盧嘉文梅玲汪雪玲藺欣吳皓

1上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科

2上海交通大學耳科學研究所

3上海市耳鼻疾病轉化醫(yī)學重點實驗室

·綜 述·

Rabconnectin-3α蛋白在聽神經及毛細胞的病理生理學方面的生物學功能

盧嘉文1,2,3梅玲1,2,3汪雪玲1,2,3藺欣1,2,3吳皓1,2,3

1上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科

2上海交通大學耳科學研究所

3上海市耳鼻疾病轉化醫(yī)學重點實驗室

Rabconnectin-3（rbc3）蛋白是rab小G蛋白家族中的成員之一，有α和β兩個亞基。其中人rbc3α由定位于15號染色體長臂2區(qū)1帶的dmxl-2（dmx like-2）基因編碼，由3036個氨基酸組成，相對分子質量Mr為339,753，包含12個結構域；研究發(fā)現，rbc3α表達于嚙齒類、靈長類動物的腦組織、內耳，并且在斑馬魚側線器官亦有表達。隨著臨床研究的深入，發(fā)現rbc3α蛋白除了會導致聽力下降以外[1]，還與多種疾病相關。例如dmxl-2突變可影響激素治療乳腺癌的效果[2]；與芳香化酶過剩綜合征[3]也有聯系。因此rbc3α的生物學功能成為了近來研究的熱點。本文將對近幾年關于rbc3α在聽神經及毛細胞病理生理學方面的生物學功能的研究進展進行綜述。

rabconnectin3α；dmxl-2；突觸囊泡；聽力下降；生物學功能

【Key words】Rabconnectin3α；Dmxl-2；Synapse Vesicle；Hearing Loss；Biological Function

Thiswork wassupported by grants from the NationalNatural Science Foundation of China(No.81570906),Shanghaiscience and technology comm ission foundation major projects（14DJ1400200）.Shanghai science and technology comm ission foundation（14DZ2260300）.

1 Rbc3α調節(jié)Rab3A的活化及失活

神經遞質在突觸間的傳遞是生命活動中的關鍵一環(huán)，其過程大致可分為遷移、錨定、激活、融合等幾步。Rab3A是rab3家族中的一個成員，在Ca2+依賴的神經遞質的轉運過程中起到重要的作用[4-6]。主要表現為：1，使遷移和錨定的過程更為便捷[7]；2，阻止Ca2+內流導致的囊泡與膜的融合[8]。Rab3A行使這些生物學功能依賴于其自身的周期性活化與失活。

Rab3A活化是指rab3A-GDP通過rab3激活蛋白（rab3GEP，rab3GDP/GTPexchange protein）激活為rab3A-GTP，而rab3A失活則是指rab3A-GTP由于rab3失活蛋白（rab3 GAP，rab3 GTPase-activing protein）的作用回歸到rab3A-GDP的過程。（圖1）

圖1

Fumiko Nagano等[9]通過免疫共沉淀實驗發(fā)現在大鼠腦組織中的腦小血管中，rbc3α蛋白可與rab3GEP和rab3GAP結合（圖1）。不僅如此，研究還發(fā)現在rab3A交替激活和失活的每一輪神經遞質釋放完后，rbc3α會釋放一些諸如“磷酸化”等的調控信息，使得神經遞質從胞質區(qū)遷移入突觸囊泡。這些調控信息對于rbc3α去綁定rab3GEP/GAP是有積極作用的。在rbc3α數量或功能不足的突觸囊泡中，神經遞質在經歷一輪釋放后，不能有效的“回收”入囊泡，稱之為神經遞質循環(huán)的“耗竭”或“再充盈不足”，因此會引起聽覺傳入神經信號傳導的異常。另外，rbc3α也作為一個腳手架蛋白（scaf?folprotein），對rab3GAP/GEP進行錨定和“抓取”作用，這一現象也是學者們取得的共識，但是具體機制仍然不明。

因此，rbc3α與rab3GEP/GAP的功能密切相關，是保障rab3A的活化失活周期得以順利進行的條件，是各類細胞（包括內耳毛細胞突觸囊泡）中神經遞質的胞吐和傳導過程中重要的一環(huán)。

