徐引弟，李海利，王治方，張青嫻，索延樂，宋振宇

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，濟(jì)源 459000）

牛支原體快速PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用

徐引弟1,2，李海利1,2，王治方1,2，張青嫻1,2，索延樂3，宋振宇3

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，濟(jì)源 459000）

本試驗(yàn)旨在建立一種可直接從病料中快速檢測(cè)牛支原體的PCR方法，并且應(yīng)用于臨床。根據(jù)牛支原體16S rRNA 基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，配制PCR擴(kuò)增體系，樣品經(jīng)簡單處理后加入體系進(jìn)行擴(kuò)增，最終擴(kuò)增出1 390bp片段，進(jìn)一步的試驗(yàn)證明該方法具有良好的特異性和敏感性。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法的檢出率與傳統(tǒng)PCR的符合率為100%。試驗(yàn)表明，該方法能快速直接從臨床樣品中檢測(cè)出牛支原體，可用于牛支原體的大量臨床樣品的檢測(cè)。

快速直接PCR；牛支原體；特異性；敏感性；臨床應(yīng)用

牛支原體.(Mycoplasma.bovis).主要引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎、生殖道炎癥以及流產(chǎn)和不孕等疾病。1961年，.美國人Hale等首次從患乳房炎奶牛的牛奶中分離出牛支原體。1976.年牛支原體被描述為致呼吸道疾病的主要病因，之后，牛支原體及其相關(guān)疾病迅速擴(kuò)散至世界各個(gè)國家和地區(qū)的牛群，對(duì)世界養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展造成了極大的威脅和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1～3]。2008年以來，我國多地相繼發(fā)生并廣泛流行以發(fā)熱、咳嗽和流鼻涕為主要癥狀、以壞死性肺炎為主要病變的牛呼吸道傳染病，后被確定為牛支原體感染所致的牛支原體肺炎。由于該病的常規(guī)藥物療效不佳，且無有效疫苗進(jìn)行預(yù)防，因此給我國的養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4～6]。

由于牛支原體病的臨床癥狀無特殊性，在臨床上極易與其他疾病相混淆，因此，目前牛支原體的診斷主要靠實(shí)驗(yàn)室診斷。實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷等。其中，病原學(xué)診斷最為確實(shí)，但耗時(shí)較長；血清學(xué)方法診斷的靈敏度低，非特異性高[7～10]。

因此，建立快速、靈敏和特異的牛支原體檢測(cè)方法，對(duì)牛支原體引起的疾病進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確診斷和有效控制，具有重要意義。本試驗(yàn)建立了直接從病料中擴(kuò)增牛支原體的方法，該方法簡單、快速、特異、敏感，可以用于臨床樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病料

病料采自河南省發(fā)生呼吸道疾病、子宮內(nèi)膜炎、乳房炎、流產(chǎn)等疾病的患牛，包括肺、淋巴結(jié)、子宮積液、牛奶和鼻咽拭子。陽性對(duì)照為牛支原體HB0801株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)郭愛珍教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

2×Direct.PCR.Mix、Hot.Start.Taq酶、Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中牛支原體16S.rRNA基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由上海生物工程有限公司合成，引物序列：上游引物P1：5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’，下游引物P2：5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增的目的片段為1390bp。

1.4 直接PCR方法的建立

1.4.1.樣品的采集

固體病料采集：無菌條件下采集肺、淋巴結(jié)10～100mg，裝入無RNA酶污染的離心管中備用；液體病料采集：直接采集子宮積液、牛奶用于試驗(yàn)。鼻咽拭子采集鼻咽液后，裝入無RNA酶污染的離心管中備用。

1.4.2.樣品處理

鼻咽拭子中加入200μL滅菌ddH2O，擠壓后棄掉拭子。固體狀病料樣品取2mg，研磨后加入20μL滅菌ddH2O，震蕩混勻，快速渦旋數(shù)秒，取1μL上清作為模板。

