楊紹麗++吳仁鋒

摘要：從湖南省寄來茄子病樣中分離出引起茄子爛稈病的病原真菌，對該菌進行了形態(tài)學觀察、致病性測定及分子鑒定。結果表明，病原菌形態(tài)學鑒定為擬莖點霉（Phomopsis vexans）。對菌株HNQJ的核糖體RNA基因內(nèi)轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）進行PCR擴增和序列測定，并在GenBank中進行比對分析，根據(jù)rDNA-ITS序列分析結果結合病株癥狀和病菌的形態(tài)學特征，認為湖南茄子爛稈病的病原菌為擬莖點霉。

關鍵詞：茄子爛稈；形態(tài)學；分子鑒定；rDNA-ITS分析

中圖分類號：S436.411 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2455-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.014

Identification of Pathogen Causing Eggplant Rotten Stem

YANG Shao-li， WU Ren-feng

（Institute of Vegetable， Wuhan Academy of Agricultural Science and Technology， Wuhan 430065， China）

Abstract： A pathogen causing eggplant rotten stem was isolated from disease samples selected in Hunan province， then the morphological observation， pathogenicity test and molecular identification were carried out. The result showed that the pathogen of Eggplant rotten stem was identified as Phomopsis vexans by morphology. The rDNA-ITS genes of isolate HNAJ were amplified and sequenced， then the results were compared and analyzed in GenBank. According to the sequence analysis， combining the symptom of diseased plants and the morphological characters of pathogen， the pathogen causing eggplant rotten stem of Hunan was identified as Phomopsis vexans.

Key words： eggplant rotten stem； morphology； molecular identification； rDNA-ITS analysis

湖南省瀏陽市茄子產(chǎn)區(qū)發(fā)生毀滅性爛稈病，從2010年的小面積發(fā)病到2011年、2012年連續(xù)兩年大面積暴發(fā)，嚴重的區(qū)域甚至出現(xiàn)絕收，給農(nóng)戶造成極大的損失。該病從發(fā)現(xiàn)中心病株到全田枯死要2個多月，嚴重的到8月底至9月初時基本絕收。本研究收集并分離茄子爛稈病病樣，進行病原菌分離、致病性測定和病原形態(tài)學和分子鑒定，以明確湖南地區(qū)茄子爛稈病的病原，為病害診斷和防治提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣來源

2011年和2012年從湖南省瀏陽市寄來的茄子爛稈病病樣。

1.2 病原菌的分離

病原菌的組織分離[1]：取典型帶病莖稈，75%乙醇消毒，無菌水沖洗晾干，無菌刀片切取病健交界處小塊組織，用0.1%升汞溶液表面消毒3～5 min，無菌水沖洗3次，吸干組織塊表面水分，再將可能被殺死的組織剪去，接入PDA培養(yǎng)基，每皿3～5塊，置25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)觀察。菌絲萌發(fā)后，選典型菌落轉接3次，5 d后用直徑6 mm的打孔器，從菌落邊緣打取菌餅，轉接與PDA平板純化培養(yǎng)。

1.3 致病性測定

用分離獲得的病原菌菌餅，進行盆栽健康無病茄子莖稈有傷（針刺）和無傷接種試驗。選取健康無病的茄子植株，用培養(yǎng)7 d的菌餅貼在傷口處和無傷接種處，用浸濕的棉球保濕，保鮮膜包裹住棉球及菌餅。以無菌培養(yǎng)基餅做對照，3 d后取下棉球及菌餅，觀察記錄發(fā)病情況。待發(fā)病后，用上述“1.2”中的方法分離培養(yǎng)，并與接種物比較，確定是否為同一病原物。

1.4 病原菌培養(yǎng)性狀、形態(tài)觀察

1.4.1 直接鏡檢 從典型癥狀的病莖上挑取病原的分生孢子器，制作臨時玻片，進行分生孢子器、分生孢子的形態(tài)觀察，初步確定病原菌的種類，可與組織分離培養(yǎng)物進行相互驗證。

1.4.2 病原物培養(yǎng)觀察 通過柯赫氏法則驗證，確定茄子爛稈病的病原。將供試菌株接種到PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，測量菌落生長直徑，描述菌落顏色、形態(tài)，挑取培養(yǎng)物，用顯微鏡觀察分生孢子器、分生孢子形態(tài)，測量其大小。

1.5 病菌核糖體RNA基因內(nèi)轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列比較

1.5.1 菌絲體的培養(yǎng)與收集 選取典型菌株HNQJ進行分子檢測。將斜面保存的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上進行活化。將活化后的菌株移接在鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上（每皿約30 mL培養(yǎng)基），每皿均勻接種2個菌絲塊，每菌株接2～3個平板。于25 ℃培養(yǎng)7 d后，用滅菌解剖刀刮取菌絲，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 基因組DNA的提取 基因組DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltriethylammonium bromide，CTAB）法提取和純化[2]。

1.5.3 ITS擴增 用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增[2]。其序列為，TS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.5.4 PCR反應條件 PCR反應體系總體積為50 μL，反應液組分為：10×PCR Buffer 5 μL，25 mM MgCl2 4 μL，10 mM dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶 0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和ITS4（25 μmol/L）各1 μL，用ddH2O使總體積達到50 μL，在PTC-100 PCR擴增儀上擴增。擴增條件：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min；54 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物委托武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進行純化和測序。

1.5.5 ITS序列分析 將測序所得菌株的核糖體DNA-ITS序列與互聯(lián)網(wǎng)GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫中的ITS區(qū)相關序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 病樣采集和病原分離

