鄧永平,劉曉蘭,*,韓 楊,艾瑞波(.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 6006; 2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江齊齊哈爾 6006)

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中度嗜酸放線菌YY21液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶條件的研究

鄧永平1,2,劉曉蘭1,2,*,韓 楊1,艾瑞波1
(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江齊齊哈爾 161006)

為了提高中度嗜酸放線菌YY21產(chǎn)纖溶酶的產(chǎn)量,本文通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)其液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:發(fā)酵培養(yǎng)基組成為小米粉1.7%,葡萄糖2%,碳酸鈣0.2%,氯化鈉0.5%,蛋白胨0.6%;發(fā)酵條件為250 mL三角瓶裝培養(yǎng)基50 mL,接種量5%,在22 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4 d。在最適條件下,放線菌YY21液體發(fā)酵產(chǎn)物在血纖維蛋白平板上形成溶圈面積可達(dá)到164.38 mm2,較初始產(chǎn)酶活力(溶圈面積87.58 mm2)提高了88%,發(fā)酵時(shí)間縮短了3 d。通過對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的研究有效地提高了中度嗜酸放線菌YY21產(chǎn)纖溶酶的產(chǎn)量。

中度嗜酸放線菌YY21,纖溶酶,液體發(fā)酵,發(fā)酵條件

血栓栓塞性疾病嚴(yán)重危害人類健康,已知構(gòu)成血栓的主要成分是纖維蛋白,其由纖維蛋白原通過凝血酶的作用形成,纖維蛋白沉積在血管中形成血栓,導(dǎo)致心肌梗塞和其他心血管疾病[1]。纖溶酶或纖溶酶原激活劑可以直接或間接溶解血纖維蛋白[2]。纖溶酶原激活劑如鏈激酶、尿激酶、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)已被臨床用于治療血栓栓塞性疾病。然而,這些纖溶酶原激活劑類藥物還存在諸多弊端,如引起出血并發(fā)癥、半衰期短、過敏反應(yīng)等,而且價(jià)格較高[3]。因此,需要積極地尋找相對(duì)更安全和較低價(jià)格的纖溶酶。

纖溶酶存在于多種動(dòng)物、植物和微生物中[4-6]。微生物種類多樣,生長(zhǎng)周期短,并且發(fā)酵技術(shù)相對(duì)較成熟,可在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的目的產(chǎn)物[7],因此,微生物發(fā)酵法成為開發(fā)新型纖溶酶的主要方法。已經(jīng)從多種微生物代謝產(chǎn)物中分離到了纖溶酶。例如,已見報(bào)道的源自細(xì)菌的納豆激酶(NK)[8]、枯草激酶(CK)[9]等,源自中華根霉[10]、鐮刀霉[11]、枯青霉[12]、好食脈孢霉[13]等霉菌的纖溶酶,源自金針菇[14]、蛹蟲草[15]等大型真菌的纖溶酶,以及源自鏈霉菌[16]的纖溶酶。

國(guó)內(nèi)外對(duì)放線菌產(chǎn)纖溶酶的研究甚少,僅限于鏈霉菌。Bono等[17]從鏈霉菌(Streptomycessp.)發(fā)酵液中獲得了纖溶酶。武臨專等[18]對(duì)產(chǎn)纖溶酶的鏈霉菌C3662進(jìn)行了鑒定。Chitte等[19-20]依次對(duì)嗜熱鏈霉菌纖溶酶的發(fā)酵和純化進(jìn)行了研究,獲得了高純度的纖溶酶。Ju等[21]對(duì)鏈霉菌纖溶酶進(jìn)行了分離純化,并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。放線菌種類繁多,代謝類型多樣,對(duì)其產(chǎn)纖溶酶的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,特別是對(duì)一些有特殊生活習(xí)性的放線菌的代謝產(chǎn)物的研究還有很大的空間[22]。