2 Rbc3α調節(jié)V-ATP酶的活性

生理狀態(tài)下，聽覺傳入神經遞質-谷氨酸借助谷氨酸轉運體（vglut3），通過與H+交換進入帶狀突觸囊泡內部。H+在帶狀突觸囊泡空腔內的積聚，即帶狀突觸囊泡的正常酸化是H+與谷氨酸進行轉運的必要條件。H+在囊泡內的蓄積依賴V-ATP酶（V-ATPase，Vacuolar-type H+-ATPase）分解ATP將H+泵入囊泡。因此，V-ATP酶是突觸囊泡正常酸化的關鍵催化劑。（圖2）

圖2

研究發(fā)現Rbc3α與V-ATPase全酶之間存在聯系。Yan Y等[10]通過免疫共沉淀的方法證明了在果蠅卵巢組織的細胞內rbc3復合物（包括rbc3α和rbc3β）與昆蟲V-ATPase胞質區(qū)E、H2個亞基有蛋白交互作用，證明了rbc3α與帶狀突觸囊泡中的V-ATPase是具有聯系的。

進一步研究發(fā)現rbc3α在p3小鼠內耳毛細胞底部呈新月狀分布，其分布同vgult3一致，提示正常數量及功能的rbc3α在帶狀突觸囊泡的胞吐轉運中發(fā)揮作用。換言之，rbc3α數量不足或功能下降將會影響神經遞質的正常轉運。Zev Einhorn等[11]使用了細胞滲透的pH依賴-染料LysoTracker，用之標記細胞酸化的部分。結果顯示：對于野生型的p5小鼠內耳毛細胞中，染料輕易地積聚于帶狀突觸囊泡所在的細胞底部的結果；而在dmxl-2（rbc3α）突變型p5小鼠中，毛細胞底部的熒光信號顯著下降（但并不完全消失），且在整個細胞中呈均勻分布，提示毛細胞底部帶狀突觸區(qū)域酸化障礙。有數據顯示，LysoTracker的信號在pH4~5的環(huán)境下最明顯，說明rbc3α突變后引起了細胞pH的升高。值得注意的是，在同樣的p5野生型小鼠中加入了V-ATPase的特異性抑制劑巴菲霉素（Bafilomycin）1μM后，LysoTracker的熒光信號則幾乎檢測不到。這也許說明了rbc3α可影響V-ATPase的功能，但是并不是影響V-ATPase的唯一因素。

因此，rbc3α與V-ATPase全酶具有關聯，保障了突觸囊泡的酸化，使得vglut3轉運體能正常轉運神經遞質（谷氨酸），從而保證內耳毛細胞聽覺信號的正常傳導。

3 Rbc3α缺乏導致下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂

Juliane Le′ger等[1]在塞內加爾一個近親婚配的家系中發(fā)現，其后代里3個男性青少年表現出了生長發(fā)育遲緩、身高體重偏低、漸進性聽力下降、輕微智障、外周感覺運動神經脫髓鞘等神經內分泌功能紊亂。抽取3位患者的外周血進行高通量二代測序發(fā)現在編碼rbc3α的dmxl2基因區(qū)有15個核苷酸的缺失。為了證實dmxl2（rbc3α）的突變會導致上述表型，Juliane Le′ger等在定量RT-PCR中發(fā)現在c.45824_5838del純合子患者中DMXL2mRNA的量均有顯著減少。強烈提示dmxl2片段缺失、表達量下降會引起生長發(fā)育遲緩等臨床表現。

Brooke Tata等[1]分別用抗rbc3α抗體和抗促性腺激素抗體對垂體促性腺組織中rbc3α和促FSH、促LH、CRH、TRH等細胞進行復合染色。結果在成年大鼠垂體前葉，只有在促LH與促FSH的細胞中才能觀察到rbc3α的免疫染色，這種定位方式類似于Rab3-GAP和Rab3-GEP。而在GHRH、TRH、CRH的細胞中并沒有發(fā)現與rbc3α的共定位。提示rbc3α在下丘腦和垂體中與促LH細胞、促FSH細胞有關聯。

