姜天翔++任華峰++陳進(jìn)斌++苗英霞++邱金泉++王靜

摘要：從渤海某海水養(yǎng)殖場（北美白對蝦）底泥中分離到1株耐鹽高效好氧反硝化細(xì)菌MCW148，經(jīng)過對其形態(tài)特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，將該菌株初步鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。進(jìn)一步研究表明，菌株MCW148的最適碳源為葡萄糖，最適培養(yǎng)溫度為35 ℃，最適pH為6。在最適條件下，菌株MCW148在12 h對NO3--N的去除率為62.4%。

關(guān)鍵詞：好氧反硝化菌；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；脫氮；耐鹽

中圖分類號：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2442-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.011

Isolation and Identification of a Salt-tolerant and Aerobic Denitrification Bacterial Strain MCW148 and Its Denitrification Characterization

JIANG Tian-xiang， REN Hua-feng， CHEN Jin-bin， MIAO Ying-xia， QIU Jin-quan， WANG Jing

（The Institute of Seawater Desalination and Multipurpose Utilization， State Oceanic Administratrion，

Peoples Republic of China， Tianjin 300192， China）

Abstract： A aerobic denitrification bacterial strain MCW148 with salt-tolerance and high denitrification ability was isolated from sediment of shrimp pond in the Bohai Sea. Results indicated this strain was identified as Bacillus megaterium according to its morphology， biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis. Further study indicated the optimal carbon was glucose， and the optimal pH and temperature for cell growth and denitrification were 6.0 and 35 ℃， respectively. And the NO3--N removal rate of the strain MCW148 was 62.4% in the optimal conditions for 12 h.

Key words： aerobic denitrification bacteria； Bacillus megaterium； denitrification； salt tolerance

中國是世界上海水養(yǎng)殖發(fā)達(dá)的國家，養(yǎng)殖面積和總產(chǎn)量均居世界首位。海水養(yǎng)殖正成為中國近岸海域的重要污染源。以養(yǎng)蝦為例，即使是管理最好的養(yǎng)蝦場，也有30%的餌料未被攝食，殘餌溶生的氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)是蝦池及其鄰近淺海的主要污染源。在高密度的水產(chǎn)養(yǎng)殖體系中，飼料中75%～80%的氮會進(jìn)入養(yǎng)殖水體中，并以氨氮、亞硝酸鹽氮的形式出現(xiàn)不同程度的累積，對水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物造成危害，從而限制了海水養(yǎng)殖的單位產(chǎn)量，并且其排放的廢水中也含有豐富的含氮化合物，會加快海水富營養(yǎng)化，造成赤潮災(zāi)害，給近岸海洋生態(tài)環(huán)境帶來了危害[1]。因此，研究快速消除養(yǎng)殖環(huán)境中有機(jī)污染的方法，以盡快恢復(fù)和優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，對中國海水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展以及灘涂和淺海資源的可持續(xù)利用具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。自從第一株好氧反硝化菌在1984年首次發(fā)現(xiàn)[2]以來，國內(nèi)外陸續(xù)有大量菌株被分離出來[3-8]。好氧反硝化菌是一類能在好氧或兼氧條件下進(jìn)行反硝化的細(xì)菌，它的存在使得硝化過程和反硝化過程得以在一個(gè)反應(yīng)器中同步進(jìn)行，硝化反應(yīng)的產(chǎn)物可成為反硝化反應(yīng)的底物，加快了反應(yīng)速度，降低了運(yùn)行成本，同時(shí)反硝化反應(yīng)釋放的OH-會補(bǔ)償硝化反應(yīng)消耗的堿，避免酸性物質(zhì)的積累，維持系統(tǒng)pH的穩(wěn)定[8，9]。本試驗(yàn)主要對1株耐鹽好氧反硝化細(xì)菌MCW148進(jìn)行了鑒定，研究了該菌株高效代謝硝酸鹽氮的生理生化特性，及其最佳培養(yǎng)條件和生長特性，為好氧反硝化菌在海水養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種富集、分離純化和培養(yǎng)基組成[4]

稱取1 g樣品放入裝有9 mL無菌水的試管中，80 ℃水浴20 min，充分振蕩混勻，取1 mL 到下一個(gè)同樣的試管中，依次稀釋得到各種濃度的菌懸液。分別取10-5～10-7 3個(gè)稀釋梯度的稀釋液0.1 mL涂布于NA平板上，然后倒置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取不同形態(tài)的單菌落轉(zhuǎn)接至NA斜面上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ羧【渫瑫r(shí)在NA培養(yǎng)基平板上劃線檢驗(yàn)純度。

菌株分離培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL。

硝酸鹽還原產(chǎn)氣培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，KNO3 1.0 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，CaCl2 0.2 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，（NH4）2SO4 2.0 g，KCl 0.2 g，乙酸鈉 3.32 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL。

反硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KNO3 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，葡萄糖 10.0 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL。