嗜酸放線菌(Acidophilicactinomycetes)廣泛分布于酸性環(huán)境中,可以產(chǎn)生耐酸的胞外酶,如幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、淀粉酶等,在酸性土壤有機(jī)物的降解循環(huán)中起著重要作用。此外,由于大多數(shù)真菌適宜于酸性環(huán)境中生存,所以嗜酸放線菌也是極具潛力的抗真菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生者[23]。從嗜酸放線菌的代謝產(chǎn)物中開發(fā)新的天然生物活性物質(zhì),對(duì)新型藥物的開發(fā)具有重要意義。在前期研究中,筆者發(fā)現(xiàn)中度嗜酸放線菌YY21的代謝產(chǎn)物中存在較高活力的纖溶酶[24]。本文對(duì)中度嗜酸放線菌YY21液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究,以期獲得高產(chǎn)纖溶酶的發(fā)酵工藝,為該酶的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ),為纖溶酶提供新的來源。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

中度嗜酸放線菌菌株YY21(Actinomycetesp.) 保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,保藏號(hào)CGMCC No.5816;牛血纖維蛋白原、牛凝血酶 為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血研所產(chǎn)品;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;GYM固體培養(yǎng)基 葡萄糖0.4%,酵母膏0.4%,麥芽浸膏1%,碳酸鈣0.1%～0.2%,瓊脂1.8%,pH6.7;GYM液體培養(yǎng)基 葡萄糖0.4%,酵母膏0.4%,麥芽浸膏1%,碳酸鈣0.1%～0.2%,pH6.7;小米粉培養(yǎng)基 小米粉2%,葡萄糖2%,碳酸鈣0.2%,氯化鈉0.5%,蛋白胨0.3%,pH7.2-7.4;高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基 可溶性淀粉2%,KNO30.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,NaCl 0.05%,K2HPO40.05%,Fe2(SO4)30.001%,pH7.4;黃豆粉培養(yǎng)基 蔗糖 2%,黃豆粉 2%,pH7.0;豆餅粉培養(yǎng)基 豆餅粉2%,葡萄糖2%,pH自然;玉米黃粉培養(yǎng)基 玉米黃粉2%,葡萄糖2%,pH自然;豆粕粉培養(yǎng)基 豆粕粉2%,葡萄糖2%,pH自然；PDA液體培養(yǎng)基 稱取去皮馬鈴薯200 g,切成小塊,加1000 mL水煮沸30 min,用雙層紗布過濾成清液,加水至1000 mL,然后加入20 g葡萄糖完全溶解,pH自然。

PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;雙層振蕩培養(yǎng)箱DZP-2F 金壇市城西崢嶸儀器廠;pHS-25型酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;himac CF15RX冷凍離心機(jī) 天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 放線菌YY21生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 采用GYM液體培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基,250 mL三角瓶中加入GYM培養(yǎng)基50 mL,將在GYM斜面培養(yǎng)基活化后的菌株接入種子培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng),分別在培養(yǎng)0、6、12、18、24、29、32、34、36、38、40、44、48、52、56、60 h取樣,測(cè)定生物量。

1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的確定 采用八種液體培養(yǎng)基(具體名稱見表1)培養(yǎng)放線菌YY21,250 mL三角瓶中加入液體培養(yǎng)基50 mL,接種量為培養(yǎng)基體積的5%,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng),分別于2、3、4、5、6、7 d取樣,測(cè)培養(yǎng)液pH和纖溶酶的活性。

1.2.3 培養(yǎng)基碳源的確定 以小米粉培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基,分別添加蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和葡萄糖,濃度均為2%,接種量為培養(yǎng)基體積的5%,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d,測(cè)定培養(yǎng)液中纖溶酶的活性。

1.2.4 底物配比的確定 以小米粉為主要碳源,兼做輔助氮源,以蛋白胨為主要氮源,以2%的葡萄糖為速效碳源,小米粉與蛋白胨占培養(yǎng)基中總含量2.3%不變,研究二者添加比例對(duì)產(chǎn)酶活力的影響。

