王加朋梁彩艷

·論 著·

KCNJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性與兒童癲癇易感性的相關性研究

王加朋*梁彩艷*

目的探討中國北方漢族兒童中KCNJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性與癲癇的關系。方法212例癲癇患兒作為病例組，按照癲癇發(fā)作類型分為部分性發(fā)作（partial Seizures，PS）組120例和全面性發(fā)作（generalized seizures，GS）組和92例，同時選擇200例非癲癇兒童作為對照組，收集一般臨床資料，采用聚合酶鏈反應-限制性片段多態(tài)性法檢測KCNJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性，分析其與癲癇易感性的關系。結果校正年齡、性別等混雜因素后，KCNJ10基因rs1890532位點單核苷酸多態(tài)性與兒童GS在等位基因模型（C/G）和隱性基因模型[（CC+CG）/GG）]下整體效應具有統(tǒng)計學意義（OR＝1.325,95%CI:1.014～2.461,P＝0.043；OR＝3.173, 95%CI:1.097～10.694,P＝0.021）。對照組與病例組、PS組比較，等位基因和基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。結論KCNJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性可能與兒童GS遺傳易感性相關。

癲癇 基因KCNJ10基因多態(tài)性 兒童

癲癇是兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病常見疾病之一，且類型眾多，目前關于其發(fā)生、發(fā)展、耐藥的具體機制均尚不明確[1]。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)向整流性鉀離子通道 （inwardly rectifying K channel，Kir）4.1可參與細胞外間隙K+濃度調(diào)節(jié)，影響星形膠質細胞釋放谷氨酸等興奮性遞質，與癲癇發(fā)生有一定關聯(lián)[2-3]。人Kir4.1是由KCNJ10基因編碼，國外有臨床研究發(fā)現(xiàn)KCNJ10基因rs1130183位點和rs2486235位點單核苷酸多態(tài)性與癲癇發(fā)生相關，但由于人種差異，漢族人群中上述兩位點突變型等位基因頻率極低，國內(nèi)鮮有KCNJ10基因多態(tài)性與癲癇的關聯(lián)性研究報告[4-5]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中KCNJ10基因rs1890532位點等位基因C＞G突變廣泛存在[6]。故本研究以中國北方漢族特發(fā)性癲癇患兒作為研究對象，觀察KCNJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性與兒童癲癇易感性的關系，為臨床工作提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2015年1月至2016年8月于渭南市婦幼保健院兒科門診和（或）住院治療的212例癲癇患兒納入癲癇組，納入標準：①年齡≤12歲，來自我國北方地區(qū)的漢族兒童；②癲癇診斷符合 1981年國際抗癲癇聯(lián)盟（international league against epilepsy，ILAE）制定的關于癲癇的診斷標準[7]；③臨床資料完整，包括詳細癲癇病史、神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查、頭顱CT和（或）MR檢查及腦電圖檢查等。根據(jù)癲癇組患兒發(fā)作特點，參照ILAE制定的癲癇發(fā)作分類標準，將212例癲癇組患者分為部分性發(fā)作（partial seizures，PS）和全面性發(fā)作（generalized seizures，GS）兩大類。病例組排除標準：①明確由腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦炎、顱腦外傷、腫瘤等顱內(nèi)病變繼發(fā)癲癇；②合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤，或肝腎等重要臟器功能障礙；③合并嚴重精神性疾病。

隨機選擇200例同期于我院治療的非癲癇兒童納入對照組，納入標準：①年齡≤12歲，來自我國北方地區(qū)的漢族兒童；②參照ILAE標準患兒無癲癇病史。排除標準：①既往合并熱性驚厥史；②有癲癇家族史；③合并惡性腫瘤，或肝腎功能障礙等重大疾病。

