李玲++陸曉晨++馬懷宇++呂德國

摘要：試驗以山定子（Malus baccata Borkh.）實生苗為試驗材料，研究根域亞低溫下不同外源氮（NO3-和NH4+）對山定子根系活力、根系氮代謝關鍵酶活性以及根系抗氧化酶活性的影響。結果表明，亞低溫條件下，添加外源氮可在一定時間內提高山定子的根系活力；提高了山定子根系硝酸還原酶（NR）和谷氨酸合酶（GOGAT）活性，但降低了谷氨酰胺合成酶（GS）活性，谷氨酸脫氫酶（GDH）活性整體呈上升趨勢。不同氮源對山定子根系氮代謝酶活性影響不同，NH4+處理的山定子根系GS活性和GDH活性高于NO3-處理。亞低溫條件下，添加外源氮提高了根系過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，但降低了超氧化物歧化酶（SOD）活性。因此，施加外源氮可緩解根域亞低溫對植株生長的傷害。同時研究表明，兩種外源氮對山定子根系響應亞低溫具有不同的影響，為蘋果生產中合理施用氮肥提供了理論基礎。

關鍵詞：亞低溫；外源氮；山定子（Malus baccata Borkh.）；根系；氮代謝；抗氧化酶

中圖分類號：S661.9；Q945.13 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2471-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.018

Effects of Different Exogenous Nitrogen on Nitrogen Metabolism of Malus baccata Borkh. Roots Under Mild Hypothermia

LI Ling1，LU Xiao-chen2，MA Huai-yu2，L？譈 De-guo2

（1.Xingcheng Secondary Vocational and Technical College， Xingcheng 125100， Liaoning， China；

2.College of Horticulture， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract： The seedlings of Malus baccata Borkh. were used as materials to study the efficiency of exogenous nitrogen on root vigor， nitrogen metabolism， and activities of antioxidant enzymes in roots under mild hypothermia. The results showed that， under mild hypothermia exogenous nitrogen increased root vigor within a certain time， increased the activities of the nitrate reductase and glutamate synthase， but reduced glutamine synthetase activity， while glutamate dehydrogenase activity showed an upward trend as a whole. In addition， different kinds of nitrogen showed different effects on enzyme activities of root nitrogen metabolism. The activities of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase by NH4+ treatment were higher than that by NO3- treatment. Under mild hypothermia， exogenous nitrogen significantly enhanced the activities of POD and CAT， but had negative effects on SOD activity. Therefore， exogenous nitrogen can alleviate the damage caused by mild hypothermia stress on the root zone. The results showed that two kinds of exogenous nitrogen had different effects on the response of mild hypothermia， which provided the theoretical basis for rational application of nitrogen fertilizer in apple production.

Key words： mild hypothermia； exogenous nitrogen； Malus baccata Borkh.； root； nitrogen metabolism； antioxidant enzyme

目前，隨著中國蘋果抗寒育種研究的不斷進步，寒富蘋果已經成為具有代表性的抗寒大果型品種，并在沈陽等蘋果產區(qū)廣泛栽植。但是沈陽地區(qū)早春氣溫回升較快，而土溫回升相對滯后，導致植株根系處于亞低溫狀態(tài)，影響生長季初期植株的生長發(fā)育。

氮代謝是植物的基礎生理過程之一，是春季樹體恢復生長、萌芽、展葉、開花等生長發(fā)育過程的重要物質基礎。王海寧等[1]研究了不同蘋果砧木對硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收利用，結果表明，蘋果砧木是喜硝態(tài)氮植物，對硝態(tài)氮的利用率及征調能力均高于銨態(tài)氮。植物的氮代謝過程中，有一系列的相關酶參與反應，其中硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）及谷氨酸脫氫酶（GDH）為氮代謝途徑中的關鍵酶。氮代謝對環(huán)境溫度比較敏感，尤其是低溫。關于低溫脅迫的研究表明，根系GS活性在逐漸降溫和迅速降溫條件下均有顯著的提高，其中迅速降溫處理GS活性較高，根系GDH活性呈現(xiàn)下降的趨勢，GOGAT活性較低，可能是由于逐漸降溫使根系有較長時間的反應過程，對氮代謝功能傷害較小，為迅速降溫條件下根系應激反應更強烈提供了證據(jù)[2]。研究表明，外源施加不同形態(tài)的氮素可以提高植株葉綠素含量、根系活力及氮代謝關鍵酶活性，以緩解低溫對植株的傷害[3]。另有研究表明[4]，在逆境條件下植物的抗氧化酶系統(tǒng)均可清除體內產生的活性氧等物質。其中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）在活性氧的清除方面發(fā)揮重要的作用，保持體內活性氧代謝的平衡，從而對細胞膜結構起到保護作用，在一定程度上增加植株對逆境脅迫的抵抗能力。上述各項酶活力能夠較好地反映植物的抗逆性強弱，但其在不同處理下的變化存在差異[5，6]。劉國英等[7]研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫條件下，不同硝銨配比對番茄幼苗抗氧化酶活性有一定的影響，當NO3--N/NH4+-N比例為75/25時最有利于提高番茄植株的抗寒性。