1.4.3.直接PCR

20μL反應(yīng)體系樣品：上清1μL，2×Direct.PCR. Mix.10μL，10.pM.P1.1μL，10.pM.P2.1μL，5U/μL. Hot.Strart.Taq酶0.5μL，加滅菌ddH2O至20μL，充分混勻，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照分別取1μL加入19μL. PCR擴(kuò)增試劑；PCR擴(kuò)增程序：98℃.30s，35個(gè)循環(huán)（98℃.5s、55℃.5s、72℃.5s），最后72℃.1min；取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。

1.5 特異性試驗(yàn)

將已分離鑒定的豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、波氏桿菌、沙門氏菌培養(yǎng)，取單菌落溶于20μLddH2O，取1μL加入直接PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。

1.6 靈敏性試驗(yàn)

樣品處理后，取1μL上清作為模板，依次10倍稀釋至10-5，各取1μL作為模板進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增，確定其敏感性。

1.7 臨床應(yīng)用

從發(fā)生臨床典型癥狀的病牛采集鼻拭子57份，按照試劑盒說明進(jìn)行操作，直接PCR后進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示陽性32份，同時(shí)，提取樣品DNA進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，分析比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接PCR方法的建立

樣品經(jīng)過簡單處理，加入直接PCR擴(kuò)增體系，擴(kuò)增出約為1.390bp的片段，符合預(yù)期大小，陽性對(duì)照也擴(kuò)增出1.390bp條帶，陰性對(duì)照沒有條帶（如圖1）。將陽性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，通過比對(duì)，與牛支原體HB0801-P180株（Genbank.no.CP007591）同源性為100%。

圖1 直接PCR擴(kuò)增的結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn)

將幾種病原菌用同樣方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均未擴(kuò)增出條帶，只有含牛支原體的陽性病料擴(kuò)增出特異性條帶（圖2），證實(shí)該方法有較好的特異性。

圖2 特異性檢測(cè)結(jié)果

2.3 靈敏性試驗(yàn)

將模板進(jìn)行10倍稀釋擴(kuò)增（如圖3），模板稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5時(shí)，均能擴(kuò)增出清晰條帶，證明該方法檢測(cè)的敏感度為10-4，敏感性好。

圖3 敏感性檢測(cè)結(jié)果

2.4 臨床應(yīng)用

檢測(cè)臨床樣品57份，直接PCR法檢出陽性32份，與常規(guī)PCR結(jié)果一致（如圖4），與常規(guī)PCR符合率為100%，證實(shí)本方法適合臨床樣品的快速檢測(cè)。

圖4 PCR的臨床應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果

3 討論

牛支原體PCR檢測(cè)方法具有較好的敏感性和特異性，是臨床病原學(xué)診斷中較為普遍的一種方法。但是傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法需要樣品裂解、DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)等步驟，需時(shí)5h以上，從支原體臨床分離培養(yǎng)到純化及DNA提取擴(kuò)增至少需要3～4d才能做出初步鑒定。傳統(tǒng)的PCR和分離鑒定不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且敏感性差，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，不利于養(yǎng)殖戶和規(guī)?；髽I(yè)快速、準(zhǔn)確、及時(shí)地診斷病原及采取相應(yīng)的應(yīng)對(duì)措施[7～10]。

本試驗(yàn)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，建立了一種快速的直接檢測(cè)牛支原體的PCR方法，樣品經(jīng)簡單處理后，可直接擴(kuò)增，快速反應(yīng)，整個(gè)過程在1h內(nèi)就可完成，檢測(cè)迅速，特性異強(qiáng)，靈敏性佳。從臨床應(yīng)用情況看，該方法能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出牛支原體。

牛支原體在河南省發(fā)病牛場中發(fā)病率較高，在呼吸道疾病、子宮內(nèi)膜炎病例中陽性率很高，同時(shí)又與其他病原混合感染且耐藥性強(qiáng)，這與之前其他報(bào)道的高發(fā)病率是相符的[11～15]。應(yīng)用本試驗(yàn)的方法，可對(duì)牛支原體感染的單個(gè)樣品檢測(cè)，也可對(duì)臨床病例中的混合感染進(jìn)行檢測(cè)，可用于牛支原體普查、分子流行病學(xué)調(diào)查及疫苗篩選和監(jiān)測(cè)。

[1] 王海勇,武華. 牛支原體研究進(jìn)展[J]. 中國奶牛, 2014,7:36-41.

