李濤

摘 要：趨化是生物體朝向或遠(yuǎn)離化學(xué)物質(zhì)的一種運(yùn)動(dòng)形式。假單胞菌可感受周圍化學(xué)物質(zhì)濃度變化，通過極性鞭毛、菌毛驅(qū)動(dòng)表現(xiàn)其群體趨化行為。已知假單胞菌趨化主要是由鞭毛介導(dǎo)和假定菌毛介導(dǎo)兩種，本文主要闡述這兩種趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，總結(jié)了研究趨化行為的各種定性和定量的常規(guī)方法及新方法，以期為假單胞菌趨化性研究提供參考。

關(guān)鍵詞：趨化；假單胞菌；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

中圖分類號(hào)：Q939.11+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.08.02

Abstract： Chemotaxis was a form of motion in which organisms move toward or away from chemicals. Pseudomonads could sense changes in the concentration of surrounding chemicals， and exhibit a chemotaxis mediated by flagella or pili. Two kinds of chemotaxis pathways has been described in this review， a flagella-mediated pathway and a putative pili-mediated system. This article mainly introduced the two kinds of chemotaxis signal transduction pathway， and summarized the conventional and new methods of qualitative and quantitative assay on chemotaxis， in order to provide a reference for pseudomonas chemotaxis research.

Key words： chemotaxis， Pseudomonads， signal transduction

1 趨化作用及細(xì)菌趨化介紹

趨化是生物體朝向或遠(yuǎn)離化學(xué)物質(zhì)的一種運(yùn)動(dòng)形式，這一現(xiàn)象普遍存在于動(dòng)物、植物及微生物中[1]。趨化作用是生物體為適應(yīng)周圍環(huán)境變化，方便其從環(huán)境中攝取食物并躲避危害，從而使自身具備生存優(yōu)勢(shì)的重要行為。

運(yùn)動(dòng)細(xì)菌作為微生物中的典型代表，同樣具有趨向某些化學(xué)引誘劑的正趨化及遠(yuǎn)離某些化學(xué)驅(qū)逐劑的負(fù)趨化行為[2]。19世紀(jì)末，Engelmann等生物學(xué)家即發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌向氧氣、礦物質(zhì)及有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的趨化。他們?cè)陲@微鏡下觀察到細(xì)菌菌液趨向或遠(yuǎn)離氣泡及化學(xué)物質(zhì)的現(xiàn)象。早期的研究主要集中于趨化現(xiàn)象的觀察，對(duì)于細(xì)菌趨化機(jī)制的了解少之又少。直至1969年Adler[3]通過大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)菌的趨化作用是由趨化物質(zhì)直接刺激引發(fā)，而且是由趨化特異性受體所介導(dǎo)的。自此開始，各國(guó)科學(xué)家紛紛采用各種技術(shù)手段如：平板點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)（Drop assay）、游動(dòng)平板法（Swarm plate assay）、毛細(xì)管法（Capillary assay）、數(shù)量分析法（Quantification assay）[4]等，分析細(xì)菌的趨化行為，并在分子生物學(xué)水平上研究參與細(xì)菌趨化作用的基因決定簇，闡明其趨化機(jī)制。根據(jù)趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式將趨化行為分為兩大類，即：代謝依賴型趨化（metabolism-dependent chemotaxis）及非代謝依賴型趨化（metabolism-independent chemotaxis）[5]。

2 假單胞菌的趨化作用

假單胞菌（Pseudomonas）為需氧革蘭氏陰性棒狀菌，屬變性菌。其代謝多樣性驚人：可降解和代謝多種分子，因此其可能成為病原菌。假單胞菌長(zhǎng)約1～5 μm，可被極性鞭毛、菌毛驅(qū)動(dòng)或通過聚集、滑動(dòng)來表現(xiàn)其群體行為，與細(xì)菌相似同樣具有趨化作用[6]。目前文獻(xiàn)報(bào)道其趨化主要是由鞭毛介導(dǎo)和假定菌毛介導(dǎo)兩種[7]。