1.2 反硝化性能測定

250 mL三角瓶中加入100 mL反硝化性能測定培養(yǎng)液，滅菌后加入1 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，置于120 r/min、30 ℃下培養(yǎng)，每3 h取樣測定培養(yǎng)基中的NO3--N、NO2--N濃度和細(xì)菌生長量（以吸光度OD600 nm表示）。

1.3 菌株的鑒定

菌落形態(tài)及生理生化鑒定：30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色、碳源利用等生理生化指標(biāo)測定參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行。

16S rDNA PCR擴(kuò)增和序列測定：將菌株保存至平板中，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序和分析。

1.4 菌株生長條件及脫氮特性

1.4.1 最適碳源 分別以葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、檸檬酸鈉為碳源，貧營養(yǎng)反硝化性能測定培養(yǎng)基中的其他成分不變，滅菌后按照1%的量加培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，然后置于120 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48 h取樣測定培養(yǎng)基中的NO3--N、NO2--N濃度，計(jì)算其去除率。

1.4.2 最適溫度 以葡萄糖為碳源，配制化學(xué)需氧量（COD）為200 mg/L、NO3--N質(zhì)量濃度為10 mg/L的貧營養(yǎng)反硝化性能測定培養(yǎng)基，滅菌后按照1%的量加培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，分別置于15、20、25、30、35、40 ℃下，120 r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液中的NO3--N濃度，計(jì)算其去除率。

1.4.3 最適初始pH 培養(yǎng)溫度30 ℃，初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其他試驗(yàn)設(shè)計(jì)同“1.4.2”。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的富集培養(yǎng)及菌種的分離純化

污泥樣經(jīng)過3次富集培養(yǎng)后得到混合微生物的培養(yǎng)物，它可以在含有200 mg/L NO3--N的合成培養(yǎng)基（FM）中生長，在培養(yǎng)過程中通過測定培養(yǎng)液的OD600 nm和NO3--N的濃度，發(fā)現(xiàn)該混合培養(yǎng)液中的NO3--N含量不斷減少，而OD600 nm不斷上升，說明該混合液培養(yǎng)物具有很強(qiáng)的好氧反硝化能力。

上述混合培養(yǎng)物在對氯苯胺的BTB平板上進(jìn)行劃線分離，挑取單菌落，經(jīng)過復(fù)篩、純化后得到1株具有高效脫氮功能的耐鹽好氧反硝化細(xì)菌菌株MCW148。

2.2 MCW148菌株反硝化性能

通過實(shí)驗(yàn)室模擬養(yǎng)殖系統(tǒng)廢水的水質(zhì)（表1）分析，把MCW148菌株接種于NO3--N初始濃度為150 mg/L的合成培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定菌體生長、NO3--N和NO2--N的濃度情況。結(jié)果（圖1）表明，MCW148能在12 h內(nèi)將NO3--N濃度從140 mg/L以上降至0.05 mg/L以下，同時(shí)，NO2--N的濃度先逐步升高，然后逐步降低至0.05 mg/L以下，說明MCW148菌株具有高效的反硝化脫氮能力。另外，由圖1還可知，MCW148菌株的生長同步于NO3--N濃度的降低，且MCW148菌株的生長曲線、NO3--N的代謝曲線中的遲緩期基本都在0～3 h，然后進(jìn)入對數(shù)期（4～15 h），約在24 h達(dá)到最高的菌體生長量。

2.3 菌株的鑒定

菌株MCW148在LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d的菌落為乳白色，圓形，中間凸出，表面光滑濕潤，直徑在1 mm左右；細(xì)胞呈直桿狀，1.0 μm×3.0 μm，革蘭氏陽性，常以成對或鏈狀排列，單極毛（圖2）。接觸氧化酶陽性；可利用葡萄糖、檸檬酸鈉、阿拉伯糖、木糖等為碳源，但利用葡萄糖效果最好；硝酸鹽還原和反硝化陽性。擴(kuò)增菌株MCW148的16S rRNA部分基因，長度為1 516 bp。序列分析表明該菌株與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）的同源性最高，為99%[4，11]。結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生化特征，將菌株MCW148初步鑒定為巨大芽孢桿菌。目前，國內(nèi)外在好氧反硝化菌領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究[12-16]，但在芽孢桿菌屬中，具有耐鹽和好氧反硝化能力的細(xì)菌卻鮮有報(bào)道。

2.4 MCW148菌株生長條件及脫氮特性

2.4.1 最適碳源 分別以葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、檸檬酸鈉為碳源，貧營養(yǎng)反硝化性能測定培養(yǎng)基中的其他成分不變，接種MCW148菌株，在30 ℃、120 r/min搖床條件下培養(yǎng)2 d，定時(shí)取樣測定NO3--N濃度。圖3的結(jié)果表明，菌株MCW148能夠利用多種碳源進(jìn)行脫硝酸鹽氮，其中，碳源為葡萄糖時(shí)，NO3--N的去除效果最佳，培養(yǎng)12 h去除率便達(dá)到了62.4%；其次是檸檬酸鈉，NO3--N在培養(yǎng)12 h時(shí)去除率為34.2%，24 h去除率達(dá)到了59.7%；丁二酸鈉、草酸鈉24 h的NO3--N去除率分別為45.8%和33.7%；而菌株MCW148基本不利用乙酸鈉為碳源。因此，葡萄糖為菌株MCW148的最適碳源。

