李淑妃，陳曉,2，陳瑜,2(.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢驗科，杭州 30003；2.浙江大學傳染病診治國家重點實驗室協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 30003)

·臨床實驗研究·

腸道內、外感染氣單胞菌的菌種分布特征及毒力基因分析

李淑妃1，陳曉1,2，陳瑜1,2(1.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢驗科，杭州 310003；2.浙江大學傳染病診治國家重點實驗室協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003)

目的 了解腸道內、外分離氣單胞菌菌種分布及毒力基因譜的差異，探究該菌致病性與感染部位的關系。方法 收集2013年5月至2015年9月急性腹瀉患者及腸道外標本來源的氣單胞菌156株，采用PCR方法檢測其18種毒力基因hlyA、aerA、act、alt、ast、aexT、ascV、aopP、ascF-G、gcat、tapA、fla、Ser、exu、ahyB、eprCAI、lip、laf，并統(tǒng)計分析腸道內、外來源氣單胞菌毒力基因譜的差異。結果 156株氣單胞菌中腸道內氣單胞菌79株，以豚鼠氣單胞菌為主(51.9%)；腸道外氣單胞菌77株，主要為嗜水氣單胞菌(48.1%)和豚鼠氣單胞菌(39.0%)。gcat、act、fla、ahyB、exu、lip基因在腸道內、外氣單胞菌中的檢出率較高(>45.57%)，而aexT、aopP、ascF-G、ascV則較低(<20.78%)；gcat、ahyB、laf、ast、exu、lip、hlyA、aerA在腸道內氣單胞菌中的檢出率顯著低于腸道外(P<0.05)；嗜水氣單胞菌gcat、ahyB、exu、lip、eprCAI、hlyA在腸道外的檢出率顯著高于腸道內(P<0.05)；豚鼠氣單胞菌lip、hlyA在腸道外的檢出率顯著高于腸道內(P<0.05)，而aopP反之；維氏氣單胞菌毒力基因在腸道內、外的檢出率差異無統(tǒng)計學意義。結論 腸道內、外氣單胞菌感染的菌種分布及攜帶的毒力基因譜存在差異，臨床需區(qū)別對待。

氣單胞菌；毒力基因；腸道內；腸道外

氣單胞菌(Aeromonas)作為一種人畜共患病原菌，其感染類型在臨床上可分為腸道內和腸道外感染，前者主要表現(xiàn)為腹瀉等胃腸炎癥狀，后者主要發(fā)生于肝硬化及惡性腫瘤等免疫功能低下患者，以血流感染和皮膚及軟組織感染為主，預后差，病死率高[1]。氣單胞菌致病涉及由不同基因編碼的多種毒力因子，包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)(aopP、aexT、ascF-G和ascV等基因)、外毒素(act、ast、alt、hlyA和aerA等基因)和與侵襲力相關的黏附因子(tapA基因)、胞外酶(gcat、ahyB、exu、lip、eprCAI、Ser等基因)、鞭毛(fla和laf基因)等[1]。然而，目前國內有關腸道內、外來源氣單胞菌的菌種分布及毒力特征的研究少有報道。為更好地了解該菌的致病能力，現(xiàn)就臨床分離腸道內、外來源氣單胞菌的菌種分布及毒力基因譜特征進行分析，結果如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2013年5月至2015年9月浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院門診及急診急性腹瀉(急性腹瀉：每日排便≥3次，且大便性狀有改變：呈稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等，持續(xù)時間≤14 d[2-3])患者糞便來源的氣單胞菌；收集同期住院患者血液、膽汁、尿液和痰液等(剔除同一患者重復菌株)來源的氣單胞菌，共156株。采用Vitek 2 Compact微生物鑒定儀進行細菌鑒定，對于儀器不能區(qū)分的嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌輔以VP生化試驗鑒定(陰性判讀為嗜水氣單胞菌)。

1.2 主要試劑及儀器 各種微生物培養(yǎng)基(杭州天和公司)；Vitek 2 Compact微生物鑒定儀及配套鑒定板條(法國生物梅里埃公司)；DNA Engine PCR擴增儀、Mini-Protean 3水平電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；引物由上海生工公司合成；Taq DNA聚合酶、100 bp DNA marker(TaKaRa公司)。

1.3 毒力基因測定 用熱裂解法提取菌株基因組DNA。用PCR方法檢測菌株18種毒力基因，參照文獻[4-9]合成引物，見表1，引物由上海生工公司合成。PCR反應體系50 μL，包括10×PCR buffer(含Mg2+)5.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板DNA 3.0 μL，ddH2O 34.7 μL。PCR反應參數：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度(見表1)30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。