2.1 鞭毛介導(dǎo)的趨化

假單胞菌由鞭毛介導(dǎo)的趨化作用是靠其鞭毛旋轉(zhuǎn)引起的，鞭毛旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的力量可使細(xì)菌個(gè)體向前移動(dòng)，其旋轉(zhuǎn)模式為逆時(shí)針→順時(shí)針→暫停→逆時(shí)針（CCW-CW-P-CCW）。當(dāng)鞭毛確定對(duì)一種化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)，其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)頻率就會(huì)降低。已研究清楚的雙組分趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是通過對(duì)不同配體的感應(yīng)，借助與配體結(jié)合的受體將信號(hào)轉(zhuǎn)換為基于激酶催化的路徑，此信號(hào)轉(zhuǎn)換引起鞭毛旋轉(zhuǎn)，隨后引發(fā)一系列與趨化有關(guān)的蛋白甲基化。此趨化反應(yīng)的特異性主要取決于配體結(jié)合受體結(jié)構(gòu)域（LBR）。

2.2 假定菌毛介導(dǎo)的趨化

假單胞菌假定抽搐移動(dòng)機(jī)制是基于Ⅳ型菌毛的ETRE（延伸-拘束-收縮-延伸）。當(dāng)菌體對(duì)某種化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，可能基于與大腸桿菌菌毛結(jié)構(gòu)的同源性，假單胞菌以菌毛收縮和伸長(zhǎng)抽搐從細(xì)胞的一端移向另一端。鞭毛介導(dǎo)的趨化中的雙組份信號(hào)系統(tǒng)的組成和功能同樣適用于菌毛介導(dǎo)的趨化過程。但此趨化過程細(xì)節(jié)及機(jī)理尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

3 假單胞菌趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

3.1 鞭毛介導(dǎo)的游動(dòng)性趨化信號(hào)傳導(dǎo)途徑

此途徑最主要的傳導(dǎo)元件是cheA組氨酸激酶和兩個(gè)cheW蛋白，cheW類似支架和cheA一起控制趨化信號(hào)的接收。mcp上的LBR感應(yīng)引誘劑或驅(qū)逐劑濃度變化后激活cheA的自體組氨酸激酶活性。引誘劑濃度增加可使cheA活性喪失，鞭毛順時(shí)針旋轉(zhuǎn)頻率下降；而驅(qū)逐劑濃度增加（或引誘劑濃度減少）會(huì)激活cheA活性，鞭毛順時(shí)針旋轉(zhuǎn)頻率上升。鞭毛順時(shí)針旋轉(zhuǎn)可隨機(jī)調(diào)整細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)可使細(xì)胞在特定時(shí)間內(nèi)在同一方向上移動(dòng)（即游動(dòng)），而在谷草芽孢桿菌中與此機(jī)制相反。目前不清楚假單胞菌屬cheA自激酶活性調(diào)節(jié)是與大腸桿菌還是枯草芽孢桿菌相似，還是與前兩者完全不同。

mcp的甲基化水平由cheR和cheB的競(jìng)爭(zhēng)作用決定。cheR可使mcp甲基化，而cheB作用相反，其自身活性則靠磷酸化作用調(diào)節(jié)。cheA的磷酸化可激活cheB-R， cheB可與cheR競(jìng)爭(zhēng)性地脫去mcp上的甲基。cheY接受cheB上的磷酸基團(tuán)變?yōu)閏heY-P，cheY-P與蛋白FliM、FliN相互作用，驅(qū)動(dòng)鞭毛馬達(dá)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)；cheZ可使cheY-P脫磷酸化，cheY可使鞭毛逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)。圖1（a）Swimming中左上側(cè)部分的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)與鞭毛逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)有關(guān)，右上側(cè)部分的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)與鞭毛順時(shí)針旋轉(zhuǎn)有關(guān)。

3.2 假定菌毛介導(dǎo)的抽搐性趨化信號(hào)傳導(dǎo)途徑

此途徑中的mcp甲基化水平是由類似于具有轉(zhuǎn)甲基化功能的cheR的PilK及類似于具有脫甲基化功能的cheB的ChpB蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地調(diào)節(jié)。

