石 斌，劉建枝*，朱傳剛，劉金明，夏晨陽，李 浩，陸 珂，唐文強，邊 吉，索朗曲珍，白瑪珠莎，次 珍

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009；2.中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.西藏拉薩市尼木縣農(nóng)牧局獸醫(yī)站，西藏 拉薩 851300；4.西藏拉薩市當雄縣當曲卡鎮(zhèn)獸防所，西藏 拉薩 851500；5.西藏拉薩市當雄縣公塘鄉(xiāng)獸防所，西藏 拉薩 851500)

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西藏尼木山羊自然感染東畢吸蟲沉積蟲卵分布與病理情況調(diào)查

石 斌1，劉建枝1*，朱傳剛2*，劉金明2，夏晨陽1，李 浩2，陸 珂2，唐文強1，邊 吉3，索朗曲珍4，白瑪珠莎5，次 珍5

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009；2.中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.西藏拉薩市尼木縣農(nóng)牧局獸醫(yī)站，西藏 拉薩 851300；4.西藏拉薩市當雄縣當曲卡鎮(zhèn)獸防所，西藏 拉薩 851500；5.西藏拉薩市當雄縣公塘鄉(xiāng)獸防所，西藏 拉薩 851500)

【目的】研究西藏尼木縣自然感染東畢吸蟲山羊，蟲卵在臟器中的分布與病理變化情況?！痉椒ā拷馄首匀环拍恋臇|畢吸蟲陽性山羊，采集臟器(十二指腸、小腸上段、小腸中段、小腸下段、盲腸、結(jié)腸、直腸)顯微鏡下蟲卵計數(shù)并觀察病理變化?！窘Y(jié)果】山羊自然感染東畢吸蟲數(shù)量為1435±231.5，在臟器中，小腸中段的EPG最高，其次為盲腸和十二指腸，東畢吸蟲蟲卵在各臟器中的分布百分比是：十二指腸(3.50 %)、小腸上段(12.57 %)、小腸中段(56.41 %)、小腸下段(0.52 %)、盲腸(18.83 %)、結(jié)腸(0.00 %)、直腸(0.01 %)、肝臟(8.16 %)、脾臟(0.00 %)，小腸中段沉積的蟲卵數(shù)與其他各組織相比差異極顯著(P<0.01)。小腸部分沉積蟲卵數(shù)(73.00 %)明顯高于大腸部分的蟲卵沉積數(shù)(18.84 %)，差異極顯著(P<0.01)。病理組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)小腸中段有大量蟲卵肉芽結(jié)節(jié)，小腸粘膜發(fā)生炎癥和輕度壞死。【結(jié)論】山羊感染東畢吸蟲后不同的臟器沉積蟲卵的密度和數(shù)量不同，蟲卵計數(shù)與病理切片觀察結(jié)果相關(guān)。

西藏；山羊；東畢吸蟲；蟲卵分布；病理切片

【研究意義】東畢吸蟲病是由東畢屬(Orientobilharzia)的幾種吸蟲寄生于牛羊等哺乳動物的門靜脈系統(tǒng)和腸系膜靜脈內(nèi)引起的一種寄生蟲病。成蟲、幼蟲以及蟲卵都可以對宿主產(chǎn)生一系列的損傷，嚴重時還可引起牛羊的大批死亡，嚴重威脅畜牧業(yè)的健康發(fā)展，同時，東畢吸蟲尾蚴還能引起人的尾蚴性皮炎，對疫區(qū)周圍生活的人群身體健康構(gòu)成嚴重威脅，是一種嚴重的人畜共患寄生蟲病[1]。該病呈世界性分布，印度、哈薩克斯坦、俄羅斯和法國等國都有發(fā)生[2]，在我國，東畢吸蟲分布十分廣泛，全國20多個省、市、自治區(qū)有此病發(fā)生，東北、內(nèi)蒙、西北、西南等地尤為嚴重[3]。【前人研究進展】目前，對東畢吸蟲的研究主要集中于病原形態(tài)及分子生物學(xué)和流行病學(xué)研究，崔海，譚詩文[4-5]等就東畢吸蟲蟲體造成的大體病理變化做過研究，區(qū)內(nèi)劉建枝等[6]報導(dǎo)尼木縣發(fā)現(xiàn)有東畢吸蟲，但尚未有對蟲卵危害的病理報導(dǎo)?！颈狙芯康那腥朦c】東畢吸蟲蟲卵是東畢吸蟲病傳播的首要條件，也是造成宿主機能損害的重要因素。東畢吸蟲與日本血吸蟲同屬分體科，在日本血吸蟲蟲卵引起的病變最嚴重，對宿主產(chǎn)生的危害最大[7]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文通過研究蟲卵在山羊臟器中的分布情況和組織病變，有助于明確東畢吸蟲蟲卵對宿主主要臟器危害和病理變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物:對西藏尼木縣自然放牧的山羊進行糞孵檢測，購買東畢吸蟲陽性山羊3只，約14月齡，體重在8～10 kg左右。