1.4 測序驗證 各毒力基因隨機選取1株PCR陽性產物送上海生工公司進行基因測序，測序結果經美國國家生物技術信息中心/局部序列比對基本檢索工具(National Center for Biotechnology Information/Basic Local Alignment Search Tool，NCBI/BLAST)比對確認。

表1 氣單胞菌毒力基因PCR檢測相關引物

1.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS 20.0軟件進行。率的組間比較采用χ2檢驗、連續(xù)性校正的χ2檢驗或Fisher檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 菌種分布 共檢出氣單胞菌156株，包括豚鼠氣單胞菌71株、嗜水氣單胞菌57株、維氏氣單胞菌28株。其中腸道氣單胞菌79株，以豚鼠氣單胞菌(41株，51.9%)為主，其次為嗜水氣單胞菌(20株，25.3%)和維氏氣單胞菌(18株，22.8%)；腸道外氣單胞菌77株，包括嗜水氣單胞菌(37株，48.1%)、豚鼠氣單胞菌(30株，39.0%)和維氏氣單胞菌(10株，13.0%)。

2.2 腸道內、外氣單胞菌的毒力基因檢出結果 經PCR及測序驗證，除tapA僅在腸道外氣單胞菌中檢出，其他基因在腸道內、外氣單胞菌中均有不同程度的檢出率，見表2。gcat、act、fla、ahyB、exu、lip在腸道內、腸道外氣單胞菌中的檢出率較高(>45.57%)；aexT、aopP、ascF-G、ascV在腸道內、腸道外氣單胞菌中檢出率較低(<20.78%)。gcat、ahyB、laf、ast、exu、lip、hlyA、aerA在腸道內氣單胞菌中的檢出率顯著低于腸道外氣單胞菌(P<0.05)。

2.3 腸道內、外不同氣單胞菌菌種的毒力基因檢出結果tapA基因僅在腸道外分離的3種氣單胞菌中檢出，見表3。嗜水氣單胞菌gcat、ahyB、exu、lip、eprCAI、hlyA在腸道外的檢出率顯著高于腸道內(P<0.05)，而ascV在腸道內嗜水氣單胞菌中未檢出；豚鼠氣單胞菌lip、hlyA在腸道外的檢出率顯著高于腸道內(P<0.05)，而aopP反之；維氏氣單胞菌毒力基因在腸道內、外的檢出率差異無統(tǒng)計學意義，而ahyB未在腸道外檢測到。

表2 腸道內、外氣單胞菌的毒力基因檢出結果比較

表3 嗜水、豚鼠、維氏氣單胞菌毒力基因在腸道內、外的檢出率比較

注：*表示采用Fisher精確檢驗。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)腸道氣單胞菌屬感染以豚鼠氣單胞菌為主，然而在巴西、中國香港和巴基斯坦腹瀉患者中則分別以嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和脆弱氣單胞菌及中間氣單胞菌最為常見[10-12]；而腸道外氣單胞菌感染以嗜水氣單胞菌為主，與北京地區(qū)氣單胞菌屬的流行狀況相近[13]。這些差異的存在可能是與地域環(huán)境尤其是水源的差異和病原鑒定方法的不同有關。

毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)，絕大多數(96.79%)的氣單胞菌至少攜帶一種毒力基因。Santos等[6]發(fā)現(xiàn)產溶血毒素的氣單胞菌具有致病潛能。本研究發(fā)現(xiàn)>90%的腸道內及腸道外氣單胞菌均具有溶血活性，而毒力基因檢測結果顯示與溶細胞作用相關的act、hlyA、aerA、gcat、lip基因在腸道內、外氣單胞菌中均有不同程度的檢出。act是一種細胞毒性腸毒素基因，介導溶血性及細胞毒性，誘導上皮細胞和巨噬細胞凋亡[1]。Wong等[7]研究表明hlyA和aerA可通過在細胞表面形成跨膜孔的方式介導溶血活性。攜帶gcat的氣單胞菌具有脂肪酶或磷脂酶活性，可與lip通過消化質膜的方式溶解紅細胞[14]。