信號(hào)傳導(dǎo)組件是由類似于cheA自體組蛋白激酶活性的ChpA和類似于兩個(gè)cheW的同系物PilI和ChpC組成。其過程與鞭毛介導(dǎo)的游動(dòng)趨化途徑相似，化學(xué)效應(yīng)器mcp可感應(yīng)到引誘劑和驅(qū)逐劑的濃度變化，調(diào)節(jié)ChpA自體組氨酸激酶活性，ChpA自體磷酸化驅(qū)動(dòng)Ⅳ型菌毛馬達(dá)從而控制菌體的抽搐移動(dòng)，磷酸化與脫磷酸化之間是否存在競(jìng)爭(zhēng)作用還有待于進(jìn)一步研究。磷酸化的PilG通過作用于ATP酶PilZ和PilB及二鳥苷酸環(huán)化酶FimX介導(dǎo)菌毛的延伸，另一方面，磷酸化的PilH作用于ATP酶PilT/V介導(dǎo)菌毛的收縮。

圖1（b）Twitching中上半側(cè)部分的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)均與菌毛的伸長(zhǎng)和收縮相關(guān)，假定菌毛介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)用虛線標(biāo)注出來。

4 各類趨化物質(zhì)

趨化現(xiàn)象在各假單胞菌中普遍存在，對(duì)應(yīng)的趨化物質(zhì)也很多樣。除了常見的趨化物質(zhì)如：絲氨酸、天冬氨酸等氨基酸，半乳糖、麥芽糖等糖類，琥珀酸、蘋果酸等有機(jī)酸類及二肽和嘧啶，文獻(xiàn)報(bào)道已有大量的趨化物質(zhì)被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas aeruginosa能對(duì)蘋果酸、檸檬酸[8]和咖啡因[9]產(chǎn)生趨化；Pseudomonas fluorescens可趨向于番茄分泌物[10]；1990年Harwood等[11]發(fā)現(xiàn) Pseudomonas putida可對(duì)氯代苯甲酸產(chǎn)生趨化；1997年Grimm等[12]和2003年Zaval Skii等[13]指出Pseudomonas sp.可對(duì)萘和聯(lián)苯產(chǎn)生趨化；2011年發(fā)現(xiàn)了Pseudomonas 屬的一些細(xì)菌可趨向于芳香烴類物質(zhì)[14]。能引起趨化反應(yīng)的效應(yīng)物按其結(jié)構(gòu)進(jìn)行劃分，能引起正趨化反應(yīng)的包括：（a）羧酸類、 （b）氨基酸類、（c）芳香族化合物、（d）聯(lián)苯類、（e）乙烯類、（f）呋喃類、（g）二氯甲烷類、（h）嘧啶堿類、（i）三嗪類 ；能引起負(fù)趨化反應(yīng)的主要為磷脂類和不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸類[7]。

5 趨化試驗(yàn)方法

5.1 趨化定性試驗(yàn)

5.1.1 平板點(diǎn)滴趨化試驗(yàn) 此法取培養(yǎng)好的假單胞菌菌懸液500 mL，8 000 rpm，離心5 min，去上清，使用4 ℃預(yù)冷的趨化緩沖液20 mL沖洗2次，最后懸浮于200 mL細(xì)菌趨化培養(yǎng)基中，每平板加入20 mL該趨化培養(yǎng)基，進(jìn)行平板趨化實(shí)驗(yàn)。將不同的趨化物質(zhì)以固體或液體形式加入平板中央，在一定時(shí)間內(nèi)觀察趨化現(xiàn)象。

圖2為Pseudomonas fluorescens WCS365 對(duì)有機(jī)酸的平板點(diǎn)滴趨化試驗(yàn)，A平板加入趨化緩沖液，B平板加入40 mmoL·L-1 succinic acid，C平板加入100 mmoL·L-1 malic acid，照片拍攝于30 ℃培養(yǎng)30 min后[10]。

5.1.2 游動(dòng)平板分析 采用改進(jìn)的drop assay法：配制稀釋LB固體培養(yǎng)基，在其中加入3.0 mmoL·L-1各類趨化物質(zhì)。收集2 mL LB中培養(yǎng)過夜的假單胞菌菌液，用趨化緩沖液清洗兩次后懸浮至1 mL。將固體稀釋LB倒平板，待其基本凝固后，在平板正中央滴入菌液，點(diǎn)樣量為2 μL，30 ℃培養(yǎng)時(shí)間48 h后觀察趨化現(xiàn)象。