為此，試驗以北方地區(qū)常用蘋果砧木山定子為試驗材料，研究亞低溫條件下不同外源氮對植物氮代謝及活性氧清除系統(tǒng)調節(jié)的生理特征，以期為蘋果生產中氮肥的合理施用以及對亞低溫條件下根系功能的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年4月在沈陽農業(yè)大學果樹栽培與生理生態(tài)試驗基地進行，以當年生山定子（Malus baccata Borkh.）實生苗為試驗材料，種子經層積催芽后播于穴盤中，常規(guī)管理，待幼苗長出4～5片真葉后移苗至黑色塑料營養(yǎng)缽（上口直徑10 cm×高10 cm）中，待山定子實生苗長至15片真葉時，挑選生長一致的轉入人工氣候箱進行試驗處理。

1.2 試驗處理

1.2.1 亞低溫處理 根系置于5 ℃的條件下后，將整株植株放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度為18 ℃（晝）/ 8 ℃（夜），光照14 h，以整株植株都生長在18 ℃（晝）/8 ℃（夜）中的幼苗作為對照，分別于處理后0、2、4、6、8、10、12、14、16 d進行取樣，試驗5次重復。

1.2.2 加氮處理 在亞低溫處理前，根系分別澆灌2 mmol/L的KNO3和2 mmol/L的NH4Cl溶液。

1.3 測定方法

1.3.1 根系氮代謝關鍵酶活性的測定 根系活力采用TTC法測定[8]；硝酸還原酶（NR）采用磺胺比色法測定[9]。

按參考文獻[10]的方法提取根系中的粗酶液，取根系樣品0.2 g，加入2 mL提取緩沖液，冰浴研磨，轉移于離心管中離心，上清液即為粗酶提取液，粗酶液用于谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、谷氨酸脫氫酶活性的測定。

GS活性參考文獻[9]的方法測定；NADH-GOGAT活性采用參考文獻[11]的方法測定，以在30 ℃條件下反應混合液每分鐘減少1 μmol的NADH為一個酶活性單位，總NADH-GOGAT活性計算以每分鐘每毫克酶液催化NADH減少的微摩爾數(shù)表示；NADH-GDH活性參考參考文獻[12]的方法測定，GDH活性以每分鐘在30℃下氧化1 μmol的NADH為1個酶活單位。

1.3.2 根系抗氧化酶活性的測定 SOD活性測定參考文獻[13]的方法，以抑制氮藍四唑（NBT）光氧化還原50%的酶量為1個活力單位（U）；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，以每分鐘OD值變化0.1為一個酶活單位（U）；CAT活性采用文獻[14]的方法測定，以每分鐘OD值降低0.043 6的酶量為1個活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 外源氮對亞低溫下山定子根系活力的影響

由圖1可見，對照的根系活力在處理的前2 d快速下降，此后保持在較低的水平。添加NO3-處理和添加NH4+處理的根系活力在前4 d表現(xiàn)出相反的變化趨勢，前者的根系活力先升高后降低，后者的根系活力先下降后升高。4 d后兩個處理的根系活力呈上升的趨勢并且始終高于對照。添加NO3-處理的根系活力在第10 天達到最大值，并且明顯高于NH4+處理，為對照的1.72倍，之后根系活力逐漸降低。NH4+處理的根系活力4 d后呈上升的趨勢，但在4～12 d一直低于NO3-處理，12 d后出現(xiàn)一個快速升高的階段，在14 d后略高于NO3-處理。

2.2 外源氮對亞低溫下山定子根系氮代謝關鍵酶活性的影響

2.2.1 外源氮對亞低溫下山定子根系谷氨酰胺合成酶活性的影響 由圖2可見，對照中GS活性一直保持在較高水平。與對照相比，添加氮素處理后，根系GS活性在處理的前2 d大幅度降低，此后穩(wěn)定在較低水平。添加NO3-和NH4+處理的GS活性水平在第2～16天一直相近。至處理結束，添加NO3-和NH4+處理的GS活性均顯著低于對照，分別為對照的58.73%、62.03%。

