肖華春，王成業(yè)，陸有飛， 張曉明，鐘志敏，馮育寧，陳麗麗，李媛媚

(1.云南生物制藥有限公司，昆明 650503；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530007；3.廣西麗原生物股份有限公司，南寧530001；4.安徽東方帝維生物制品股份有限公司，安徽亳州236800)

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分段補(bǔ)料法生產(chǎn)豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(EO630株)的試驗(yàn)研究

肖華春1，王成業(yè)1，陸有飛2， 張曉明3，鐘志敏3，馮育寧4，陳麗麗4，李媛媚4

(1.云南生物制藥有限公司，昆明 650503；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530007；3.廣西麗原生物股份有限公司，南寧530001；4.安徽東方帝維生物制品股份有限公司，安徽亳州236800)

為改進(jìn)豬多殺性巴氏桿菌病(亦稱(chēng)豬肺疫)活疫苗抗原制備工藝，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，采用分段補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(EO630株)抗原，培養(yǎng)12～13 h，EO630株的活菌數(shù)達(dá)到高峰期，最高活菌數(shù)可達(dá)1.31×1010CFU/mL。按分段補(bǔ)料法共生產(chǎn)抗原5批，培養(yǎng)12 h后收獲抗原，平均活菌數(shù)為1.17×1010CFU/mL，進(jìn)行配苗和凍干疫苗5批，凍干后的平均存活率為69%。安全和效力檢驗(yàn)均合格，達(dá)到預(yù)期效果。與傳統(tǒng)方法相比，該方法培養(yǎng)的活菌數(shù)有大幅度的增長(zhǎng)，優(yōu)勢(shì)明顯。

豬多殺性巴氏桿菌EO630株；傳統(tǒng)發(fā)酵工藝；分段補(bǔ)料發(fā)酵工藝；活菌數(shù)；生長(zhǎng)曲線；凍干存活率

豬多殺性巴氏桿菌病(豬肺疫)是由豬多殺性巴氏桿菌引起的一種常見(jiàn)的細(xì)菌性傳染病。多年來(lái)，EO630株被廣泛用作豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗及其聯(lián)苗的生產(chǎn)菌株，EO630株是用豬源B型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒菌株經(jīng)在含有海鷗牌洗衣粉的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代選育而得[1]。利用多殺性巴氏桿菌EO630株生產(chǎn)的弱毒活疫苗對(duì)豬肺疫有較好的預(yù)防效果。根據(jù)傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，采用逐步增大通氣量培養(yǎng)15 h，測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)EO630株在培養(yǎng)的第10～11小時(shí)時(shí)活菌數(shù)達(dá)到高峰期，活菌數(shù)大約在6.8×109CFU/mL。為了提高抗原活菌數(shù)，采用分段補(bǔ)料法進(jìn)行EO630株抗原的生產(chǎn)試驗(yàn)，即在培養(yǎng)的第8小時(shí)和第10小時(shí)分別添加10%的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 h后收獲，并測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。從該生長(zhǎng)曲線中能看出，在培養(yǎng)第12～13小時(shí)時(shí)，EO630株的活菌數(shù)達(dá)到高峰期，最高活菌數(shù)可達(dá)1.31×1010CFU/mL。按分段補(bǔ)料法共生產(chǎn)抗原5批，培養(yǎng)12 h后收獲抗原，平均活菌數(shù)為1.17×1010CFU/mL，凍干后的平均存活率為69%。按《中華人民共和國(guó)獸藥典2010版三部(簡(jiǎn)稱(chēng)《獸藥典》)[2]進(jìn)行安全和效力檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果均符合《藥典》規(guī)定，達(dá)到預(yù)期效果。

1 材 料

1.1 菌種 豬多殺性巴氏桿菌EO630株，來(lái)自成都獸醫(yī)藥械廠。

1.2 培養(yǎng)基、試劑 馬丁肉湯干粉培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)公司提供；馬丁瓊脂干粉培養(yǎng)基，北京中海生物科技有限公司提供。

