荊霞??許麗華??陳碧??張維??唐棣??王笑??林志梅??王麗蓮??鄒琳

[摘要] 目的 探討特發(fā)性卵巢早衰與AMH，AMHR-Ⅱ的基因多態(tài)性。 方法 選擇2015年6月～ 2017年3月在我院診斷的特發(fā)性卵巢早衰患者50例為POF組。另選擇健康體檢者100例為對(duì)照組。PCR方法測(cè)定兩組AMH，AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性。 結(jié)果 POF組AMH基因突變位點(diǎn)基因型及等位基因頻率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。POF組AMHR-Ⅱ c.49+10T>G 基因位點(diǎn)GG基因型比例顯著高于對(duì)照組，G等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，c.622-2C>T基因位點(diǎn)TT基因型比例顯著高于對(duì)照組，T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，c.622-24C>A 基因位點(diǎn)AA基因型比例顯著高于對(duì)照組，A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，c.1038G>T基因位點(diǎn)TT基因型比例顯著高于對(duì)照組，T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性可能是特發(fā)性卵巢早衰的重要的發(fā)病機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 特發(fā)性卵巢早衰；AMH；AMHR-Ⅱ；基因多態(tài)性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R711.75 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）12-07-04

Polymorphism analysis of AMH， AMHR- II gene in patients with idiopathic premature ovarian failure

JING Xia XU Lihua CHEN Bi ZHANG Wei TANG Di WANG Xiao LIN Zhimei WANG Lilian ZOU Lin

Reproductive Medicine Centre， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong， Zhanjiang 524001， China

[Abstract] Objective To discuss polymorphism analysis of AMH， AMHR-Ⅱ gene in patients with idiopathic premature ovarian failure. Methods 50 cases with idiopathic premature ovarian failure from Jun 2015 to Mar 2017 were selected as POF group. And 100 cases for physical examination were selected as control group. Polymorphismof AMH， AMHR- II gene of two groups was detected by PCR. Results Genotype and allele frequency of AMH gene mutation sites of POF group showed no significant difference with the control group（P>0.05）. The proportion of GG genotype in AMHR- loci II， c.49+10T>G of POF group was higher than that of the control group， and G allele frequency was higher than that of the control group； The proportion ofTTgenotype inc.622-2C>Tof POF group was higher than that of the control group， and Tallele frequency was higher than that of the control group；The proportion ofAAgenotype inc.622-24C>Aof POF group was higher than that of the control group， and Aallele frequency was higher than that of the control group；The proportion ofTTgenotype inc.1038G>Tof POF group was higher than that of the control group， and Tallele frequency was higher than that of the control group； The difference showed significant difference（P<0.05）. Conclusion Polymorphism of AMHR-Ⅱ gene may be an important pathogenesis of idiopathic premature ovarian failure.

[Key words] Idiopathic premature ovarian failure； AMH； AMHR-Ⅱ； Gene polymorphism

特發(fā)性卵巢早衰是指無(wú)精確原因的，自身免疫抗體正常的，染色體核型正常的女性在40周歲之前出現(xiàn)的性器官萎縮、持續(xù)性閉經(jīng)，伴有卵泡雌激素、黃體生成素升高，雌激素下降的一種綜合征[1-2]。我國(guó)卵巢早衰的發(fā)病率相對(duì)較高，而其中有80%為特發(fā)性卵巢早衰，患者主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂，血管