本研究通過本院倫理委員會審核批準，所有入組兒童均得到家長充分知情同意。

1.2 一般臨床資料收集所有入組患兒年齡、性別，病例組患兒還需詳細收集癲癇發(fā)病情況，及腦電圖、顱腦影像學檢查資料等。

1.3 基因多態(tài)性檢測采集清晨空腹時外周靜脈血3 mL，應用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取基因組DNA。采用聚合酶鏈反應-限制性片段多態(tài)性 （polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCRRFLP）法檢測KCNJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性。根據(jù)基因庫（GenBank）提供的基因序列，采用Primer 5軟件設計引物，由上海生物工程公司合成引物序列 （上游：5’-ACGTTGGATGGACAAGAACACATAAGCGAC-3’，下游：5’-ACGTTGGATGGGTTTAGACACGTGGAGAAG-3’）。PCR反應體系（25 μL）包括：10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP混合物2 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，模板DNA1 μL，不足部分由滅菌蒸餾水補足。反應條件為95℃預變性4 min，然后按照95℃20 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s順序循環(huán) 30周期，最后72℃延長3 min。取0.5 μL延伸產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶AluⅠ進行酶切，酶切體系（20 μL）包括：PCR產(chǎn)物17 μL，10×Buffer 2 μL和內(nèi)切酶1 μL，反應條件為37℃16 h，然后65℃10 min終止反應。最后取酶切產(chǎn)物進行電泳，紫外燈下觀察并攝片。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)。本研究計量資料均服從正態(tài)分布，結果以（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料結果以構成百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗。采用比值比（odd ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示相對風險度。采用多因素logistic回歸分析法校正年齡、性別等混雜因素，評價KCNJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性與兒童癲癇易感性的關系。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 病例組與對照組基本臨床特征比較本研究癲癇組共納入212例癲癇患兒，其中男127例，女85例，平均年齡（6.4±3.4）歲，對照組納入200例兒童，包括男112例，女88例，平均年齡（6.3±3.7）歲，兩組兒童年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義 （t＝0.285，P＝0.779；χ2＝0.644，P＝0.422）。本研究癲癇組患兒按照發(fā)作類型分類，包括PS組120例，其中男73例，女47例，平均年齡（6.5±3.5）歲；GS組92例，其中男54例，女38例，平均年齡（6.3±3.2）歲，PS組和GS組患兒分別與對照組比較，兒童年齡 （t＝0.475，P＝0.641；t＝0.111，P＝0.913）和性別（χ2＝0.718，P＝0.397；χ2＝0.187，P＝0.666）差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2 PCR-RFLP結果判讀及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗如圖1，人群中KCNJ10基因rs1890532位點包括3種基因型，分別為純合野生型（CC型）、雜合突變型（CG）及純合突變型（GG）。對照組、病例組，PS組和GS組rs1890532位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2＝1.758，P＝0.415；χ2＝0.878，P＝0.645；χ2＝0.469，P＝0.791；χ2＝0.235，P＝0.889），具有群體代表性。

圖1 KCNJ10基因rs1890532位點不同基因型PCR-RFLP檢測結果

2.3 KCNJ10基因rs1890532位點單核苷酸多態(tài)性與兒童癲癇的關系對照組、病例組、PS組和GS組KCNJ10基因rs1890532位點基因型和等位基因分布情況如表1。病例組與對照組比較，單因素分析結果顯示KCNJ10基因rs1890532位點單核苷酸多態(tài)性與癲癇在隱性基因模型[（CC+CG）/GG）]下整體效應具有統(tǒng)計學意義（P＝0.047），但經(jīng)logistics回歸校正年齡、性別等混雜因素后，整體效應無統(tǒng)計學意義（P＝0.113）。GS組與對照組比較，校正混雜因素后，KCNJ10基因rs1890532位點單核苷酸多態(tài)性與GS在等位基因模型（C/G）和隱性基因模型下整體效應具有統(tǒng)計學意義 （P＝0.043；P＝0.021）。PS組與對照組比較，兩組等位基因和基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義 （均P＞0.05）。見表2。

