)的結(jié)腸癌的診斷及治療提供理論依據(jù)及靶向策略。

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Effect of Arl4c gene silencing by RNA interference on cell proliferation of colon cancer cell line HCT116

ZI Yonghong1*,LI Xiaobao1,CHEN Hongmei2(1

DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity,Yan’an716000,China;2DepartmentofMedicine,Yan’anVocationalandTechnicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:ziyonghong2016@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of RNA interference-mediated gene silence of Arl4c on the proliferation of colon cancer cell line HCT116.MethodsColon cancer cell line HCT116 was transfected with Arl4c small interfering RNA(siRNA), and then the expression of Arl4c was determined by RT-PCR and Western blot. HCT116 cells after Arl4c gene knockdown were chosen as experimental group, and HCT116 cells transfected with empty plasmid transfection and HCT116 cells were chosen as control groups. Then the proli-feration of HCT116 was examined by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) assay, the cell doubling time of HCT116 was examined by double time assay, the colony formation ability of HCT116 was examined by colony formation assay, and the cell cycles of HCT116 were examined by flow cytometry assay.ResultsCompared with the blank control group and empty plasmid control group, the growth ability in experimental group was significantly decreased,G1phase cells increased, and S phase cells decreased. The doubling time in blank control group,empty plasmid group and experimental group was (4.718±0.212)h,(4.981±0.24)h,(6.0±0.137)h. The colony number was 121±9.00 in blank control group,117±10.00 in empty plasmid control group, and 80±9.00 in experimental group, and there was significant difference between control groups and experimental group(P<0.05).ConclusionArl4c gene silencing by RNAi can suppress the proliferation of colon cancer cell line HCT116, and it may be involved in colon cancer progression.

RNA interference; gene silencing; Arl4c; colon cancer; HCT116

訾永宏,男,1982-02生,學(xué)士,主治醫(yī)師.E-mail:ziyonghong2016@163.com

2017-03-29

R735.35

A

1007-6611(2017)07-0676-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.008