舒縮功能不穩(wěn)定，容易出汗、潮熱、情緒波動(dòng)等。目前特發(fā)性卵巢早衰的發(fā)病機(jī)制還不十分明確，可能與遺傳、自身免疫因素、感染、代謝異常、環(huán)境等有關(guān)[3-4]。特發(fā)性卵巢早衰尚無(wú)明確有效的治療方法?？姑缋占に兀ˋMH）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，與人類(lèi)生殖系統(tǒng)的發(fā)育及功能密切相關(guān)[5-6]。其與抗苗勒激素Ⅱ型受體（AMHR-Ⅱ）結(jié)合而發(fā)揮作用。本研究分析特發(fā)性卵巢早衰患者AMH以及AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月～2017年3月在我院診斷的特發(fā)性卵巢早衰患者50例為POF組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～39歲，漢族，無(wú)月經(jīng)來(lái)潮≥4個(gè)月；超聲檢查顯示內(nèi)生殖器萎縮；兩次間隔1個(gè)月以上檢測(cè)空腹血清FSH>40IU/L；排除有明確病因的卵巢早衰。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往腮腺炎病史，盆腔結(jié)核病史，卵巢手術(shù)，盆腔內(nèi)放療、化療者。所有患者對(duì)本次研究知情同意，本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。另選擇健康體檢者100例為對(duì)照組。POF組年齡18 ～ 39歲，平均（35.1±7.5）歲。對(duì)照組年齡21～39歲，平均（35.5±7.1）歲。兩組平均年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

POF組患者與對(duì)照組均于月經(jīng)來(lái)潮第三天采集晨起空腹靜脈血10mL用于檢測(cè)，POF組中無(wú)月經(jīng)來(lái)潮的患者，B超觀察雙側(cè)卵巢無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡形成時(shí)采集晨起空腹靜脈血標(biāo)本。-75℃保存待測(cè)。血標(biāo)本提取DNA：采用飽和酚/氯仿法提取目的基因DNA片段；血標(biāo)本解凍，取2mL置于離心管中，加10mL滅菌蒸餾水，顛倒混勻，靜止10min；4000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，棄上清，重復(fù)離心3次，至上清液澄清；沉淀物種加STE700μL，SDS 1～2滴，蛋白裂解酶K 10μL，搖勻，37℃溫浴過(guò)夜，至沉淀完全消失，室溫下離心，棄上清，將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)至1.5mL試管；試管內(nèi)加入飽和酚至試管加滿(mǎn)，搖勻，靜置5min，16000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，提取上清液至另一個(gè)1.5mL試管，加等體積氯仿，搖勻，靜置5min，16000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清，加入1.5mL試管，加入95%冰凍酒精，醋酸鈉1滴，搖勻；16000轉(zhuǎn)/min離心10min，棄上清，75%冰凍酒精萃洗沉淀，16000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，自然干燥，得DNA。AMH、AMHR-Ⅱ基因檢測(cè)：自數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得AMH、AMHR-Ⅱ基因相關(guān)序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)正向及反向引物。配制引物。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1μL，正向引物 1μL，反向引物1μL，MgCl2 3μL，10×Buffer 3μL，dNTPs 3μL，Tag酶 0.3μL，H2O 17.7μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化及序列測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組AMH基因突變位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

見(jiàn)表1。POF組AMH基因突變位點(diǎn)基因型及等位基因頻率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 兩組AMHR-Ⅱ基因位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

見(jiàn)表2。POF組AMHR-Ⅱ c.49+10T>G 基因位點(diǎn)GG基因型比例顯著高于對(duì)照組，G等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，c.622-2C>T基因位點(diǎn)

TT基因型比例顯著高于對(duì)照組，T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，c.622-24C>A 基因位點(diǎn)AA基因型比例顯著高于對(duì)照組，A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，c.1038G>T基因位點(diǎn)TT基因型比例顯著高于對(duì)照組，T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

卵巢早衰是指卵巢功能衰竭所導(dǎo)致的40歲之前即閉經(jīng)的現(xiàn)象。其特點(diǎn)是原發(fā)或繼發(fā)閉經(jīng)伴隨血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素癥狀，如潮熱多汗、面部潮紅、性欲低下等。卵巢早衰是一種異質(zhì)性疾病，與自身免疫、遺傳因素、代謝異常、感染、環(huán)境等有關(guān)。卵巢早衰是一種有多種病因的綜合征，在大部分的病例中病因還不明確?；颊弑憩F(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、低雌激素癥狀、伴發(fā)的自身免疫性疾病等。特發(fā)性卵巢早衰最常見(jiàn)，患者原因不明，患者可無(wú)明確的誘因，自身免疫抗體正常，染色體核型正常。特發(fā)性卵巢早衰患者大部分染色體核型分析正常，提示遺傳性治病因素可能發(fā)生在單基因或者核苷酸分子水平。隨著分子生物學(xué)計(jì)數(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的特發(fā)性POF易感基因被發(fā)現(xiàn)[7-8]。