1.2 方法

1.2.1 蟲體收集 解剖山羊，腹主動脈灌注沖蟲，在肝門處用200目篩網(wǎng)收集蟲體，計數(shù)。

1.2.2 臟器采集和處理 剝離臟器表面的筋膜和網(wǎng)膜以及脂肪血管等，用生理鹽水沖出腸內(nèi)容物后將肝臟、小腸、大腸和脾臟各臟器分開；小腸部分將十二指腸分離，空腸和回腸從前到后均勻分作3段；盲腸、結(jié)腸、直腸分別分離，各段分別稱重后分別于對應(yīng)的平皿中用載玻片刮取全部腸粘膜；肝臟和脾臟分別稱重后從背緣、中間、腹緣3個位置取樣，取樣后分別合并稱重。

1.2.3 蟲卵計數(shù) 將腸粘膜裝進50 mL離心管中，加蒸餾水定容至20 mL，再加入10 %NaOH 20 mL,于恒溫水浴鍋內(nèi)45 ℃水浴30 min，期間多次震蕩搖勻，3500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀加蒸餾水定容，搖勻后取100 μl鏡檢，計算蟲卵數(shù)量，每樣計數(shù)3次。肝臟和脾臟樣品加入定量蒸餾水后勻漿機攪碎，取20 mL加入10 %NaOH 20 mL,處理和取樣鏡檢計數(shù)蟲卵步驟同前。根據(jù)鏡檢蟲卵數(shù)，計算各器官組織含蟲卵總量、克組織蟲卵量(EPG)和蟲卵數(shù)量百分比。

1.2.4 組織切片制備和鏡檢 十二指腸、小腸上段、中段、下段，盲腸、結(jié)腸、直腸、肝臟和脾臟分別取樣，修整，10 %甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色和Masson染色，鏡檢、拍照，于顯微鏡下觀察并拍照，記錄組織病理形態(tài)學(xué)變化及膠原的分布。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件One-Way ANOVA進行方差分析和LSD法多重比較，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，檢驗誤差為5 %和1 %。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲體計數(shù)

腹主動脈灌注沖蟲法檢測自然感染東畢吸蟲的尼木山羊載蟲量，腸系膜靜脈和肝門靜脈共沖出1435±231.46條東畢吸蟲，其中載蟲量最多的有1680條蟲。

2.2 蟲卵計數(shù)

蟲卵在臟器中的分布以小腸部位最多(表1)，其中小腸中段蟲卵數(shù)量占總蟲卵數(shù)的比重最大，達到56.41 %；其次是盲腸(18.83 %)和小腸上段(12.57 %)，十二指腸蟲卵數(shù)量較少(3.50 %)，小腸下段、結(jié)腸及直腸蟲卵很少，分別為0.52 %、0和0.01 %；肝臟蟲卵數(shù)量較少，占比(8.16 %)；脾臟未發(fā)現(xiàn)蟲卵(0 %)。小腸部分沉積蟲卵數(shù)(73.00 %)明顯高于大腸部分的蟲卵沉積數(shù)(18.84 %)。臟器中小腸中段沉積蟲卵最多，每克組織的蟲卵量也最高，其次是盲腸和小腸上段及肝臟，十二指腸雖然蟲卵總數(shù)占比不高，但EPG值卻是盲腸的2.24倍，低于小腸中段的EPG值。

2.3 病理切片觀察

蟲卵計數(shù)與病理切片觀察結(jié)果相關(guān)，組織沉積蟲卵數(shù)越多病理損害越嚴重。組織切片HE染色，結(jié)果顯示，細胞核清楚，藍紫色，蟲卵結(jié)節(jié)中心呈紅色，結(jié)節(jié)邊緣明顯的紅色環(huán)狀圈。Masson染色顯示蟲卵結(jié)節(jié)中心呈藍色，蟲卵結(jié)節(jié)周圍呈明顯的藍色環(huán)狀圈。蟲卵沉積導(dǎo)致蟲卵結(jié)節(jié)周圍組織增生，膠原纖維化明顯(圖版I，封三)。

表1 各組織東畢吸蟲蟲卵沉積數(shù)及差異性比較

注：同一列中右上角標有不同大寫字母的數(shù)據(jù)之間差異極其顯著，同一列中右上角標有相同大寫字母的數(shù)據(jù)之間差異不顯著(P>0.05)。 Note：The difference between data with the different capital letters is very significant(P<0.01), with the same capital letters show not significant (P>0.05).

