宋玥，顏文娟，方坤，李小杉，李偉，衛(wèi)平民

(1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 210009；2.南京市疾病預(yù)防控制中心急性傳染病防制與學(xué)校衛(wèi)生科，南京 210009)

·調(diào)查研究·

2009至2016年中國甲型H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因進(jìn)化分析及流行趨勢預(yù)測

宋玥1，顏文娟1，方坤1，李小杉1，李偉2，衛(wèi)平民1

(1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 210009；2.南京市疾病預(yù)防控制中心急性傳染病防制與學(xué)校衛(wèi)生科，南京 210009)

目的 分析2009至2016年中國甲型H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因(NA)進(jìn)化特征，預(yù)測其流行趨勢，為流感疫苗評價提供依據(jù)。方法 從全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織(GISAID)數(shù)據(jù)庫及美國國家生物技術(shù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫下載甲型H1N1流感病毒NA基因序列1 141條。利用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和遺傳變異分析，利用Bayesian skyline Plot預(yù)測流行趨勢。結(jié)果 2009至2016年中國甲型H1N1毒株NA基因與參考毒株的同源性逐年降低。遺傳進(jìn)化分析顯示同一年份的毒株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上基本呈現(xiàn)集中分布。除2012年，其余各年份的毒株均通過不同模型得到正向壓力選擇位點。動力學(xué)分析顯示2017年甲型H1N1可能達(dá)到一個流行高峰。結(jié)論 甲型H1N1流感病毒NA基因所編碼的氨基酸逐年變異，需進(jìn)一步加強流感監(jiān)測。

甲型H1N1流感；神經(jīng)氨酸酶；分子特征；進(jìn)化分析

甲型H1N1流感病毒[influenza A viruses(H1N1 09pdm)]是由禽流感、豬流感和人流感病毒3者基因重配而成[1-2]，自感染暴發(fā)以來，H1N1(09pdm)在人群中一直引起較高的發(fā)病率，也因此受到國內(nèi)外研究的廣泛關(guān)注。

流感病毒基因組由8個片段構(gòu)成，其中神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)是流感病毒在傳播和擴(kuò)散中最關(guān)鍵的酶。NA附著在流感病毒顆粒表面[3]，具有水解唾液酸的活性，從而促使病毒的釋放和擴(kuò)散[4]，且NA抑制劑在合成抗流感病毒藥物中占主要地位。NA的抗原位點、糖基化位點和耐藥位點等關(guān)鍵的氨基酸突變是病毒抗原性發(fā)生變異的重要基礎(chǔ)[5-6]，其基因的改變對流感疫情的發(fā)生與流行有著密切的影響。本研究通過分析2009年后甲型H1N1流感病毒在中國地區(qū)的流行態(tài)勢，對NA核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化及氨基酸位點變異分析，為我國甲型H1N1流感的疾病防控及預(yù)測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2009年至2016年國家流感中心(http://www.cnic.org.cn/chn/)流感周報中國流感流行的數(shù)據(jù)，從美國國家生物技術(shù)中心流感病毒(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)及全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織(The Global Initiative on Sharing All Influenza Data，GISAID)數(shù)據(jù)庫(http://platform.gisaid.org/epi3/frontend)中下載中國地區(qū)甲型H1N1流感病毒NA基因序列，共1 141條。用Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) version 6.0軟件進(jìn)行序列比對,并用鄰接法繪制進(jìn)化樹，根據(jù)樹中終末分支同源性較高的分支情況，刪除部分同地區(qū)同年份的序列。刪除重復(fù)的序列和部分同年份同地區(qū)同源性較高的序列，得到354條來自安徽、北京、重慶、福建、甘肅、廣東、廣西、貴州、海南、河北、黑龍江、河南、香港、湖北、湖南、江蘇、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏、青海、山西、陜西、山東、上海、四川、天津、西安、新疆、云南、浙江各省份的序列，包括2009年87條、2010年55條、2011年26條、2012年4條、2013年34條、2014年24條、2015年54條和2016年70條。