1.3 儀器設(shè)備 200 L生物發(fā)酵罐，購(gòu)自青島強(qiáng)星設(shè)備科技有限公司；pH計(jì)，購(gòu)自德國(guó)賽多利斯(Sartorius)；移液器，購(gòu)自德國(guó)艾本德(EPPENDORF)。

2 方 法

2.1 馬丁肉湯干粉培養(yǎng)基制備 馬丁肉湯干粉培養(yǎng)基按說(shuō)明書(shū)的規(guī)定加注射用水進(jìn)行配制，然后按116 ℃，30 min進(jìn)行消毒滅菌后，冷卻備用。

傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)按12萬(wàn)毫升的培養(yǎng)基總量準(zhǔn)備，分段補(bǔ)料法發(fā)酵培養(yǎng)按10萬(wàn)毫升的培養(yǎng)基總量準(zhǔn)備，另用2萬(wàn)毫升規(guī)格的玻璃瓶按1萬(wàn)毫升、1.1萬(wàn)毫升的培養(yǎng)基量準(zhǔn)備若干瓶，于培養(yǎng)過(guò)程中作補(bǔ)料用。

2.2 細(xì)菌種子制備 按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇版(簡(jiǎn)稱(chēng)《規(guī)程》)[3]的方法，制備豬多殺性巴氏桿菌EO630株菌種液，經(jīng)純粹檢驗(yàn)及有關(guān)檢查合格者，置2～8 ℃，可保存3 d。

2.3 抗原制備

2.3.1 細(xì)菌接種 根據(jù)《規(guī)程》中的方法進(jìn)行細(xì)菌接種，按培養(yǎng)基總量的2%接種細(xì)菌種子液。將保存?zhèn)溆玫募?xì)菌種子液移入操作間，按發(fā)酵罐培養(yǎng)基總量加入0.1%裂解血球全血，連接接種各管道。通過(guò)空氣過(guò)濾器潔凈空氣的壓力將菌種壓入發(fā)酵罐內(nèi)。

2.3.2 傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng) 細(xì)菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基量為12萬(wàn)毫升，接種細(xì)菌種子液2400 mL。接種完畢后，37 ℃靜止培養(yǎng)1 h，然后通入潔凈空氣，以逐漸增大通氣量的方法進(jìn)行培養(yǎng)。通氣量根據(jù)溶氧量來(lái)設(shè)置調(diào)整，2～3 h小氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量設(shè)置在50%，在通氣培養(yǎng)至4～6 h，逐步增大氣量，溶氧量60%～100%(即培養(yǎng)至第4小時(shí)溶氧量設(shè)置為60%，培養(yǎng)至第5小時(shí)溶氧量調(diào)整到80%，通氣培養(yǎng)至第6小時(shí)開(kāi)始溶氧量調(diào)整到100%)。培養(yǎng)至6 h后，全部按氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量100%設(shè)定進(jìn)行通氣培養(yǎng)至第15小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束。從第4小時(shí)開(kāi)始，每小時(shí)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測(cè)定EO630株的生長(zhǎng)曲線。

本次傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)的試驗(yàn)共進(jìn)行4次重復(fù)，根據(jù)各個(gè)時(shí)段的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果取平均數(shù)，最終確定該傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線。