[2] 郭雨絲,陳穎鈺,趙剛,等. 牛支原體病研究進(jìn)展[J]. 中國奶牛, 2015,14:36-41.

[3] Bürki S, Frey J, Pilo P. Virulence,persistence and dissemination of Mycoplasma bovis[J]. Vet Microbiol, 2015,179(1-2):15-22.

[4] 辛九慶,李媛,郭丹,等. 國內(nèi)首次從患肺炎牛肺臟中分離到牛支原體[J]. 中國預(yù)防獸學(xué)報(bào), 2008,30(9):661-664.

[5] 石磊,龔瑞,尹爭艷,等. 肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的診斷[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,27(5):629-633.

[6] 冉智光,謝建華,駱璐,等. 我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體診斷[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010, 32(1):40-43.

[7] 莊金秋,梅建國,劉吉山,等. 牛支原體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 中國奶牛, 2017,7:30-34.

[8] 李彥芹. 牛支原體PCR檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用[D]. 泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[9] 胡國明. 基于脂蛋白P48的牛支原體快速檢測(cè)方法的建立[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[10] Sun Z, Fu P, Wei K, et al. Identification of novel immunogenic proteins from Mycoplasma bovis and establishment of and indirect ELISA based on recombinant E1 beta subunit of the pyruvate dehydrogenase complex[J]. PLoS ONE, 2014, 9(2):e88328.

[11] 肖淦文,彭清潔,崔朋,等. 肉牛牛支原體肺炎感染的細(xì)菌學(xué)研究[J]. 中國牛業(yè)科學(xué), 2012,38(3):22-26.

[12] Kong LC, Gao D, Jia BY, et al. Antimicrobial susceptibility and molecular characterization of macrolide resistance of Mycoplasma bovis isolates from multiple provinces in China[J].Vet Med Sci,2016,78(2):293-296.

[13] 李巖,姚永進(jìn),范偉興,等. 新疆地區(qū)規(guī)模化奶牛場牛支原體流行病學(xué)調(diào)查[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2013, 21(5):68-71.

[14] 劉威,袁芳艷,周丹娜,等. 牛支原體湖北株的分離鑒定及其oppF基因的進(jìn)化分析[J]. 湖北畜牧獸醫(yī), 2016,37(9):5-6.

[15] 賀晨飛,Riaz Mustafa,陳穎鈺,等.牛支原體體外藥物敏感性分析[J]. 中國奶牛, 2015,16:132-35.

Development and Application of Rapid and Direct PCR Method of Mycoplasma Bovis

XU Yin-di1,2, LI Hai-li1,2, WANG Zhi-fang1,2, ZHANG Qing-xian1,2, SUO Yan-le3, SONG Zhen-yu3
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002; 2.Henan Key Laboratory of Farm Animal Breeding and Nutritional Regulation, Zhengzhou 450002; 3.Animal Health Inspection in Jiyuan City Henan Province, Jiyuan 459000)

The aim of this study was to develop a rapid and direct PCR method to detect Mycoplasma bovis from diseased materials. A pair of primers were designed according to the sequence of 16S rRNA gene of Mycoplasma bovis, and the system of direct PCR amplification was prepared. After simple treatment, the samples were added into the system for amplification and electrophoresis. A 1390 bp fragment was amplified, and the specificity and sensitivity were tested. The results showed that the method was specific and sensitive. The method was applied to detect clinical samples, and the detection rate was 100% conform with the traditional PCR. The method can directly detect Mycoplasma bovis from clinical samples and can be used for the detection of a large number of clinical samples of Mycoplasma bovis.

Rapid and direct PCR method; Mycoplasma bovis; Specificity; Susceptibility; Clinical application

S858.23

A

1004-4264（2017）06-0041-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.010

2017-03-18

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（162102110042）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2016ZC51，2017ZC49）。

徐引弟（1974-），女，湖北浠水人，副研究員，博士，主要從事動(dòng)物病原微生物研究。