2.2.2 外源氮對亞低溫下山定子根系硝酸還原酶活性的影響 由圖3可見，處理過程中，對照的NR活性不斷增強，但低于添加氮素處理的植株。添加NO3-處理的NR活性在前4 d呈現(xiàn)上升的趨勢，此后開始降低，在第6天酶活性降到低谷后又呈升高的趨勢，而添加NH4+處理的NR活性則在前6 d呈現(xiàn)上升的趨勢，此后開始下降，在第8天酶活性降到低谷后又呈上升的趨勢。至處理的第10天添加NO3-和NH4+處理的NR活性達到峰值，分別為對照的1.2倍和1.3倍，10 d后NO3-處理的NR活性迅速下降，至第14天達到低谷后又有所升高，NH4+處理的NR活性在10 d后趨于穩(wěn)定。處理期間，添加NH4+處理的NR活性始終高于添加NO3-處理的NR活性。

2.2.3 外源氮對亞低溫下山定子根系谷氨酸合酶活性影響 由圖4可見，對照中GOGAT的活性一直保持在較低水平。與對照相比，添加不同形態(tài)氮素后，NH4+處理的根系GOGAT活性始終顯著高于對照和NO3-處理，添加NO3-處理的根系GOGAT活性在處理的0～10 d低于對照，處理10 d后酶活力迅速上升并且顯著高于對照。添加NO3-處理后，根系GOGAT活性在處理的0～6 d緩慢下降，到第6天下降到最小值，比對照降低了53.32%，處理6～10 d根系GOGAT活性趨于穩(wěn)定，10 d后GOGAT活性迅速升高，到處理的12 d時升高到最大值，為對照的3.04倍。添加NH4+處理后，根系GOGAT活性表現(xiàn)出迅速升高的趨勢，到處理的第8天達到最大值，為對照的4.57倍。

2.2.4 外源氮對亞低溫下山定子根系谷氨酸脫氫酶活性的影響 由圖5可見，添加NH4+后山定子根系GDH活性始終高于對照和NO3-處理，NH4+處理的根系GDH活性呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，到處理的第10天達到最大值，為對照的1.61倍，處理10 d后根系GDH活性逐漸下降到對照水平。添加NO3-處理的根系GDH活性呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢。NO3-處理根系GDH活性在處理0～4 d表現(xiàn)為下降趨勢，至第4天下降到最小值，比對照降低了47.87%，處理4～10 d中根系GDH活性迅速上升，在第10天上升到最大值，為對照的1.32倍。至第16天NO3-和NH4+處理與對照三者間差異不大。

2.3 外源氮對亞低溫下山定子根系抗氧化酶活性的影響

2.3.1 外源氮對亞低溫下山定子根系過氧化物酶活性的影響 由圖6可知，亞低溫條件下添加不同形態(tài)的氮素后，根系POD活性均高于對照。添加NO3-處理后，0～6 d根系POD活性表現(xiàn)為上升的變化趨勢，處理的第8天活性出現(xiàn)降低后又有所上升，處理14～16 d根系POD活性表現(xiàn)出明顯的增加趨勢。添加NH4+處理后，0～2 d根系POD活性呈現(xiàn)出上升的變化趨勢，第2～4天活力有所降低，4 d后根系POD活性緩慢增加，第8天后根系POD活性增加幅度加大，至第12天達到最高值，約為對照的2倍，14 d后根系POD活性迅速降低，逐漸接近對照值。處理期間，除第4、6、16天外，其余根系POD活性都表現(xiàn)為NO3-處理低于NH4+處理。

2.3.2 外源氮對亞低溫下山定子根系超氧化物歧化酶活性的影響 由圖7可知，在亞低溫條件下添加不同形態(tài)的氮素后，根系SOD活性均低于對照。添加NO3-處理后，根系SOD活性在處理的0～2 d表現(xiàn)為下降的變化趨勢，第2～14天SOD活性的變化趨勢基本保持水平，從第14天開始略有上升。添加NH4+處理后，根系SOD活力一直表現(xiàn)為下降的趨勢，直至處理的第14天達到最小值，比對照降低了5.57%，14 d后根系SOD活性上升至與NO3-處理相近。在整個處理期間，NH4+處理的根系SOD活性在0～10 d一直高于NO3-處理，但12 d后則下降至低于NO3-處理。