1.2.5 培養(yǎng)條件對(duì)菌株YY21產(chǎn)纖溶酶的影響 通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響菌株YY21液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行研究,包括接種量(接種量分別為1%、3%、5%、7%、10%和15%,在28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d)、培養(yǎng)溫度(培養(yǎng)溫度分別為22、24、26、28、30、32、34、37 ℃,接種量5%,180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d)和搖床轉(zhuǎn)速(轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220 r/min,接種量5%,在28 ℃培養(yǎng)4 d),并且在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中使用最佳條件。

1.2.6 粗酶液的制備 發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液在4 ℃、10000 r/min離心10 min,收集上清液即為粗酶液。

1.2.7 纖溶酶活力的測(cè)定 參照Liu的方法[15],采用血纖維蛋白平板法測(cè)定纖溶酶活力。取10 μL粗酶液點(diǎn)加于平板表面,37 ℃保溫6 h后測(cè)溶圈面積。纖溶酶的活力與其在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積正相關(guān),因此,以水解血纖維蛋白后在平板上形成的溶圈面積大小表示菌株產(chǎn)纖溶酶活力的高低。

1.2.8 生物量的測(cè)定 采用稱干重法[25]。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 利用Excel 2003和SPSS 11.5分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并結(jié)合Duncan氏法做多重比較,實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 放線菌YY21生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

放線菌YY21生長(zhǎng)曲線如圖1所示。在0～12 h內(nèi),菌體生長(zhǎng)處于延遲期。在12 h后,菌體生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,在24 h之后菌體干重增加速率加快,培養(yǎng)36 h時(shí),菌體生物量達(dá)到最大,菌體濃度為0.029 g/mL。隨后,菌體生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入衰亡期。

圖1 放線菌YY21生長(zhǎng)曲線Fig. 1 The growth curve of the strain YY21

處于快速生長(zhǎng)期的菌種酶系活躍,代謝旺盛,可以縮短發(fā)酵的延遲期,最適宜作為發(fā)酵的種子[25]。因此,分別將培養(yǎng)12～36 h的新鮮種子液進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)基為GYM培養(yǎng)基。由圖2可知,接入培養(yǎng)30 h的種子液時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酶活力最高,所以,確定種子培養(yǎng)時(shí)間為30 h。

表1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)放線菌發(fā)酵液pH的影響Table 1 Effect of fermentation time on the pH of the fermentation liquor of the strain YY21

表2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖溶酶活力影響(mm2)Table 2 Effect of fermentation time on the enzyme production of the fermentation liquor of the strain YY21(mm2)

圖2 種齡對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of the age of inoculum on the fibrinolytic enzyme production

2.2 培養(yǎng)基及發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)纖溶酶的影響

采用八種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌YY21,發(fā)酵液pH隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化見表1,發(fā)酵液中纖溶酶活力見表2。