Brooke Tata等[1]設計的能夠重現上述病例的表型純合dmxl2敲除動物模型發(fā)現：雌性KO小鼠體重顯著低于正常對照組；陰道擴張時間（30天）以及初次性成熟時間（37天）明顯晚于同窩的野生型小鼠（28天，29天）；?完整的性周期通常不超過20天，且58%的時間處于發(fā)情間期。以上數據均顯示出了雌性KO小鼠表現出發(fā)育遲緩和生育力低下；而在雄性KO小鼠中，從p25觀察到p60，發(fā)現其睪丸到肛門的距離明顯短于同窩的正常對照小鼠，提示其睪丸發(fā)育不良。

dmxl2-KO小鼠性成熟的障礙也導致了其生殖能力的下降。KO小鼠的睪丸和卵巢組織重量分別低于正常對照小鼠13mg和4.4mg(P<0.001)。在雌性ko小鼠的卵巢組織學分析中顯示，囊狀卵泡的數量正常，而黃體的數量明顯低于同窩正常對照組。雌性KO小鼠的雌激素含量正常，而雄性ko小鼠的睪酮含量則顯著低于其同窩正常對照小鼠。

通過以上數據可以發(fā)現，rbc3α蛋白只表達在促LH與促FSH細胞中，且dmxl2/rbc3α表達量的下降在人類以及實驗動物（C57BL6小鼠）均會引起青春期的發(fā)育功能不良、發(fā)育時間延遲和下丘腦-垂體-性腺軸的紊亂等。

4 Rbc3α對Wnt信號通路的調控

細胞的遷移與人體內各種活動都息息相關。細胞的遷移依賴于細胞-細胞間粘附和信號傳遞的動態(tài)調控。脊椎動物的神經嵴細胞(neural crest cell，NCC)通過上皮間質轉化(epithelial-mesenchy?mal transition,EMT)，即上皮細胞在形態(tài)學上發(fā)生向間質細胞表型的轉變，獲得高度遷移的能力。EMT是惡性腫瘤轉移的標志[12]，也是胚胎早期發(fā)育、器官生成以及傷口愈合中的一個重要過程[13]。經典Wnt信號通路（CanonicalWnt Signaling）作為誘導上皮組織EMT產生的關鍵信號轉導通路是國內外學者的共識[14]。經典Wnt通路（CanonicalWnt Sig?naling／β-catenin通路）主要通過核內β鏈接蛋白（β-catenin）的累積，激活Wnt相關靶基因引起后續(xù)改變。因此，核內β鏈接蛋白正常的活化可以促進胚胎早期發(fā)育（包括內耳毛細胞的發(fā)育[15]），而核內β鏈接蛋白活化過度或者失調可引起腫瘤的形成。

有文獻報道，在NC細胞遷移的過程中，rbc3α也參與了Wnt信號通路的調控[16]。正常情況下，NC細胞膜表面大部分β-鏈接蛋白（β-catenin）與E鈣黏附蛋白（E-cadherin）和細胞骨架蛋白（actin）結合形成穩(wěn)定的復合物，胞質內少量的游離β-鏈接蛋白不能進入核內激活靶點。而在Wnt信號存在時，人低密度脂蛋白受體相關蛋白6（Low-density lipo?protein receptor-related protein 6，LRP6）會被磷酸化。只有當LRP6磷酸后，β-鏈接蛋白才能夠與Wnt蛋白、跨膜受體-7蛋白（Frizzled-7）形成新的復合物，這可使得β-鏈接蛋白進入細胞質，并在胞質內水平得到累積后轉位進入細胞核，調節(jié)靶基因的表達[17]。因此，經典Wnt通路需要細胞質內V-ATPase介導的酸化，這是使LRP6磷酸化的必要條件[18]（圖3）。

圖3

前已述及，rbc3α具有維持細胞pH值的功能。Adam M.Tuttle等[15]在果蠅中的研究發(fā)現低pH值有助于細胞內LRP6的磷酸化，從而使原β-鏈接蛋白復合物解離，并形成新的復合物促進Wnt通路下游的信號。而在rbc3α缺乏的核內體、溶酶體中Wnt信號通路則受到抑制，并表現出遷移速度和遷移持續(xù)性的降低。并且，rbc3α對于frizzle-7在NC細胞膜表面上的固定也有作用。缺乏rbc3α的NC細胞沒有足夠的frizzle-7用以和β-鏈接蛋白形成復合物進入細胞質。Shi Fuxing[19]等發(fā)現，在敲除β-鏈接蛋白（即經典Wnt通路無效）的模型中，內耳毛細胞與柱狀細胞的發(fā)育再生均受到影響。這與我們之前討論的經典Wnt通路促進胚胎早期發(fā)育的觀點是一致的。