3 討論

Kir4.1是Kir家族中的重要一員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在靜息膜電位調(diào)控、膜興奮性與細胞代謝偶聯(lián)，及鉀體內(nèi)平衡維護等生理活動中均起到關鍵作用[2-3,8-9]。Kir4.1與癲癇發(fā)病的關系目前尚不明確，NAGAO等[3]研究發(fā)現(xiàn)在匹魯卡品誘導癲癇模型大鼠顱內(nèi)星形膠質細胞Kir4.1的表達顯著升高，尤其在杏仁核和感覺皮層，但HEUSER等[2]學者在耐藥性顳葉癲癇患者切除的海馬組織中發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞 Kir4.1表達明顯下降。KNCJ10基因位于1 q22～q23，可編碼Kir4.1。國外多個臨床研究結果顯示KNCJ10基因多態(tài)性與癲癇易感性相關，LENZEN等[4,10]比較特發(fā)性全面性癲癇患者與健康對照組人群發(fā)現(xiàn)KNCJ10基因rs1130183單核苷酸多態(tài)性與GS易感性相關，DAI等[5]研究結果顯示rs2486253單核苷酸多態(tài)性與GS易感性相關。而韓國YOON等[11]學者研究結果顯示東亞人KNCJ10基因rs1130183位點T等位基因頻率極低，該位點單核苷酸多態(tài)性與癲癇易感性無明顯相關性。本研究前期通過檢索Hapmap數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)KNCJ10基因rs1130183、rs2486253位點突變型等位基因在中國漢族人群中頻率也均處于較低水平，不適合進行SNPs多態(tài)性分析，挑選適合國人的KNCJ10基因SNPs位點具有重要意義。

表2 不同基因模型下rs1890532單核苷酸多態(tài)性與兒童癲癇相關性分析

國內(nèi)學者周羅[6]以漢族人群為研究對象，對PS患者KNCJ10基因多個SNPs位點進行多態(tài)性分析，單因素分析結果顯示rs1890532單核苷酸多態(tài)性與PS易感性相關，但經(jīng)logistics多因素分析校正后兩者無關。該研究為國人癲癇基因多態(tài)性研究提供了新的可能SNPs位點，但筆者認為這項研究自身也存在局限性：首先，該研究僅納入PS患者，相對于癲癇類型眾多，很大一部分癲癇患者與該位點多態(tài)性的關系不明確；其次，該研究對于納入人群年齡無特殊限制，而基因遺傳因素和后天環(huán)境因素均在癲癇發(fā)病中具有重要作用，納入人群平均年齡越大，意味后天環(huán)境因素對癲癇發(fā)病的干預越多，可能將基因遺傳因素對發(fā)病的貢獻掩蓋。因此，本研究以年齡小于12歲的兒童作為研究對象，將癲癇組患兒分為PS組和GS組，使之分別與對照組進行比較，探討 KNCJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性與癲癇易感性的關系。

本研究單因素分析結果顯示癲癇組患兒KCNJ10基因rs1890532位點GG基因型頻率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，經(jīng)logistics回歸校正年齡、性別等混雜因素后，差異無具有統(tǒng)計學意義。PS組和GS組分別與對照組比較，GS組G等位基因和GG基因型頻率均顯著高于對照組，PS組與對照組比較，兩組等位基因和基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，KCNJ10基因rs1890532單核苷酸多態(tài)性與GS易感性相關。但是，KCNJ10基因包括等多個單核苷酸多態(tài)性位點，對于其他位點多態(tài)性與癲癇的關系尚不明確，KCNJ10基因多態(tài)性與其他基因相互作用的具體機制也仍需進一步研究。

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Association between polymorphism of KCNJ10 rs1890532 and susceptibility of epilepsy in children.

WANGJiapeng,LIANG Caiyan.Pediatric department of Weinan maternal and child health care hospita,Weinan 714000, China.Tel:0913-2060167.

ObjectiveTo investigate the genetic association between KCNJ10 rs1890532 gene polymorphism and susceptibility to children epilepsy in the Han descent population in the Northern China.MethodsTwo hundred twelve children with epilepsy were recruited as the epilepsy group.According to seizure types,they were divided?into partial seizures(PS)group(120 cases)and generalized seizures(GS)group(92 cases).Two hundred healthy volunteers without epilepsy were randomly selected from our hospital during the same period as the control group.General clinical data was collected and genotype was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism for the polymorphism of the KCNJ10 gene.ResultsResults showed that KCNJ10 rs1890532 gene polymorphism was significantly associated with GS in children in both allelic association analysis (OR＝1.325,95%CI 1.014～2.461,P＝0.043)and recessive model(OR＝3.173,95%CI 1.097～10.694,P＝0.021)after adjustment for sex and age.There was no significant difference in any genetic model between the control group and epilepsy group,neither between the control group and PS group.ConclusionPolymorphism of the KCNJ10(rs1890532)gene may be associated with the risk of GS in children.

Epilepsy Gene KCNJ10 Gene polymorphism Children

R741

A

2017-02-09）

（責任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.06.004

*渭南市婦幼保健院兒科（渭南 714000）