特發(fā)性POF患者表現(xiàn)為先天性卵子數(shù)量減少，正常卵泡閉鎖過(guò)程加速，或者出生后卵子被不同機(jī)制破壞導(dǎo)致卵泡過(guò)早耗竭。卵泡發(fā)生及發(fā)育受下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控，也與卵泡刺激素有關(guān)，還受到卵巢內(nèi)自分泌、旁分泌的影響。近年來(lái)卵巢局部的微調(diào)節(jié)在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用逐漸受到關(guān)注。卵巢內(nèi)合成局部調(diào)節(jié)因子有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族、胰島素生長(zhǎng)因子系統(tǒng)，顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞來(lái)源的抑制素、激活素等?？姑缋展芗に兀ˋMH）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，與生殖系統(tǒng)發(fā)育及功能有密切的相關(guān)性，在女性生殖功能活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用。AMH異?？蓪?dǎo)致內(nèi)在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育異常，卵巢顆粒細(xì)胞分泌異常[9-10]。AMH抑制始基卵泡。AMH由兩個(gè)相同的70kb亞基通過(guò)二硫鍵鏈接組成，屬于二聚糖蛋白，相對(duì)分子量140×103，人類(lèi)AMH編碼基因位于19號(hào)染色體短臂。女性AMH主要由卵巢顆粒細(xì)胞分泌。AMH抑制始基卵泡的啟動(dòng)，抑制竇卵泡對(duì)FSH的敏感性，抑制卵泡的發(fā)育及成熟[11-12]。AMH是評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的客觀準(zhǔn)確的指標(biāo)，能夠更敏感更準(zhǔn)確地反應(yīng)年齡相關(guān)卵巢儲(chǔ)備功能下降；其不受月經(jīng)周期的影響，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性；AMH不受激素避孕藥的影響，便于臨床使用[13-14]。卵巢的儲(chǔ)備功能取決于卵巢內(nèi)庫(kù)存卵泡數(shù)量與質(zhì)量，隨著年齡增長(zhǎng)，卵巢內(nèi)存留的可募捐卵泡數(shù)目減少以及卵子質(zhì)量下降可導(dǎo)致生育能力下降，卵巢儲(chǔ)備功能降低[15]。評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)預(yù)測(cè)生育潛能與卵巢功能狀態(tài)具有重要的臨床意義。在眾多的卵巢儲(chǔ)備功能評(píng)估指標(biāo)中，AMH是最早隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)生改變的指標(biāo)，可敏感地評(píng)估年齡相關(guān)的生育能力下降。AMH受體分為Ⅰ型與Ⅱ型兩種，表達(dá)在苗勒氏管周?chē)g質(zhì)細(xì)胞、兩性性腺。研究證實(shí)AMHR-Ⅱ型與AMH具有高度的親和力，AMH與其結(jié)合后，發(fā)揮相應(yīng)的作用。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。本研究中分析POF患者與健康對(duì)照組AMH以及AMHR-Ⅱ單核苷酸多態(tài)性，分析與POF的相關(guān)性。分析結(jié)果顯示，POF患者與健康對(duì)照組AMH單核苷酸多態(tài)性在c.146T>G、c.303G>A、c.546G>A基因型及等位基因頻率并沒(méi)有顯著地差異。而AMHR-Ⅱ單核苷酸多態(tài)性在c.49+10T>G 、c.622-2C>T、c.622-24C>A、c.1038G>T 基因型及等位基因頻率存在顯著差異。這個(gè)結(jié)果提示，在POF的發(fā)病機(jī)制中，AMH基因多態(tài)性可能并未參與，而AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性與POF的發(fā)病具有密切的關(guān)系，可能是直接或者間接導(dǎo)致特發(fā)性POF的相關(guān)位點(diǎn)。

綜上所述， AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性可能是特發(fā)性卵巢早衰的重要的發(fā)病機(jī)制之一。

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（收稿日期：2017-05-09）