另一方面，鈣粘素（cadherin）作為細胞-細胞間粘附分子的調控者之一，具有介導細胞連接和抑制細胞遷移的功能。在缺乏rbc3α或者V-ATPase功能不全的斑馬魚胚胎中發(fā)現，鈣粘素的表達發(fā)生了上調紊亂，同樣致使了NC細胞EMT和遷移的失敗，影響了聽覺上皮細胞的正常作用[16]。

小結以上，rbc3α在Wnt信號通路中有以下作用：1，促進核內體溶酶體的成熟酸化，使LRP6磷酸化后正常激活Wnt信號通路的下游信號，保障內耳毛細胞的發(fā)育；2，固定NC膜表面的frizzle-7;3，正常表達鈣粘素，讓聽覺上皮細胞能夠正常發(fā)揮作用。而V-ATPase及其相關蛋白（rbc3α）的異常會引起Wnt信號通路的異常，從而妨礙毛細胞的發(fā)育和聽覺上皮細胞功能。

5 總結

綜上所述，rbc3α蛋白是神經遞質的轉運和信號傳導過程中重要的一環(huán)；在人的聽覺系統(tǒng)方面，是產生正常的聽覺電信號的必要條件；在內分泌及生長發(fā)育方面，rbc3α的缺乏會導致生長緩慢、不孕不育等不良后果；在Wnt信號通路傳導方面，是讓內毛細胞正常發(fā)育的重要因素。因此，rbc3α蛋白的功能失調可以導致耳聾、生長發(fā)育遲緩、糖尿病等家族遺傳性特征的臨床表現，其危害不容忽視。不過隨著人類基因組計劃的完成，我們已經進入功能基因組學時代，分析特定基因的功能已經成為明確致病機制的關鍵，并且有助于進一步制定基因治療的策略。然而，仍然有一些問題，譬如關于rbc3α作為腳手架蛋白（scaffol protein）去抓取rab3GEP/ GAP的機制等等，目前仍舊不清，有待于科學家們進一步的探索和闡釋。

1 Brooke Tata,Lukas Huijbregts,Nicolas de Roux et,al.Haploinsuffi?ciency of Dmxl2,Encoding a Synaptic Protein,Causes Infertility Associated with a Loss of GnRH Neurons in Mouse.PLoS Biol, 2014,12(9)

2 Monica Faronato,Van T.M.Nguyen.DMXL2 drives epithelial to mesenchymal transition in hormonal therapy resistant breast can?cer through notch hyper-activation Oncotarget,2015,6(26):22467–22479.

3 Fukami M,Horikawa R,Ogata T.Aromatase excess syndrome: identification of cryptic duplications and deletions leading to gain of function of CYP19A1 and assessment of phenotypic determi?nants.JClin EndocrinolMetab,2011,96(6):E1035-1043.

4 Takai,Y,Sasaki,T.,Shirataki,H.etal.Rab3A small GTP-binding protein in Ca(2+)-dependent exocytosis.Genes Cell,1996,1(7): 1615–1632

5 Darchen,F,Goud,B.Multiple aspects of Rab protein action in the secretory pathway:focus on Rab3 and Rab6.Biochimie(Paris), 2000,4(82):375–384

6 Takai Y,Sasaki T,Matozaki T.Small GTP-binding proteins.Physiol.Rev,2001,1(81):153–208

7 Geppert M.,Takei K.,De Camilli,P.et al.The role of Rab3A in neurotransmitter release.Nature,1994,369(6480):493-497.

8 Geppert,M.,Goda,Y.,Stevens,C.F.etal.The small GTP-bind?ing protein Rab3A regulates a late step in synaptic vesicle fusion.Nature,1997,387(6635):810-814.

9 Kawabe H,Sakisaka T,Yasumi MA,et al.Novel rabconnec?tin-3-binding protein that directly binds a GDP/GTP exchangeproteinforRab3AsmallGproteinimplicatedinCa(2+)-depen?dentexocytosisofneurotransmitter.GenesCells,2003,8(6): 537-546.

