劉淑媛++艾仄宜++陳玉瓊++倪德江

摘要：試驗對Caco-2細胞膜上蔗糖酶和麥芽糖酶這兩種α-葡萄糖苷酶活性進行不同培養(yǎng)時間檢測，并以兒茶素單體EGCG作為抑制劑，探究其對Caco-2來源的蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制效果。結(jié)果表明，Caco-2細胞培養(yǎng)18 d后膜表面具有較高活性的蔗糖酶和麥芽糖酶，可用于進行α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選。兒茶素EGCG具有蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性，抑制IC50分別為31.08 μg/mL和36.44 μg/mL。

關(guān)鍵詞：茶；EGCG；蔗糖酶；麥芽糖酶；Caco-2細胞

中圖分類號：S571.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2479-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.020

Alpha-glucosidase Inhibitory Activity of EGCG in Caco-2 Cells

LIU Shu-yuan， AI Ze-yi， CHEN Yu-qiong， NI De-jiang

（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology， Ministry of Education/College of Horticulture and Forestry Sciences，

Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： This research used the Caco-2 cell monolayer model in vitro to simulate the α-glucosidase activity at different culture days. EGCG was used as an inhibitor to investigate the inhibition activities on sucrase and maltase in Caco-2 cells. The results illustrated that Caco-2 could be used to estimate α-glucosidase inhibitory activity after 18 days with high sucrase and maltase activities. EGCG showed inhibitory effect on sucrase and maltase in Caco-2 cells， with the IC50 values of 31.08 μg/mL and 36.44 μg/mL， respectively.

Key words： tea； EGCG； sucrase； maltase； Caco-2

茶作為世界上三大飲品之一，其抗癌、抗氧化、降血糖、降血脂等健康功效已得到廣泛證實[1-4]。兒茶素被認為是茶發(fā)揮其健康功效的主要成分。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是茶葉中兒茶素的重要單體，占兒茶素總量的約80%。已有大量文獻以兒茶素EGCG為研究對象，研究其在細胞上抑制腫瘤細胞生長、保護細胞膜損傷、信號通道等作用機理[5-7]。

α-葡萄糖苷酶在碳水化合物消化吸收方面發(fā)揮重要作用，是Ⅱ型糖尿病治療的靶點之一。本茶生理生化課題組實驗室前期體外實驗研究發(fā)現(xiàn)EGCG是茶葉中對α-葡萄糖苷酶起抑制作用的主要成分，其抑制IC50僅為0.059 mmol/L，遠小于陽性對照阿卡波糖（阿卡波糖IC50為7.19 mmol/L）[8]。Matsumoto等[9]利用大鼠體內(nèi)試驗研究發(fā)現(xiàn)兒茶素短時間（提前30 min）灌胃Wistar大鼠，可降低大鼠小腸上皮黏膜蔗糖酶活性。人結(jié)腸腺癌細胞系Caco-2模型具有與人小腸上皮細胞相似的糖消化、吸收和葡萄糖異生相關(guān)的酶，可應(yīng)用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選[10，11]。為此，試驗采用Caco-2模型，分析兒茶素EGCG對蔗糖酶和麥芽糖酶這兩種α-葡萄糖苷酶的抑制效果，以期為兒茶素抑制餐后血糖升高，減緩糖尿病癥狀提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Caco-2細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所；EGCG購自Sigma公司（E4143，純度 >95%）；DMEM培養(yǎng)液、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素及胰蛋白酶（含0.02% EDTA）均購自美國Hyclone公司；支原體抗生素Plasmocin購自Invivogen公司；cck-8試劑盒和葡萄糖測定試劑盒購自南京建成生物科技發(fā)展有限公司；細胞培養(yǎng)瓶以及24孔細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將處于對數(shù)生長期的細胞接種于24孔板，接種密度為4 000個/cm2，于37 ℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%青霉素/鏈霉素，1%的L-谷氨酰胺，0.25 mg支原體抗生素plasmocin）培養(yǎng)細胞，隔天換液。

1.3 兒茶素EGCG對Caco-2細胞增殖的影響

采用cck-8法評價200 μmol/L濃度范圍內(nèi)EGCG對Caco-2細胞增殖的影響。細胞接種于96孔板，接種密度為104個/cm2，于37 ℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含10、30、50、100、200 μmol/L EGCG的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入10 μL cck-8試劑，37 ℃孵育1 h后450 nm處測OD值。用細胞存活率來衡量EGCG在Caco-2細胞模型上的安全負載量。

1.4 Caco-2細胞中α-葡萄糖苷酶活性檢測

Caco-2細胞接種后分別于14、16、18、20、22和24 d檢測細胞上蔗糖酶和麥芽糖酶活性。蔗糖、麥芽糖溶液均為28 mmol/L，用磷酸緩沖溶液（PBS，pH 7.4）溶解，過0.22 μmol/L膜抽濾滅菌，37 ℃預(yù)熱待用。Caco-2細胞棄去舊的培養(yǎng)液，用37 ℃預(yù)熱的PBS緩沖溶液清洗細胞表面3次。每孔加入1 mL蔗糖/麥芽糖溶液，37 ℃孵育40 min，冰浴結(jié)束反應(yīng)。根據(jù)葡萄糖測定試劑盒方法檢測產(chǎn)物葡萄糖含量。