圖3為Pseudomonas fluorescens WCS365、其cheA缺失突變株及無運(yùn)動(dòng)性突變株趨化試驗(yàn)[10]。

5.1.3 顯微觀察趨化現(xiàn)象（改進(jìn)的毛細(xì)管試驗(yàn)）

本試驗(yàn)是將5 cm長(zhǎng)的兩端密封的熔點(diǎn)毛細(xì)管進(jìn)行熔融彎曲成如圖4（a）中的U形，將其放置在一片載玻片上，上面覆蓋上蓋玻片形成小室，小室中充滿可移動(dòng)的菌懸液（收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體，洗滌后重懸于趨化緩沖液，緩沖液中需加入EDTA螯合金屬離子，還可添加少許甘油延長(zhǎng)菌體移動(dòng)時(shí)間），將一支含某種趨化引誘劑的1 μL一次性毛細(xì)管放入此U形小室中，此毛細(xì)管一端用高溫火焰熔封。

可用放大20倍的顯微鏡計(jì)算聚集在毛細(xì)管口的菌體數(shù)目（即定量）。圖4右是用暗視野顯微鏡放大40倍觀察毛細(xì)管口的菌體趨化反應(yīng)，明顯看到管口菌體濃度很高如透明云團(tuán)，此現(xiàn)象可維持1～30 min[7]。

5.2 趨化定量試驗(yàn)

5.2.1 常規(guī)毛細(xì)管法 采用圖4（a）中的方法，將一段熔封的裝有趨化引誘劑的毛細(xì)管插入菌懸液中，靜置30～60 min后將毛細(xì)管移去，用無菌水將其表面沖洗干凈，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至含緩沖液的離心管中，然后將其稀釋涂至平板計(jì)數(shù)，管中趨化物可設(shè)置濃度梯度，通過計(jì)數(shù)可找到相應(yīng)趨化物的最低及最高趨化濃度。

5.2.2 高通量毛細(xì)管法 收集甘油鹽中過夜培養(yǎng)至OD660=0.3～0.45的待測(cè)菌體，采用4 ℃預(yù)冷趨化緩沖液清洗兩次后重懸至15 mL。分別吸取300 μL菌液置于每一微孔板小孔中。配制不同濃度的趨化物質(zhì)溶液，將多根毛細(xì)管用3%瓊脂糖密封后，在真空條件下充滿趨化緩沖液或各類含引誘劑的趨化緩沖液，將此固定在上板中的多根毛細(xì)管翻轉(zhuǎn)插入一系列含300 μL游動(dòng)菌體懸浮液的小孔中，室溫下趨化60～120 min[7]。結(jié)束后從上板中取下趨化毛細(xì)管，將外壁沖洗干凈后，傾出內(nèi)容物至2 mL離心管中。用PBS緩沖液對(duì)內(nèi)容物進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋后涂布固體LB平板，30 ℃培養(yǎng)36 h后計(jì)數(shù)。

如圖5右所示，以趨化物質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)數(shù)所得毛細(xì)管中趨化的菌數(shù)為縱坐標(biāo)做圖，可得出不同趨化物質(zhì)的閾值濃度。

6 結(jié)論與討論

假單胞菌感應(yīng)化學(xué)物質(zhì)濃度梯度后可表現(xiàn)兩種趨化途徑：鞭毛介導(dǎo)和假定菌毛介導(dǎo)的途徑。趨化蛋白可能與一些非趨化功能間存在關(guān)聯(lián)，許多趨化蛋白功能還未可知。隨著研究的進(jìn)一步深入，越來越多的趨化物質(zhì)被不斷發(fā)現(xiàn)，研究趨化性的定性和定量方法不斷革新。研究假單胞菌的趨化性對(duì)于研究其參與動(dòng)植物的一些重要生理過程如發(fā)病機(jī)制、生物修復(fù)、生物防治等具有重要意義。

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