小腸中部發(fā)現(xiàn)的蟲卵肉芽結(jié)節(jié)最多，主要分布于黏膜和黏膜下層，對該段組織損害最為嚴重，蟲卵周圍炎性細胞聚集，局灶性壞死，黏膜層蟲卵沉積處柱狀細胞脫落，黏膜形態(tài)與無蟲卵部位比較變化明顯，腸絨毛較無蟲卵沉積處減少。十二指腸發(fā)現(xiàn)大量的蟲卵結(jié)節(jié)，肉芽組織增生明顯，蟲卵沉積處組織纖維化明顯，部分腸粘膜上皮細胞壞死脫落。小腸上段發(fā)現(xiàn)的蟲卵較十二指腸少，病理損害也次之。小腸下段發(fā)現(xiàn)少量沉積蟲卵，管壁結(jié)構(gòu)基本正常，壞死不明顯，黏膜未發(fā)現(xiàn)明顯變化。盲腸沉積蟲卵較多，腸粘膜損害嚴重。結(jié)腸和直腸結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)沉積蟲卵；肝臟發(fā)現(xiàn)少量蟲卵結(jié)節(jié)，形似結(jié)核性肉芽腫，結(jié)節(jié)周圍有炎性細胞聚集，但未產(chǎn)生明顯壞死，肝小葉輪廓較完整，肝板清晰，肝竇內(nèi)無明顯淤血，門管區(qū)正常。脾臟切片顯示基本構(gòu)造正常，未發(fā)現(xiàn)蟲卵沉積。

3 討 論

東畢吸蟲的成蟲主要寄生于動物的門靜脈系統(tǒng)和腸系膜靜脈，并于血管內(nèi)產(chǎn)卵，蟲卵隨血液循環(huán)沉積于動物各組織器官。本次實驗首先對自然感染東畢吸蟲山羊的感染強度進行了調(diào)查，采用解剖后腹主動脈灌注沖蟲法將山羊體內(nèi)東畢吸蟲全部沖出，蟲體完整，無破損。檢查腸系膜等處血管，無蟲體殘留，是東畢吸蟲最佳收集方法。大量的蟲體寄生，也顯示當?shù)氐母腥緲O其嚴重，這和當?shù)氐淖匀画h(huán)境一致。

山羊體內(nèi)東畢吸蟲的蟲卵分布具有該蟲種的特點。山羊臟器蟲卵調(diào)查發(fā)現(xiàn)，以小腸中段沉積蟲卵最多，每克組織的蟲卵量也最高，其次是盲腸和小腸上段及肝臟，十二指腸雖然蟲卵總數(shù)占比不高，但EPG值卻是盲腸的2.24倍，只低于小腸中段的EPG值。許瑞[8]等報道日本血吸蟲蟲卵在BLBA/c鼠各組織中的分布中肝臟中的沉積蟲卵最多(59.64 %)，其次是盲結(jié)腸(17.48 %)，而小腸部位沉積蟲卵相對較少。趙登云[9]等對感染日本血吸蟲的實驗兔的調(diào)查發(fā)現(xiàn)感染42 d時，沉積蟲卵主要在肝臟；感染60 d時，肝臟的蟲卵量依然最高，直腸的蟲卵數(shù)有所上升，但無論是42 d還是60 d的實驗兔小腸的蟲卵總是最少的。由此看來，雖然東畢吸蟲與日本血吸蟲同屬分體科，生活史基本相似，感染方式也一致[10]，但蟲卵在動物體內(nèi)的分布差異卻較大，產(chǎn)生這一差異的主要原因可能在蟲種的不同，包括蟲種的寄生部位和蟲卵的特征；其次，實驗動物類型及感染時間等可能對蟲卵的分布有一定關(guān)系，這需要進一步試驗驗證。