2011年和2012年6月湖南省瀏陽地區(qū)茄子莖稈腐爛病的發(fā)生危害嚴重，連續(xù)兩年郵寄爛稈病樣標本，并對8份樣品進行分離，均能分離出Phomopsis屬真菌且形態(tài)一致。以2012年分離菌株HNQJ為模式菌株進行鑒定，本研究中涉及到病原菌的所有試驗，使用的均為該菌株。

2.2 致病性測定

經(jīng)侵染回接試驗，有傷接種和無傷接種茄子莖稈均可發(fā)病，發(fā)病率分別為100%和70%。有傷接種的病情嚴重，發(fā)展較快，易倒伏，無傷接種潛伏期長，病狀出現(xiàn)相對較晚，但后期同樣枯死，對照均未發(fā)?。▓D1）。接種發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀基本一致。發(fā)病莖稈進行再分離，仍得到相同結果。

2.3 病原菌形態(tài)學鑒定

2.3.1 直接鏡檢 載孢體在植物組織上，初期埋生，后突破表皮，能夠看到球形黑色小點。鏡檢分生孢子器球型，扁球形，有孔口，直徑120～210 μm?？捎^察到兩種類型的分生孢子，一種是橢圓形或紡錘形（α型-分生孢子），通常內(nèi)含2～3個油球；另一種呈細長線狀，并在一端彎曲成鉤（β型-分生孢子），β型-分生孢子不能萌發(fā)（圖2）。

2.3.2 培養(yǎng)形態(tài) 在PDA培養(yǎng)基上菌落呈輪紋狀輻射生長，菌絲米黃色，菌落上有白色菌絲簇（圖3A），不產(chǎn)生分生孢子器，5 d直徑83 mm（PDA，25 ℃）。光照條件下培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)基背面有黑色油滴狀分生孢子堆產(chǎn)生（圖3B），挑取黑色分生孢子器，載玻片上壓碎，鏡檢可以觀察到凸透鏡型有孔口的分生孢子器（圖3C），壓破分生孢子器有無數(shù)β型分生孢子從分生孢子器孔口溢出。與直接鏡檢不同的是培養(yǎng)條件下僅能觀察到β型分生孢子（圖3D）。

2.3.3 形態(tài)鑒定依據(jù) 對該菌在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)形態(tài)、分生孢子器、分生孢子、產(chǎn)孢細胞進行描述，比對《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志：擬莖點霉屬》以及魏景超[3]、戚佩坤等[4]、周永力等[5]對Phomopsis屬各個種的描述，初步確定引起湖南地區(qū)茄子爛稈病的病原為擬莖點霉（Phomopsis vexans）。

2.4 rDNA-ITS序列分析

菌株HNQJ的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得一條550 bp左右的擴增條帶。將PCR產(chǎn)物送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進行序列測序。將測定的序列與GenBank中已有的擬莖點霉（登錄號為KJ002759.1）的序列進行比對，結果表明，HNQJ與其序列相似性最高，達99.0%；因此，可證實病原真菌分離物HNQJ為擬莖點霉屬真菌，與形態(tài)學鑒定結果一致。

3 小結與討論

研究表明，引起湖南地區(qū)茄子爛稈病的病原為半知菌亞門擬莖點霉屬真菌Phomopsis vexans。該病菌不僅可以從傷口侵入，也可以直接從表皮侵染，并且傷口有利于病原菌侵入并加重病害發(fā)生，主要為害茄子莖稈，引起茄子莖稈腐爛，植株枯死。自然條件下分生孢子有兩種類型，一種是橢圓形或紡錘形（α型），另一種呈細長線狀，并在一端彎曲成鉤（β型），而在人工培養(yǎng)條件下僅能觀察到β型。吳仁鋒等[6]研究發(fā)現(xiàn)武漢地區(qū)分離茄子褐紋病菌病原分生孢子主要為α型分生孢子，目前自然條件及人工培養(yǎng)條件下還未發(fā)現(xiàn)β型分生孢子。說明地理的差異，對分生孢子形態(tài)的產(chǎn)生有較大影響，為此，對不同來源的菌株進行形態(tài)、致病性、生物學特性等還有待深入研究。

在形態(tài)學鑒定的基礎上，通過對病原菌rDNA-ITS區(qū)擴增所得序列與GeneBank中的序列進行同源性比較。結果表明，菌株HNQJ與Phomopsis vexans的同源性最高，這也驗證了形態(tài)學的鑒定結果。在真菌鑒定上應以形態(tài)學鑒定為基礎，分子鑒定為補充，rDNA-ITS序列分析結果可作為形態(tài)學鑒定的輔助驗證[7]。

參考文獻：

[1] 方中達.植病研究方法[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[2] GRAHAM G C，MAYSER P，HENRY R J. A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis[J]. Biotechniques，1994，16（1）：48-50.

[3] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W出版社，1979.

[4] 戚佩坤，姜子德，向梅梅.中國真菌志 第三十四卷 擬莖點霉屬[M].北京：科學出版社，2007.

[5] 周永力，呂國忠，劉偉成，等.球殼孢目真菌個體發(fā)育研究Ⅰ：殼二孢等四屬[J].菌物系統(tǒng)，1998，17（3）：199-205.

[6] 吳仁鋒，楊紹麗，楊德枝.茄子褐紋病病原鑒定及其生物學特性研究[J].中國蔬菜，2013（8）：80-85.

[7] 孫廣宇，彭友良，李振歧，等.核苷酸序列分析在真菌系統(tǒng)學研究中的應用[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2003，31（6）：187-192.