如表1和表2所示,高氏一號(hào)培養(yǎng)基為合成培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)成分簡(jiǎn)單,含有速效碳源和氮源,有利于菌體生長(zhǎng),但是不利于積累代謝產(chǎn)物,而且可能缺乏產(chǎn)酶誘導(dǎo)物,導(dǎo)致其發(fā)酵產(chǎn)物中不含纖溶酶;豆餅粉培養(yǎng)基中也沒有檢測(cè)到酶活力;黃豆粉培養(yǎng)基、玉米黃粉培養(yǎng)基和豆粕培養(yǎng)基中富含蛋白質(zhì),需要經(jīng)酶解為小分子物質(zhì)才可以被菌體利用,導(dǎo)致產(chǎn)纖溶酶周期延長(zhǎng)、酶活力低;同時(shí),由表1可知,在培養(yǎng)菌株YY21過程中,高氏一號(hào)培養(yǎng)基、豆餅粉培養(yǎng)基、玉米黃粉培養(yǎng)基和豆粕粉培養(yǎng)基隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)培養(yǎng)環(huán)境逐漸呈酸性,適合菌體生長(zhǎng),但是并不適合產(chǎn)纖溶酶,GYM、PDA和小米粉培養(yǎng)基的pH維持在中偏堿性,酶活力也較高,由此可以推測(cè)菌株YY21最適產(chǎn)酶pH可能是中偏堿性。GYM、PDA和小米粉培養(yǎng)基發(fā)酵液中纖溶酶活力較高,其中小米粉發(fā)酵液中酶活相對(duì)最高(109.32 mm2),在培養(yǎng)第2 d時(shí)暫時(shí)降低可能是培養(yǎng)基pH下降引起的,隨后pH逐漸又上升至6.5左右,酶活力也隨之升高,培養(yǎng)至第4 d酶活力最高,在血纖維蛋白平板上形成109.32 mm2的溶圈。

小米粉培養(yǎng)基為天然培養(yǎng)基,較GYM培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富,小米含碳水化合物約74%～76%,蛋白質(zhì)9.2%～14.7%,脂肪3.0%～4.6%,并富含維生素B1、B12[26],而且小米來源廣泛,價(jià)格也較葡萄糖、麥芽浸膏(GYM培養(yǎng)基組分)低,從產(chǎn)酶活力以及經(jīng)濟(jì)的角度綜合考慮,最終確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基為小米粉培養(yǎng)基,最佳培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

2.3 碳源對(duì)產(chǎn)纖溶酶的影響

碳源是微生物生長(zhǎng)繁殖需求量最大的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可構(gòu)成菌體及目的產(chǎn)物的碳骨架、為其生長(zhǎng)繁殖提供發(fā)酵能。按干重計(jì)算,一個(gè)典型的細(xì)胞中碳元素約占50%,并且在生物大分子中,碳也是最主要的一種元素。碳源對(duì)產(chǎn)纖溶酶的影響見圖3。

圖3 培養(yǎng)基中碳源種類對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different carbon sources in culture medium on the fibrinolytic enzyme production

如圖3所示,培養(yǎng)基中添加可溶性淀粉時(shí),放線菌YY21產(chǎn)酶效果較差,結(jié)果與嗜熱鏈霉菌S.megasporusSD5[19]、白色鏈霉菌StreptomycesalbusHS1類似[27];葡萄糖為單糖,可以作為速效碳源供菌體生長(zhǎng)代謝之用,與遲效碳源小米粉協(xié)同使用,獲得較好產(chǎn)酶效果,溶圈面積達(dá)到130.5 mm2。葡萄糖對(duì)鏈霉菌C-3662發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶也有促進(jìn)作用[18],但是,抑制某些真菌產(chǎn)酶[28]。對(duì)培養(yǎng)基中添加葡萄糖濃度進(jìn)行研究。如圖4所示,葡萄糖添加量為2%時(shí)酶的活力最高。

圖4 培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of concentration of glucose in culture medium on the fibrinolytic enzyme production

2.4 底物配比的確定

培養(yǎng)基中碳源和氮源的比例(C/N)對(duì)微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成有很大影響。若培養(yǎng)基中氮源過多,會(huì)引起微生物生長(zhǎng)過于旺盛,不利于產(chǎn)物的積累;氮源不足則菌體生長(zhǎng)過慢。碳源供應(yīng)不足時(shí)容易引起菌體衰老或自溶[25]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中小米粉與蛋白胨的添加比例進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