1.2 方法 采用MEGA version 6.0軟件進(jìn)行序列比對、氨基酸位點的變異分析，采用鄰接法構(gòu)建甲型H1N1病毒NA基因進(jìn)化樹(Bootstrap檢驗重復(fù)值設(shè)為1 000)。通過Data monkey在線軟件的Single likelihood ancestor counting(SLAC)、Internal fixed effects likelihood(IFEL)和Random effects method(REL)模型進(jìn)行選擇性壓力分析。利用Figtree v1.4.2(http://beast.bio.ed.ac.uk)讀取系統(tǒng)進(jìn)化樹，以bootstrap值≥0.9判定為流行枝(Lineage)。采用BEAST v1.8.0軟件的Bayesian skyline Plot(BSP)法構(gòu)建Bayesian skyline reconstruction，進(jìn)行動力學(xué)分析，模型為GTR+Relaxed clock(uncorrelated)+Bayesian skyline。MCMC分析鏈長為200 000 000，迭代頻次為1 000，收斂評價標(biāo)準(zhǔn)為有效樣本數(shù)(effective sampling size, ESS)>200。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)分布特征 從全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2009年至2016年全國甲型H1N1流感共發(fā)生4次流行高峰，分別是2009年5月至2010年2月、2011年1至3月、2012年12月至2014年3月、2015年末至2016年又呈現(xiàn)上升趨勢。見圖1。

圖1 中國地區(qū)2009至2016年流感流行情況

2.2 同源性分析 將不同年份甲型H1N1流感毒株(354條)與參考毒株A/California/07/2009(H1N1)的NA基因序列進(jìn)行比對，其中2009至2016年的NA基因與參考毒株的同源性分別為99.2%～99.7%、99.2%～99.6%、98.8%～99.5%、98.8%～98.9%、98.4%～99.6%、98.2%～98.9%、97.9%～99.6%和97.5%～98.9%。2009至2016年甲型H1N1流感毒株與參考毒株的NA基因核苷酸和氨基酸遺傳距離及各年內(nèi)核苷酸的平均遺傳距離見表1。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 甲型H1N1亞型NA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖2所示(圖中的進(jìn)化樹只包含部分毒株，剔除了部分位于進(jìn)化樹上相同終末分支并且相同年份、同源性較高的序列，其中標(biāo)為紅色分支的是參考序列)，最終選取了有代表性的71支毒株建樹，不同年份的毒株由不同的顏色表示。結(jié)果顯示，同一年份的甲型H1N1流感毒株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上基本呈集中分布的態(tài)勢。其中2009年與2010年的流感毒株形成一個分支;2011年的流感毒株另外形成2個小分支，可能是由于V241I和N369K的變異；2012年毒株N200S突變，獨立形成一個小分支；2013年至2016年的毒株聚集形成一個大支。毒株間存在明顯的年代差異，隨著年代相隔越久，序列差異越大。

注：標(biāo)尺值0.002代表毒株間的進(jìn)化距離。

圖2 中國2009-2016年甲型H1N1流感毒株NA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 NA分子特征分析

2.4.1 潛在抗原位點的氨基酸序列分析 NA蛋白N端第140至157位氨基酸很有可能是甲型H1N1流感病毒抗原決定簇所在[4]。中國地區(qū)的354條毒株序列與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比，2010年潛在抗原位點氨基酸發(fā)生變異(G147E)；2015年潛在抗原位點發(fā)生變異(I145N)，并且第151位氨基酸出現(xiàn)缺失情況;2016年潛在抗原位點第151位氨基酸也出現(xiàn)缺失情況，潛在抗原位點發(fā)生變異(Y155H)。

2.4.2 酶活性中心及周圍相關(guān)位點的氨基酸序列分析 NA蛋白的酶催化活性位點包括催化部位的第118、151、152、224、276、292、371和406位等8個位點，除此還有酶活性中心周圍的輔助位點11個，分別是第119、156、178、179、198、222、227、274、277、294和425位[4]。通過軟件比對，發(fā)現(xiàn)2009年至2016年354條甲型H1N1流感病毒的NA基因所編碼氨基酸在所有A型流感病毒的NA蛋白中都是保守的，未發(fā)現(xiàn)氨基酸位點突變。

2.4.3 糖基化位點的氨基酸序列分析 甲型H1N1流感病毒NA蛋白分子糖基化位點有8個，分別是第50、58、63、68、88、146、235和386位[3-4]。通過軟件比對，發(fā)現(xiàn)2009至2016年354條甲型H1N1流感病毒的NA基因所編碼的氨基酸在第50、58、63、68、88、146、235位未發(fā)生變異，保持穩(wěn)定，但在第386位逐年變異，直至2016年該位點消失。