1.5 兒茶素EGCG對Caco-2細胞上α-葡萄糖苷酶活力的影響

Caco-2細胞培養(yǎng)至21 d，棄去舊的培養(yǎng)液，用37 ℃預(yù)熱的PBS緩沖溶液清洗細胞表面3次，加入1 mL含不同濃度EGCG的蔗糖/麥芽糖溶液（28 mmol/L，PBS溶解），37 ℃孵育40 min。冰浴結(jié)束反應(yīng)。陰性測定組加入1 mL蔗糖/麥芽糖溶液（28 mmol/L），空白組加入1 mL PBS緩沖溶液。根據(jù)葡萄糖測定試劑盒方法檢測產(chǎn)物葡萄糖含量。根據(jù)下面公式計算抑制率：

抑制率=[（OD陰性對照組-OD樣品測定組）/（OD陰性對照組-OD空白）]×100%

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素EGCG毒理

不同濃度兒茶素EGCG孵育Caco-2細胞24 h細胞活力見圖1。從圖1可以看出，兒茶素EGCG在濃度達200 μmol/L濃度時，細胞存活率仍大于80%。在此濃度范圍內(nèi)對Caco-細胞增殖無明顯影響，可用于后續(xù)試驗。

2.2 不同培養(yǎng)時間Caco-2上蔗糖酶和麥芽糖酶變化

Caco-2細胞接種24孔板，約7 d后細胞融合，開始分化。從圖2和圖3可以看出，細胞膜表面酶活性隨細胞培養(yǎng)時間的延長而增強。蔗糖酶活性在細胞培養(yǎng)14～18 d之間活性變化平穩(wěn)，且酶活性較低。18 d后蔗糖酶活性逐漸增強，至培養(yǎng)24 d時，蔗糖酶活性仍保持上升趨勢。麥芽糖酶活性自細胞培養(yǎng)16 d時逐漸增強，培養(yǎng)24 d后仍保持上升趨勢。蔗糖酶和麥芽糖酶活性在20～22 d之間均變化平穩(wěn)，故細胞培養(yǎng)21 d用于兒茶素EGCG對此兩種酶活性的抑制試驗。

2.3 兒茶素EGCG對Caco-2細胞上蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制作用

從圖4可以看出，兒茶素EGCG對Caco-2細胞上蔗糖酶和麥芽糖酶均有抑制效果，且抑制作用隨濃度的增大而增強。當(dāng)EGCG濃度超過一定范圍后對蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性的增強都減弱。EGCG對蔗糖酶和麥芽糖酶抑制IC50分別為31.08 μg/mL和36.44 μg/mL。EGCG對蔗糖酶的抑制效果要略強于麥芽糖酶。然而，在低濃度（10 μmol/L）情況下，兒茶素EGCG對麥芽糖酶抑制率高于蔗糖酶。

3 小結(jié)與討論

α-葡萄糖苷酶是一類能夠催化水解葡萄糖基的酶的總稱。α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效降低餐后高血糖。中國人飲食結(jié)構(gòu)主要是淀粉，麥芽糖酶和蔗糖酶在食物消化成可被吸收的單糖過程中發(fā)揮主要作用。Caco-2細胞來源于人結(jié)腸腺癌細胞，體外培養(yǎng)時能自發(fā)地進行類似腸道細胞的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)上的分化，獲得許多小腸吸收細胞的特性。Caco-2細胞不同培養(yǎng)天數(shù)后蔗糖酶和麥芽糖酶活性檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)18 d后具有該細胞較高的蔗糖酶和麥芽糖酶活性，可用于研究藥物對Caco-2細胞來源的蔗糖酶和麥芽糖酶活性的研究。Caco-2細胞孵育麥芽糖較孵育蔗糖時酶解產(chǎn)物葡萄糖含量高，說明Caco-2細胞上麥芽糖酶活性高于蔗糖酶。兒茶素EGCG對Caco-2來源的兩種α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，且抑制作用有劑量依賴性。Xu等[12]對多種兒茶素單體體外α-葡萄糖苷酶活性比較得出，EGCG具有最強α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制類型為混合型抑制。Kamiyama等[13]對兒茶素小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對麥芽糖酶的抑制活性遠強于抑制蔗糖酶的活性，其抑制IC50分別為16 μmol/L和 130 μmol/L。在本試驗中EGCG抑制蔗糖酶活性略強于抑制麥芽糖酶活性。不同的結(jié)論與試驗所用的α-葡萄糖苷酶來源有極大相關(guān)性。EGCG在濃度為10 μmol/L時對麥芽糖酶的抑制率即接近于40%。EGCG與蔗糖酶和麥芽糖酶的結(jié)合特性還有待進一步研究。

兒茶素因其生物利用度低，在實際應(yīng)用中受到極大限制。小鼠口服兒茶素[3H]-EGCG 1 h后，胃部存留率為30.7%，小腸部位存留率40.6%，之后大部分兒茶素隨糞便、尿液排出體外，血液中[3H]-EGCG含量在24 h時約2%[14]。人體空腹口服EGCG含量高達800 mg/mL時，約2 h血液中EGCG含量達到峰值，最高濃度僅為1.6 mg/mL[15]?？梢娍诜翰杷睾螅隗w內(nèi)主要作用部位為小腸細胞。藥物在小腸部位降血糖機理涉及鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體（SGLT1）、葡萄糖協(xié)助擴散轉(zhuǎn)運載體（GLUT2）、為SGLT1提供動力的Na+-K+-ATP酶及水解產(chǎn)生葡萄糖的α-葡萄糖苷酶。兒茶素抑制糖轉(zhuǎn)運體和Na+-K+-ATP酶功效亦有相關(guān)報道[16-18]。然而，兒茶素在小腸的部位不同，降低糖吸收途徑的抑制效果的貢獻率，及多種途徑間是否有協(xié)同作用仍有待研究。

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