10 YanY,DenefN,SchupbachT.Thevacuolarprotonpump, V-ATPase,isrequiredfornotchsignalingandendosomaltraffick?inginDrosophila.DevCell,2009,9(17):387–402

11 ZevEinhorn,JosefG.Trapani,QianyongLiu,etal.Rabconnec?tin3αpromotesstableactivityoftheH+-pumponsynapticvesi?clesinhaircells.JNeurosci,2012,32(32):11144–11156

12 ThieryJP.Epithelial-mesenchymaltransitionsintumourprogres?sion.NatRevCancer,2002,1(6):442–454.

13 HayED.Anoverviewofepithelio-mesenchymaltransformation.ActaAnat(Basel)1995,1(154):8–20.

14 ShinSY,RathO,KolchW,etal.Functionalrolesofmultiple feedbackloopsinextracellularsignal-regulatedkinaseandWnt signalingpathwaysthatregulateepithelial-mesenchymaltransi?tion.CancerRes,2010,70(17):6715-6724.

15 DeJongeRE,LiuXP,DeigCR,etal.ModulationofWntSignaling EnhancesInnerEarOrganoidDevelopmentin3DCulture.Plos One,2016,11(9)

16 AdamM.Tuttle,TrevorL.Hoffman,ThomasF.Schilling.Rabcon?nectin-3aregulatesvesicleendocytosisandcanonicalWntsignal?inginzebrafishneuralcrestmigration.PLoSBiol,2014,12(5)

17朱智杰,阮君山,陳文星.Wnt信號通路誘導腫瘤細胞上皮間質轉化的研究進展.中國藥理學通報2012,28(7):904~907

ZhuZJ,RuanJS,ChenWX.ResearchprogressofWntsignaling pathwayinducedEMTintumorcells.ChinesePharmacological Bulletin,2012,28(7):904~907

18 CruciatCM,OhkawaraB,AcebronSP,etal.Requirementofpro?reninreceptorandvacuolarH+-ATPase-mediatedacidification forWntsignaling.Science2010,1(327):459–463.

19 ShiF,HuL,JacquesBE,etal.β-Cateninisrequiredfor hair-celldifferentiationinthecochlea.JNeurosci,2014,34(19): 6470-6479.

Biological Functionsof Rabconnectin-3αin Pathophysiology Involving Hair Cellsand Auditory Nerve

LU Jiawen1,2,3,MEILing1,2,3,WANGXueling1,2,3,LINXin1,2,3,WUHao1,2,3
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,ShanghaiNinth People’sHospitalaffiliated to Shanghai Jiaotong University SchoolofMedicine
2Shanghai Jiaotong University Ear institute,
3ShanghaiKey Laboratory of TranslationalMedicine in Earand NoseDiseases, 200029,Shanghai,China

WUHao Email:wuhao622@sina.com

Rabconnectin-3(rbc3)protein is amember of the rab small GTP-binding protein fam ily,and contains two subunits calledαandβ.Human rbc3αis encoded by the dmxl-2(dmx like-2)genewhich is located on chromosome 15 q2.1,consists of 3,036 am ino acids,shows a calculated M r of 339,753 and contains 12WD domains.Research has found that rbc3αexpresses in both the brain and inner ear of rodentand primate animals,aswellas in the lateral line organ of zebra fish.As relevant research continues,rbc3αis found notonly to be involved in hearing loss,butalso related w ith various diseases.For example,dmxl-2mutation can affect the outcomes of hormonal therapy resistantbreast cancer.Besides,suchmutations are related w ith aromatase excess syndrome.Therefore,the biological function of rabconnectin-3αhas become a hot topic of recent research.The present review summarizes research progresson the biological functionsof rbc3αin relation to pathophysiology involving hair cellsand auditory nerve in recentyears.

R764

A

1672-2922（2017）03-345-5

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.014

國家自然科學基金（81570906）；上海市科委基礎重大項目（14DJ1400200）；本項研究工作得到了上海市科學技術委員會的課題支持，編號為14DZ2260300

盧嘉文，碩士在讀，研究方向:耳科學

吳皓，Email:wuhao622@sina.com

*There isno conflictof interest in this review.