gcat、ahyB、exu、lip、hlyA、tapA在腸道內、外的分布差異具有統(tǒng)計學意義。具體表現(xiàn)為嗜水氣單胞菌的gcat、ahyB、exu、lip、hlyA基因和豚鼠氣單胞菌的lip和hlyA基因在腸道內、外的分布差異具有統(tǒng)計學意義；而tapA均只在腸道外嗜水、豚鼠和維氏氣單胞菌中檢出，提示氣單胞菌部分毒力基因的分布與其來源部位、菌種類型相關。鞭毛是氣單胞菌的重要毒力因子。本研究中fla和laf2個鞭毛相關基因在腸道內、外氣單胞菌中均有檢出，而laf在腸道氣單胞菌的檢出率明顯較低，其原因可能與兩者致病機制的不同有關。fla編碼的極性鞭毛主要介導細菌生物膜的形成和定植，而laf編碼的側鞭毛則介導細菌對上皮細胞的黏附，引起嚴重的痢疾樣感染[1]。痢疾樣腹瀉可伴有出血，氣單胞菌則可通過破損的腸道黏膜進入機體引起腸道外感染。Ⅲ型分泌系統(tǒng)作為近年來細菌致病機制的研究熱點，其相關基因ascF-G、aopP、ascV、aexT在本研究中的檢出率卻并不高，與Aravena-Román等的研究結果相一致[15]。而Burr和Frey在40株殺鮭氣單胞菌中發(fā)現(xiàn)aopP、ascV、aexT的檢出率高達80%～93%[9]，Aravena-Román等也發(fā)現(xiàn)ascV、aexT在環(huán)境來源氣單胞菌中檢出率高于臨床來源氣單胞菌，從而提出T3SS毒力基因分布具有菌種及來源的相關性[15]，與本研究的結果相一致。此外，ahyB、exu、eprCAI和Ser等胞外酶基因和腸毒素基因ast和alt在腸道內、外氣單胞菌中的普遍檢出表明氣單胞菌的致病機理十分復雜，需要更深入的研究。

鑒于氣單胞菌的毒力基因分布與其菌種和來源有關，故臨床上在治療氣單胞菌引起的感染時，要根據其感染部位和菌種類型加以區(qū)別對待。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Distribution characteristics and virulence gene analysis of intestinal and extraintestinalAeromonas

LIShu-fei1,CHENXiao1,2,CHENYu1,2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,CollegeofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310003,Zhejiang; 2.StateKeyLaboratoryforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousdiseases,ZhejiangUniversity,Hangzhou310003,Zhejiang,China)

Objective To investigate the species distribution and the difference of virulence gene spectra ofAeromonasisolated from intestinal tract and extraintestinal body fluid, and the correlation of their pathogenicity with infection sites. Methods A total of 156Aeromonasstrains isolated from the fecal specimens of patients with acute diarrhea and extraintestinal specimens were collected during May 2013 and September 2015. Eighteen virulence genes in these strains, includinghlyA,aerA,act,alt,ast,aexT,ascV,aopP,ascF-G,gcat,tapA,fla,Ser,exu,ahyB,eprCAI,lipandlaf, were detected by polymerase chain reaction(PCR). Last, the differences of virulence gene spectra between intestinal and extraintestinalAeromonaswere analyzed. Results Among 156Aeromonasstrains, 79 were from fecal specimens, and 77 from extraintestinal specimens.Aeromonascaviae(A.caviae, 51.9%) was the most common species in the intestinal strains, whileAeromonashydrophila(A.hydrophila, 48.1%) andA.caviae(39.0%) were the main pathogens in extraintestinal infections. The most prevalent virulence genes in intestinal and extraintestinalAeromonasweregcat,act,fla,ahyB,exuandlip(>45.57%), whileaexT,aopP,ascF-GandascVwere less frequently detected(<20.78%). The detection rates ofgcat,ahyB,laf,ast,exu,lip,hlyAandaerAgenes in intestinalAeromonaswere significantly lower than those in extraintestinal isolates(P<0.05). The detection rates ofgcat,ahyB,exu,lip,eprCAIandhlyAgenes in extraintestinalA.hydrophilawere significantly higher than those in intestinalA.hydrophila(P<0.05). The detection rates oflipandhlyAgenes in extraintestinalA.caviaewere significantly higher than those in intestinalA.caviae(P<0.05), while that ofaopPgene was just the reverse. There was no significant difference in the detection rates of virulence genes between intestinal and extraintestinalAeromonasveronii. Conclusion There are significant differences in the species distribution and virulence genes ofAeromonasisolated from intestinal and extraintestinal specimens, indicating that clinicians should treat them differentially.

Aeromonas; virulence gene; intestinal; extraintestinal

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.06

“十二五”國家科技重大專項(2012ZX10004-210)。

李淑妃，1992年生，女，碩士研究生，從事腸道微生物研究。

陳瑜，主任技師，博士研究生導師，E-mail：chenyyu@sina.com。

R446.5

A

2017-03-27)