東畢吸蟲蟲卵也是引起宿主病理反應(yīng)的主要致病因子。調(diào)查發(fā)現(xiàn)山羊各部位蟲卵EPG值和病理切片觀察的病理變化結(jié)果一致，EPG越高，病理損壞也越嚴重。東畢吸蟲感染損害嚴重的部位主要集中于十二指腸至小腸下段上部及盲腸，這些部位也是蟲卵集中的部位；東畢吸蟲蟲卵引起腸壁病變的組織結(jié)構(gòu)也基本一致，即圍繞蟲卵出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和膠原增多。而日本血吸蟲蟲卵引起的腸壁損傷部位主要是在盲腸、結(jié)腸和直腸，兩者都和各自的蟲卵分布相關(guān)[8-9]，兩者差異顯著。此外，東畢吸蟲蟲卵在肝臟的EPG并不高，病理切片也顯示肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰、完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細胞大小正常，無變性和壞死，僅在蟲卵部位有少量炎癥細胞浸潤，這和日本血吸蟲感染引起的病理損壞明顯不同。無論是小鼠還是實驗兔[8-9]，日本血吸蟲感染都表現(xiàn)出肝竇充血，急性蟲卵肉芽腫形成，蟲卵肉芽腫周圍各種炎性細胞浸潤，尤其在肝小葉間靜脈內(nèi)有大量蟲卵充斥而引起血管明顯充血擴大，部分肝細胞變性、壞死[11]。病理損害的不同在于2個蟲種的蟲卵具有各自不同的分布特征。

Ito[12]關(guān)于日本血吸蟲感染的實驗兔和實驗鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)蟲卵引起的損害主要位于十二指腸下段至空腸上部，其他部位少見。本次實驗揭示自然感染東畢吸蟲山羊，蟲卵主要沉積于小腸部位，產(chǎn)生的病理損害也主要集中于小腸部分，這與Ito報道一致。

4 結(jié) 論

本次試驗首次揭示了西藏尼木自然感染東畢吸蟲山羊，蟲卵體內(nèi)分布與病理損害情況，豐富了東畢吸蟲的研究，明確東畢吸蟲蟲卵在山羊體內(nèi)的分布規(guī)律、主要寄生部位等，為下一步研究提供參考。

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(責任編輯 陳 虹)

Survey of Distribution of Deposited Eggs and Pathological Conditions of Goat Naturally Infected withOrientobilharziain Nimu County of Tibets

SHI Bin1,LIU Jian-zhi1*, ZHU Chuan-gang2*,LIU Jin-ming2,XIA Chen-yang1,LI Hao2,LU Ke2,TANG Wen-qiang1, BIAN Ji3, Suolangquzhen4,Baimazhusha5,Cizhen5

(1.Institute of Animal Science,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Tibet Lhasa 850009, China;2.Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai 200241,China;3.Veterinary Station of Nimu County Agriculture and Animal Husbandry Bureau,Tibet Lhasa 851300,China;4.Dangquka Animal Prevention Institute located in Damxung County,Tibet Lhasa 851500,China;5.Gongtang Animal Prevention Institute located in Damxung County,Tibet Lhasa 851500,China)

【Objective】 The study aims to study the distribution characteristics of deposited eggs and pathological changes in the viscera of goat naturally infected withOrientobilharzia. 【Methods】Goat naturally infected withOrientobilharziain Nimu county of Tibet were sacri?ced and the number of worms were counted. Meanwhile, the goat’s livers, spleens and intestines (duodenum, the upper, middle and lower section of the small intestine, cecum, colon, and rectums) were separated to observe the egg and pathological change under microscope. 【Results】There were 1435±231.5 adult worms found in the naturally infected goat. Among all the viscera observed，the middle small intestine had the largest number of eggs per gram, followed by those in duodenum and in cecum. The percentage of eggs deposited were: duodenum (3.50 %), the upper small intestine (12.57 %), the middle small intestine (56.41 %), the lower small intestine (0.52 %), cecum (18.83 %), colon (0.00 %), rectum (0.01 %), liver(8.16 %) and spleen (0.00 %). There was significant difference of egg number between the middle section of small intestine and the others viscera(P<0.01), and the totally egg number in small intestine (73.00 %) was obviously the largest in all observed viscera. Tissue pathological observation showed that there were lots of egg granuloma nodule in the middle small intestine, which accompanied by mucosal inflamed and mild necrosis. 【Conclusion】The amount and the density of deposited eggs ofOrientobilharziain the viscera of infected goat are different, and the pathogenesis was correlated with the deposition of eggs.

Tibet; Goat;Orientobilharzia; Distribution of eggs; Pathological section

1001-4829(2017)6-1458-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.037

2016-06-07

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303037)；2016年度西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2016ZR-NK-06)

石 斌(1991-)，男，研究實習(xí)員，主要從事家畜寄生蟲病研究，E-mail：18989902737@163.com，*為通訊作者：劉建枝(1964-)，女，副研究員，研究方向為西藏家畜寄生蟲病防控，E-mail：13659526886@163.com，朱傳剛(1966-)，男，博士，副研究員，主要從事血吸蟲的分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因血吸蟲以及免疫預(yù)防等方面研究。

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