2.3.3 外源氮對亞低溫下山定子根系過氧化氫酶的影響 由圖8可知，亞低溫條件下添加不同形態(tài)的氮素后，根系CAT活性基本都高于對照。添加NO3-處理后，根系CAT活性在2～4 d處理中迅速升高，第4天達到最大值，為對照的2.05倍，4～6 d CAT活性降低，6 d后根系CAT活性雖有所上升，但變化趨勢比較平緩，14 d后活性出現(xiàn)下降變化。添加NH4+處理后，根系CAT活性在處理的2～4 d也表現(xiàn)出迅速上升的變化趨勢，4～8 d活性有所降低，處理8 d后根系CAT活性又迅速增加，至第10天達到最大值，處理10 d后根系CAT活性變化趨勢基本穩(wěn)定。在整個處理期間，0～10 d中根系CAT活力表現(xiàn)為NO3-處理高于NH4+處理，處理10 d后表現(xiàn)為NO3-處理低于NH4+處理。

3 小結與討論

在逆境條件下，根系是首先遭受傷害的器官，根系活力反映了根系代謝能力的強弱，直接影響植株的生長和抗逆性。本試驗中，在亞低溫條件下添加不同形態(tài)氮素后對根系活力有一定的影響，兩處理的根系活力皆比對照高，表明在亞低溫下添加外源氮素能在一定程度上提高根系的代謝活力，促進了根系對氮素的同化，從而來抵抗低溫環(huán)境的脅迫。并且在亞低溫條件下，添加NO3-處理的根系活力高于添加NH4+處理的根系活力，原因可能是由于植物吸收利用NO3-需要先消耗能量將其還原進而加以同化[15]，而NH4+可直接被同化利用，所以添加NO3-處理的根系活力有所增加。

氮代謝是植物生長發(fā)育中的重要代謝過程，植物可利用的氮素形態(tài)主要有NO3--N和NH4+-N兩種形式，并且都為主動吸收過程。其中硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶以及谷氨酸脫氫酶為氮素同化過程中的關鍵酶。NR在氮素同化過程中可以將NO3-還原，生成NH4+后進一步進行同化[16]。對于亞低溫條件下添加不同形態(tài)氮素的處理來說，處理后根系NR活性均處于上升的變化趨勢，兩個處理之間添加NO3-處理的NR活性大于NH4+處理。有研究表明，NR活性與其底物的含量密切相關，是硝酸鹽還原過程中的關鍵酶，硝態(tài)氮還原能力的強弱及植物吸收和積累硝態(tài)氮的能力與其活性的高低直接相關[17]。推測出現(xiàn)此種結果可能是由于外源添加NO3--N提高了根系周圍的NO3-離子濃度，進而誘導了NR活性的升高。

GS/GOGAT系統(tǒng)是高等植物氨同化過程中的主要途徑[18]，通過這一途徑產生的谷氨酰胺和谷氨酸是合成其他代謝產物的前體物質。GDH是銨同化過程中的另一種關鍵酶，雖然其作用尚有爭議，但初步研究表明，GDH有兩種作用，在外源氮含量過高時進行NH4+的同化，而在一定條件下又可分解谷氨酸來為TCA循環(huán)提供碳骨架[19]，并且有研究指出GDH可能在植物逆境條件下對緩解銨毒害有重要作用[20]。添加不同形態(tài)氮素對根系銨同化過程中的酶活性也存在一定的影響，NH4+處理的GS活性高于NO3-處理，有研究表明，銨態(tài)氮較硝態(tài)氮對GS活性的促進作用更為明顯[21，22]，與本研究結果一致。本試驗結果表明，亞低溫條件下添加不同形態(tài)氮素后，根系GDH活性表現(xiàn)為上升的變化趨勢，并且GDH活性一直表現(xiàn)為NH4+處理大于NO3-處理，可能是由于NH4+的大量積累誘導了酶活性的增加，從而來解除NH4+對根系的不良影響。

亞低溫條件下，添加不同形態(tài)氮素后明顯降低了根系SOD活性，尤其是對處理后期酶活性的抑制作用加強，說明添加氮素后不僅沒有緩解亞低溫對SOD活性的抑制作用，還加劇了處理后期（第8天后）酶活性的抑制程度，且NH4+對酶活性的抑制作用較強（處理第12天后），這可能是NH4+-N處理后期加重亞低溫脅迫對SOD的抑制作用。但氮素處理明顯提高了CAT、POD活性，尤其是在處理的中后期NH4+處理的促進效應強于NO3-。由此看來，亞低溫下抗氧化酶對NO3--N和NH4+-N處理的響應各異，他們之間的互作機理還需進一步的研究。

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