如表3所示,與初始配比比較,C組配比最適宜發(fā)酵產(chǎn)酶,溶圈面積達(dá)到150.17 mm2。H組為沒有添加蛋白胨的小米粉培養(yǎng)基,發(fā)酵液不產(chǎn)酶,而添加蛋白胨的其它組產(chǎn)酶量顯著高于H組(p<0.05),說明蛋白胨或者其酶解產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)纖溶酶可能有一定的誘導(dǎo)作用。F、G兩組為沒有添加小米粉的培養(yǎng)基,纖溶酶活力較添加小米粉的組低,說明,添加小米粉有利于YY21菌株產(chǎn)纖溶酶。由表3確定,培養(yǎng)基中小米粉添加量為1.7%,蛋白胨添加量為0.6%。

表3 小米粉/蛋白胨添加比例Table 3 Different ratio of millet to peptone

2.5 培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)纖溶酶活力的影響

2.5.1 接種量對(duì)酶活力的影響 采用較大的接種量可縮短菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間,使產(chǎn)物的合成提前。但是,接種量過大,可能使菌體生長(zhǎng)過快,培養(yǎng)液粘稠度增加,溶氧不足,從而影響產(chǎn)物的合成;此外,接種量過大也會(huì)導(dǎo)致成本增加。接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響見圖5。

圖5 接種量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum size on the fibrinolytic enzyme production

如圖5所示,接種量5%時(shí)中度嗜酸放線菌產(chǎn)纖溶酶活力最高,增大接種量不能進(jìn)一步提高產(chǎn)酶活力,降低接種量纖溶酶的活力有所降低,因此,選擇5%的接種量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響 當(dāng)微生物生長(zhǎng)繁殖處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí),生長(zhǎng)速度最快,代時(shí)也最短,但此時(shí)的產(chǎn)酶活力并不一定最高。在較高溫度下,細(xì)胞分裂較快,但是持續(xù)時(shí)間短,易老化。而在較低溫度時(shí),細(xì)胞雖然生長(zhǎng)緩慢,但是持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),所以產(chǎn)酶量反而較高。同樣,發(fā)酵速度和溫度之間也有類似關(guān)系[29]。因此,研究不同微生物在生長(zhǎng)或積累代謝產(chǎn)物階段時(shí)的不同最適溫度,對(duì)提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率具有十分重要的意義。溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on the fibrinolytic enzyme production

如圖6所示,溫度對(duì)菌體產(chǎn)酶活力具有較大影響,在22～28 ℃范圍內(nèi),產(chǎn)纖溶酶活力較高,并且較穩(wěn)定,溫度達(dá)到30 ℃時(shí)產(chǎn)酶活力明顯下降(p<0.05),且在30～37 ℃之間,產(chǎn)酶活力普遍較低,可見,溫度升高抑制菌體產(chǎn)酶。通過對(duì)圖6中酶活力的比較,確定最適產(chǎn)酶溫度為22 ℃。嗜熱鏈霉菌S.megasporusSD5的最適培養(yǎng)溫度為55 ℃[19],白色鏈霉菌S.albusHS1的最適產(chǎn)酶溫度為28 ℃[27],與之相比,放線菌YY21纖溶酶的生產(chǎn)能耗更低。

2.5.3 轉(zhuǎn)速對(duì)纖溶酶的影響 放線菌屬于好氧菌,適當(dāng)?shù)奶岣邠u床轉(zhuǎn)速有利于菌體生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)速實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig.7 Effect of rotation speed of erlenmeyer flask on the fibrinolytic enzyme production

由圖7可見,在其他培養(yǎng)條件不變的情況下,降低搖床轉(zhuǎn)速時(shí),酶活力下降,可能是因?yàn)槿苎趿拷档蛯?dǎo)致菌體代謝緩慢,產(chǎn)酶能力下降;提高搖床轉(zhuǎn)速時(shí),溶氧量雖然隨之提高,但是剪切力繼續(xù)增加,使成熟菌絲橫隔間空泡的增大,導(dǎo)致部分菌絲體片斷無(wú)法生長(zhǎng),影響了產(chǎn)酶[20]。由此可確定最佳轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.6 放線菌YY21在GYM培養(yǎng)基和小米粉培養(yǎng)基中液體發(fā)酵產(chǎn)酶活力的比較