2.4.4 耐藥性分析 NA某些氨基酸殘基的突變會使病毒產(chǎn)生對這類抗流感病毒藥物的耐藥性，包括E119V、R292K、 R293K、N294S和H274Y位點[7-8]，2009至2016年354條毒株序列尚未發(fā)現(xiàn)上述位點的突變, 表明對NA抑制劑仍敏感。

2.5 選擇性壓力分析 對2009至2016年各年份的NA序列分別采用SLAC、IFEL和REL模型進(jìn)行選擇性壓力分析。各年份通過SLAC模型均未發(fā)現(xiàn)正向選擇壓力位點。IFEL模型發(fā)現(xiàn)2009年的序列有正向選擇壓力位點64；2010年有正向選擇壓力位點82和264；2013年有正向選擇壓力位點34、275和321；2016年有正向選擇壓力位點275，其余年份未發(fā)現(xiàn)。除2012年的序列外，通過REL模型均得到正向選擇壓力位點，結(jié)果見表2。

表2 中國2009至2016年甲型H1N1流感毒株正向選擇壓力位點分布

年份SLACIFELREL2009N/D6464、3912010N/D82、26462、82、3862011N/DN/D145、1792012N/DN/DN/D2013N/D34、275、32134、44、286、3092014N/DN/D144、2892015N/DN/D34、40、314、3462016N/D27534、40、93、96、257、275、314、396

注：N/D表示未發(fā)現(xiàn)。

2.6 進(jìn)化動力學(xué)分析 Bayesian skyline reconstruction建立的模型表明，流感病毒遺傳多樣性在2009年維持穩(wěn)定狀態(tài)，并且在2009年和2010年達(dá)到高峰，隨后分別在2011年及2012年有2次下降趨勢，2012年6月呈現(xiàn)上升趨勢，于2013年和2014年再次達(dá)到流行高峰，此后至2015年下降并維持于相對穩(wěn)定狀態(tài)，2016年開始又呈現(xiàn)上升趨勢，預(yù)測2017年可能又將達(dá)到一個流行高峰。見圖3。

注：黑色實線為估計中位數(shù)，藍(lán)色區(qū)域為95%置信區(qū)間。

圖3 甲型H1N1流感NA基因進(jìn)化動力學(xué)

3 討論

根據(jù)國家流感中心的監(jiān)測結(jié)果，2009至2016年中國流感流行主要以甲型H1N1、B型和季節(jié)性H3N2為主，其中甲型H1N1亞型作為我國流感流行的重要亞型，共發(fā)生4次流行高峰，主要在冬春季。2009至2016年甲型H1N1流感病毒NA基因與參考毒株A/California/07/2009(H1N1)的同源性逐年降低，類似研究也提示甲型H1N1流感病毒逐漸進(jìn)化變異[9]。本研究發(fā)現(xiàn)NA有16個氨基酸位點改變，分別為V13I、I34V、N44S、V67I、N200S、V241I、N248D、V264I、N270K、I314M、I321V、I329N、N369K、T381I、N386K、K432E，其他變異位點呈散發(fā)型。核苷酸與氨基酸的遺傳距離隨著年份的增加而不斷增大，遺傳進(jìn)化速度加快。流感病毒NA所編碼的氨基酸關(guān)鍵位點突變增多。抗原位點的突變、糖基化位點的消失、酶活性位點的變異等都可能會影響流感病毒的抗原性和致病力[10]，從而使病毒適應(yīng)宿主感染環(huán)境，在人群中更廣泛地傳播。NA蛋白的酶活性中心位于NA的頭部[11]，可以直接或間接參與酶的催化作用。2009至2016年甲型H1N1流感病毒NA蛋白分子酶活性中心及周圍相關(guān)位點相對保守，有利于穩(wěn)定酶的活性及病毒擴(kuò)散能力。NA催化活性位點可以直接或間接參與NA的催化功能，如有氨基酸變異將會影響NA的活性[12]，NA抑制劑設(shè)計的原則就是基于NA高度保守的酶活性位點[13-14]。本研究并未發(fā)現(xiàn)酶活性位點或耐藥位點的變異，表明相關(guān)位點仍可作為抗流感藥物研發(fā)的基因靶點[11,15]。糖基化位點是維持NA蛋白分子結(jié)構(gòu)和正常生物功能的重要影響因素，糖基化位點的變異對穩(wěn)定病毒蛋白結(jié)構(gòu)和生物特性有很大影響[16]。2009年新型甲型H1N1流感病毒具有8個糖基化位點，其中N386K隨著年份的遞增，直至徹底消失。研究表明，糖基化位點的非糖基化以及潛在糖基化位點數(shù)量的變化都可能會影響蛋白質(zhì)折疊和運輸?shù)忍匦院凸δ?，進(jìn)而導(dǎo)致流感病毒結(jié)合受體的能力和病毒致病性降低[17]。病毒在進(jìn)化過程中會獲得新的糖基化位點，新的糖基化位點可能會掩蓋抗原位點，成為病毒免疫逃逸的一種方式，需要加強監(jiān)測。正向選擇位點與病毒受體結(jié)合能力有關(guān)，因此這些正向位點的選擇可能有助于H1N1流感的宿主從豬到人的適應(yīng)。正向選擇位點常發(fā)生于免疫水平較低的人群，會影響疫苗的近期效果評價[18]。