2.3.3 分段補(bǔ)料法發(fā)酵培養(yǎng) 細(xì)菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基量為10萬(wàn)毫升，接種細(xì)菌種子液2000 mL。接種完畢后，37 ℃靜止培養(yǎng)1 h，然后通入潔凈空氣，以逐漸增大通氣量的方法進(jìn)行培養(yǎng)。通氣量根據(jù)溶氧量來(lái)設(shè)置調(diào)整，2～3 h小氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量設(shè)置在50%，在通氣培養(yǎng)第4～6小時(shí)時(shí)，逐步增大氣量，溶氧量設(shè)置為60%～100%(即培養(yǎng)第4小時(shí)溶氧量設(shè)置為60%，培養(yǎng)第5小時(shí)溶氧量調(diào)整到80%，培養(yǎng)第6小時(shí)溶氧量調(diào)整到100%)。培養(yǎng)至6 h后，全部按氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量設(shè)定為100%來(lái)進(jìn)行通氣培養(yǎng)，待培養(yǎng)至第15小時(shí)時(shí)培養(yǎng)結(jié)束。在通氣培養(yǎng)第8小時(shí)和第10小時(shí)，分別添加10%經(jīng)滅菌的新鮮培養(yǎng)基(即分別添加1萬(wàn)毫升、1.1萬(wàn)毫升經(jīng)滅菌的新鮮培養(yǎng)基)。從第4小時(shí)開(kāi)始，每小時(shí)取樣并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測(cè)定EO630株的生長(zhǎng)曲線。

本次分段補(bǔ)料法的試驗(yàn)共進(jìn)行4次重復(fù)，根據(jù)各個(gè)時(shí)段的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果取平均數(shù)，最終確定該分段補(bǔ)料法發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

2.3.4 分段補(bǔ)料法制備抗原、疫苗 通過(guò)用分段補(bǔ)料法和傳統(tǒng)工藝分別發(fā)酵培養(yǎng)4批進(jìn)行比較，摸索分段補(bǔ)料的發(fā)酵工藝。按2.3.3項(xiàng)的方法測(cè)定的生長(zhǎng)曲線可以看出，在培養(yǎng)至第12～13小時(shí)時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高峰。

根據(jù)摸索的分段補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)工藝共制備了5批EO630株抗原，選擇在培養(yǎng)第12小時(shí)時(shí)即結(jié)束培養(yǎng)時(shí)收獲抗原，并取樣分別進(jìn)行純粹檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)，按《規(guī)程》中規(guī)定的方法進(jìn)行配苗、凍干。

2.3.5 質(zhì)量檢驗(yàn) 對(duì)每批疫苗在凍干前后分別隨機(jī)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)疫苗的凍干存活率，并按《藥典》標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)疫苗進(jìn)行安全、效力等質(zhì)量檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果 用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝和分段補(bǔ)料法分別培養(yǎng)EO630株，每個(gè)時(shí)段的活菌計(jì)數(shù)見(jiàn)表1。

3.2 生長(zhǎng)曲線 兩種方法培養(yǎng)EO630株所得生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1所示。

3.3 分段補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備抗原的結(jié)果 分段補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備EO630株抗原見(jiàn)表2，培養(yǎng)至12 h收獲平均菌數(shù)為117 億/mL。分段補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備EO630株疫苗生產(chǎn)情況見(jiàn)表3，5批疫苗凍干后的平均存活率為69%，安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)均合格。

圖1 生長(zhǎng)曲線Fig 1 Growth curve

4 小結(jié)與討論

4.1 由表1可以看出，根據(jù)傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝制備EO630株抗原，在培養(yǎng)6～10 h時(shí)活菌數(shù)增長(zhǎng)很快，培養(yǎng)第10～11小時(shí)時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最高峰，之后活菌數(shù)逐步下降，活菌數(shù)平均為6.8×109CFU/mL。根據(jù)分段補(bǔ)料工藝制備EO630株抗原，在培養(yǎng)6～12 h時(shí)，活菌數(shù)都一直保持較快的生長(zhǎng)速度，在培養(yǎng)至12～13 h時(shí)，菌液的生長(zhǎng)達(dá)到菌高峰，之后繼續(xù)培養(yǎng)，活菌數(shù)呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)，活菌數(shù)平均為1.19×1010CFU/mL，與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝相比，其活菌數(shù)有大幅度的增長(zhǎng)，增菌效果明顯。

4.2 由表2可以看出，采用分段補(bǔ)料工藝制備的5批EO630株抗原，在培養(yǎng)12 h時(shí)收獲抗原，菌液活菌數(shù)穩(wěn)定在1.08×1010～1.26×1010CFU/mL之間，菌液的平均活菌數(shù)為1.17×1010CFU/mL。該活菌數(shù)和測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí)長(zhǎng)菌高峰期的菌數(shù)基本吻合，表明該工藝還是比較穩(wěn)定的。