在前期研究中采用GYM培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株YY21產(chǎn)纖溶酶,培養(yǎng)條件:GYM培養(yǎng)基,28 ℃,180 r/min,發(fā)酵7 d[24]。本文中使用小米粉培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株YY21,培養(yǎng)條件:小米粉培養(yǎng)基(小米粉1.7%,葡萄糖2%,碳酸鈣0.2%,氯化鈉0.5%,蛋白胨0.6%),5%接種量,22 ℃、160 r/min發(fā)酵4 d。發(fā)酵結(jié)束后離心取上清,測(cè)定纖溶酶活力。結(jié)果表明,菌株YY21在小米粉培養(yǎng)基中產(chǎn)酶的活力明顯高于GYM培養(yǎng)基[溶圈面積(87.58±0.72) mm2],溶圈面積達(dá)到(164.38±0.19) mm2,即酶活提高了88%,而且產(chǎn)酶周期縮短為4 d。

3 結(jié)論

本文以中度嗜酸放線菌YY21為菌種,通過單因素實(shí)驗(yàn),對(duì)其液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。發(fā)酵培養(yǎng)基由1.7%小米粉、2%葡萄糖、0.2%碳酸鈣、0.5%氯化鈉和0.6%蛋白胨組成,液體種子種齡30 h,接種量5%,在22 ℃、160 r/min培養(yǎng)4 d,纖溶酶粗酶液在血纖維蛋白平板上形成溶圈面積可達(dá)到164.38 mm2,比前期使用GYM培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力提高了88%,而且產(chǎn)酶周期縮短了3 d。

中度嗜酸放線菌YY21在pH4～5的環(huán)境中依然可以產(chǎn)纖溶酶,具有開發(fā)為口服的耐胃酸的纖溶酶制劑的潛力,而且產(chǎn)酶溫度較目前已知的一些鏈霉菌產(chǎn)酶溫度低,有利于節(jié)約液體發(fā)酵能耗,對(duì)于進(jìn)一步研究工藝擴(kuò)大有重要意義。

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Study on liquid fermentation conditions for fibrinolytic enzyme production by middle acidophilicActinomycetesp. YY21

DENG Yong-ping1,2,LIU Xiao-lan1,2,*,HAN Yang1,AI Rui-bo1

(1.College of Food and Biotechnology,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China)

In the current study,liquid fermentation medium and culture conditions were studied for fibrinolytic enzyme production from middle acidophilicActinomycetesp. YY21 by single factor experiment. The results showed that the fermentation medium consisted of 1.7% of millet,2% of glucose,0.2% of calcium carbonate,0.5% of sodium chloride and 0.6% of peptone. The optimized fermentation conditions were as follows:50 mL liquid medium in 250 mL flasks,inoculation volume 5%,rotate speed 160 r/min,culture time 4 d and culture temperature 22 ℃. Under the optimized conditions,the degradation zone area ofActinomycetesp. YY21 product by liquid fermentation reached 164.38 mm2in the fibrin plate,increasing by 88% than that of original conditions(87.58 mm2). Meanwhile,the fermentation time was decreased by 3 d. The production of fibrinolytic enzyme from middle acidophilicActinomycetesp. YY21 was enhanced effectively by study of liquid fermentation medium and culture conditions.

middle acidophilicActinomycetesp. YY21;fibrinolytic enzyme;liquid fermentation;fermentation conditions

2017-01-16

鄧永平(1978-)，女，碩士，副教授，研究方向：微生物學(xué)、酶學(xué)，E-mail：913913_monkey@163.com。

*通訊作者:劉曉蘭(1962-)，女，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程、應(yīng)用酶學(xué)，E-mail：liuxiaolan001@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301414)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)14-0131-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.026