2.4.2 最適溫度 由圖4可知，MCW148菌體生長和反硝化的溫度適宜范圍為30～40 ℃，在35 ℃時(shí)NO3--N去除率最高，為74%。另外，由圖4可以看出，MCW148的生長和反硝化存在一個(gè)臨界溫度，即25 ℃，一旦低于這個(gè)溫度，MCW148的生長和代謝活性顯著降低，因此，該菌嗜高溫而對低溫非常敏感，建議35 ℃為其最適生長溫度。

2.4.3 最適初始pH 由圖5可知，MCW148菌株在pH 5～9的范圍內(nèi)對NO3--N的代謝去除活性均較高，其最佳pH為6，此時(shí)的NO3--N去除率為60%。

3 小結(jié)

本研究從渤海某海水養(yǎng)殖場（北美白對蝦）底泥中分離到1株耐鹽高效好氧反硝化細(xì)菌，經(jīng)過對其形態(tài)特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，初步鑒定為巨大芽孢桿菌。該菌株在去除NO3--N的同時(shí)，也能降解COD。菌株MCW148在不同種類碳源下去除NO3--N的能力由大到小依次為葡萄糖、檸檬酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、乙酸鈉。其生長和代謝NO3--N的最佳條件是溫度35 ℃、pH 6，在此條件下，鹽度為3%時(shí)，菌株MCW148能達(dá)到最佳生長狀況和最大去除率，12 h對NO3--N的去除率為62.4%。

菌株MCW148具有生長速度較快、對NO3--N去除率高的特點(diǎn)，今后，將對該菌株的代謝機(jī)理、酶的影響等方面做進(jìn)一步的探討和研究，并結(jié)合其他脫氮微生物以及固定化技術(shù)，可為海水水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)改良等方面提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] 任華峰，姜天翔，邱金泉，等.復(fù)合微生物菌劑在海水養(yǎng)殖廢水凈化中的試驗(yàn)研究[J]. 環(huán)境污染與防治，2015（7）：111.

[2] ROBERTON L A，KUENEN J G. Aerobic denitrification： A controversy revived[J]. Archives of Microbiology，1984，139（5）： 351-354.

[3] 李彥芹，李春青，管鵬悅，等.一株好氧反硝化菌的分離鑒定及脫氮條件研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2015，38（7）：33-37.

[4] 鄭喜春，郭曉軍，姚 娜，等.反硝化芽孢桿菌的篩選鑒定及反硝化特性[J].生態(tài)學(xué)雜志，2012，31（6）：1447-1452.

[5] 張 凱，雷夢婕，胡國元，等.好氧反硝化細(xì)菌WIT-1的分離鑒定及其脫氨氮特性[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（11）：14-18.

[6] 馬 放，張 佳，張獻(xiàn)旭，等.生物陶粒反應(yīng)器中好氧反硝化細(xì)菌的脫氮研究[J].中國環(huán)境科學(xué)，2007，27（4）：529-533.

[7] 吳智導(dǎo)，黃少斌，盧 樂.曝氣生物濾池處理含硝態(tài)氮廢水的研究[J].水處理技術(shù)，2012，38（1）：80-83.

[8] 于愛茸，李 尤，愈吉安.一株耐氧反硝化細(xì)菌的篩選及脫氮特性研究[J].微生物學(xué)雜志，2005，25（3）：77-81.

[9] 杜立剛，張聰琳，陳寶玉.生物反硝化生物脫氮技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 能源與環(huán)境，2015（4）：66-68.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[11] KIM J K，PARK K J，CHO K S. Aerobic nitrification denitrification by heterotrophic Bacillus strains[J]. Bioresource Technology，2005，96：1897-1906.

[12] 丁 煒，朱 亮，徐 京，等.好氧反硝化菌及其在生物處理與修復(fù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)報(bào)，2011，17（6）：923-929.

[13] 王弘宇，馬 放，蘇俊峰，等.不同碳源和碳氮比對一株好氧反硝化細(xì)菌脫氮性能的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（6）：968-972.

[14] 王弘宇，馬 放，蘇俊峰，等.含硝氮廢水的好氧反硝化處理及其系統(tǒng)微生物群落動(dòng)態(tài)分析[J].環(huán)境科學(xué)，2007，28（12）：2856-2860.

[15] 喬 南，陳瑞佳，于大禹.硅藻土負(fù)載異氧硝化-好氧反硝化菌的脫氮性能[J].化工進(jìn)展，2015，34（5）：1459-1465.

[16] 車 鑒，徐 牧，陽桂菊，等.硅藻土固定化顆粒污泥對海水養(yǎng)殖廢水除氨性能[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014，8（12）：5318-5322.