Ebranati等[19]認(rèn)為病毒遺傳多樣性的波動與其所引起的暴發(fā)流行相對應(yīng)。進(jìn)化動力學(xué)趨勢顯示，甲型H1N1流感的流行趨勢呈階段性，每流行2年會間隔一年，與類似研究結(jié)果一致[20]。其中趨勢圖下降可能由于流感暴發(fā)后，國家采取了及時的公共衛(wèi)生措施，從而控制了流感疫情，趨勢圖的上升可能由于病毒在自然界的不斷變異，從而逃避宿主免疫引起流感的流行。

綜上所述，隨著流感病毒在人群中的進(jìn)一步適應(yīng)和持續(xù)存在，病毒分子特征將發(fā)生變異，預(yù)示該亞型在未來的時間里很有可能繼續(xù)成為優(yōu)勢毒株。本研究追蹤甲型H1N1流感病毒的進(jìn)化趨勢，特別關(guān)注基因變化對病毒的傳播力和致病性的影響，從而及時發(fā)現(xiàn)具有流行病學(xué)意義的變異株和耐藥株，這對疾病防控及預(yù)測具有重要的意義。

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(本文編輯：劉群)

Evolution analysis and trend prediction of neuraminidase gene of influenza A/H1N1(09pdm) virus in China from 2009 to 2016

SONGYue1,YANWen-juan1,FANGKun1,LIXiao-shan1,LIWei2,WEIPing-min1

(1.SchoolofPublicHealth,South-EastUniversity,Nanjing210009,Jiangsu; 2.InfectiousDiseaseControlandSchoolHealth,NanjingCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,Jiangsu,China)

Objective To analyze the evolutionary characteristics and predict the variation trend of neuraminidase (NA) gene of influenza A/H1N1 (09pdm) virus in China from 2009 to 2016 in order to provide the basis of assessment for flu vaccines. Methods A total of 1 141 sequences of NA gene of influenza A/H1N1 (09pdm) virus were screened out from the Global Initiative on Sharing All Influenza Data and National Center for Biotechnology Information. The phylogenetic trees and the mutations of amino acids sequences were constructed and analyzed by biological softwares. The prediction for epidemic trend of influenza was analyzed by Bayesian skyline Plot. Results Compared with the sequence of reference strain, the homology of nucleic acid sequence of NA gene decreased year by year from 2009 to 2016. The phylogenetic analysis showed that NA gene clustered nearly on the identical phylogenetic tree in one year. The positive selection pressure site of NA strain was observed by different models in each year except 2012. The dynamics analysis showed that the popularity of influenza A/H1N1 virus may continue to increase to a peak in 2017. Conclusion The amino acid encoded by NA gene of influenza A/H1N1 virus is varying gradually, so the importance of surveillance for influenza virus should be reinforced for every year.

influenza A/H1N1(09pdm); neuraminidase; molecular characteristics; evolution analysis

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.19

江蘇省重點研發(fā)計劃(社會發(fā)展)項目(BE2015679)；江蘇省“六大人才高峰”第十一批高層次人才選拔培養(yǎng)資助項目(2014-WSN-40)。

宋玥，1992年生，女，碩士研究生，研究方向：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)。

衛(wèi)平民，教授，博士，E-mail: mpw1963@126.com。

R373.1+3

A

2017-03-29)