4.3 由表3可看出，采用分段補(bǔ)料法制備5批EO630株抗原用于生產(chǎn)疫苗，凍干后疫苗的細(xì)菌存活率穩(wěn)定在67%～73%之間，凍干后的平均存活率為69%，疫苗的安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)均合格，表明該工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量是穩(wěn)定的，可以降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本，有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

在效力檢驗(yàn)中，由于試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異，攻毒菌數(shù)會(huì)略有差異。在文中的5批疫苗的效力檢驗(yàn)中，對(duì)照成立，而保護(hù)率有3批為10/10，2批為9/10，但都超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的80%。

4.4 馬丁肉湯干粉培養(yǎng)基產(chǎn)品具有性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于保證豬多殺性巴氏桿菌(EO630株)抗原質(zhì)量穩(wěn)定有重要作用[4]。由于各個(gè)企業(yè)的設(shè)備條件和培養(yǎng)條件有所不同，本試驗(yàn)所述方法對(duì)其他企業(yè)不一定適合，僅作參考[5]。

4.5 細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程的中后期為營(yíng)養(yǎng)消耗最快的時(shí)期，即細(xì)菌增值對(duì)數(shù)期中段添加新鮮培養(yǎng)基，既能補(bǔ)充細(xì)菌增值消耗的營(yíng)養(yǎng)成分，又能稀釋有害代謝產(chǎn)物，延長(zhǎng)細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，可大幅度提高培養(yǎng)菌數(shù)。本試驗(yàn)對(duì)補(bǔ)充不同比例的培養(yǎng)基量以及補(bǔ)料時(shí)間段未作更多的試驗(yàn)，活菌數(shù)是否會(huì)隨著培養(yǎng)基的補(bǔ)充量增加而提高，有待進(jìn)一步的研究[6]。

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(編輯：侯向輝)

Production of SwinePasteurellamultocidaVaccine(Live，Strain EO630) by Section Feeding Method

XIAO Hua-chun1, WANG Cheng-ye1, LU You-fei2, ZHANG Xiao-ming3, ZHONG Zhi-ming3, FENG Yu-ning4, CHEN Li-li4, LI Yuan-mei4

(1.YunnanBiologicalProductsCo.Ltd,Kunming650503,China; 2.GuangxiAgriculturalVocationalCollege,Nanning530007,China; 3.GuangxiLiyuanBiotechCompanyLimited,Nanning530001,China; 4.AnhuiDivinityBiologicalProductsCo.Ltd,Bozhou,Anhui236800,China)

In order to improve the swinePasteurellamultocida(also called pig lung disease) vaccine(live, strain EO630) antigen preparation technology, and improve production efficiency and product quality, production efficiency and product quality，this experiment used segmented fed batch fermentation technology to produce to improve the swinePasteurellamultocidaliving vaccine (strain EO630) antigen, the living bacteria count reaches peak time at the 12～13 hours after incubation, and the highest living bacteria count is 1.31×1010CFU/mL. producing 5 batches of antigen by segmented fed-batch fermentation, obtain antigen after 12 hours incubation. The average living bacteria count is 1.17×1010CFU/ml. Formulate the vaccine and freeze-dry 5 batch of vaccine. The average survival rate is 69% after freeze-dry. Safety test and potency test were qualified to achieve the desired results. All the results are qualified with anticipated effect. Compared with the traditional method, the living bacteria count by this method substantially increased with obvious advantages.

PasteurellamultocidaEO630 strain；traditional fermentation process；sub-fed fermentation process；living bacteria count；growth curve；survival rate after freeze-dry

肖華春，學(xué)士，工程師，從事獸用疫苗生產(chǎn)、研制、質(zhì)量管理工作。E-mail：xhc896@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.03

2017-04-01

A

1002-1280 (2017) 07-0010-05

S859.797