徐紅梅+陳京元+湯景明

摘要：松材線(xiàn)蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)B.mucronatus是傘滑刃屬內(nèi)兩個(gè)獨(dú)立的種，均可引起松材線(xiàn)蟲(chóng)病。松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)能否進(jìn)行種間雜交在學(xué)術(shù)界一直存在爭(zhēng)議。采用4個(gè)蟲(chóng)株在實(shí)驗(yàn)室條件下開(kāi)展了雜交試驗(yàn)及雜交后代繁殖力研究。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)室條件下松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)可成功雜交，他們之間未發(fā)展出嚴(yán)格的生殖隔離，二者極可能來(lái)源于同一祖先。

關(guān)鍵詞：松材線(xiàn)蟲(chóng)；擬松材線(xiàn)蟲(chóng)；雜交

中圖分類(lèi)號(hào)：S763.16文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2017）03-0029-05

Abstract： As two different species in genus Bursaphelenchus，B.xylophilus and B.mucronatus can cause pine wilt disease.There has been a long running debate on whether the two species can hybridize successfully.In this study indoor hybridization were carried out with four isolates of B.xylophilus and B.mucronatus.The fecundity of their offsprings was also observed.The results showed that interspecific hybridization between B.xylophilus and B.mucronatus was possible under the laboratory condition. Cross tests showed that there was no strict reproductive isolation between them，and they were derived from a common ancestor.

Key words：B.xylophilus；B.mucronatus；hybridization

松材線(xiàn)蟲(chóng)?。ㄋ蓸?shù)萎蔫病）被稱(chēng)為松樹(shù)的“癌癥”，是林業(yè)上的一種毀滅性病害。松材線(xiàn)蟲(chóng)是普遍認(rèn)可的引起松材線(xiàn)蟲(chóng)病的主要病原物[1]。20世紀(jì) 80 年代起，中國(guó)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)由擬松材線(xiàn)蟲(chóng)引起的松樹(shù)萎蔫，且能造成一定的危害。近年來(lái)大量研究也證實(shí)一些擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株確實(shí)有較強(qiáng)致病性，如對(duì)黃山松和黑松、云南松及思茅松、高山松等，并導(dǎo)致很多松林被毀[2-4]。因此，不少學(xué)者認(rèn)為松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)共同構(gòu)成松材線(xiàn)蟲(chóng)復(fù)合群體，為松材線(xiàn)蟲(chóng)病的病原物。

松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)是傘滑刃屬內(nèi)兩個(gè)獨(dú)立的種，在寄主植物、形態(tài)、生理生化等方面都極為相似。近年來(lái)，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)形態(tài)特征、分子生物學(xué)特征及致病性方面都介于松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)之間的線(xiàn)蟲(chóng)群體，例如法國(guó)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)群體以及“M”型松材線(xiàn)蟲(chóng)群體。松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)作為兩個(gè)種的界限逐漸模糊。

由于這兩個(gè)種親緣關(guān)系很近，又經(jīng)常在病木中同時(shí)存在，兩個(gè)種能否雜交一直受到關(guān)注。深入研究這一問(wèn)題，不僅有助于傘滑刃屬線(xiàn)蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)研究，并且在松萎蔫病的流行和檢疫等方面有重要的價(jià)值。

本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下開(kāi)展了松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)雜交及后代繁殖力研究，并在此基礎(chǔ)上探討了松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)在自然界是否具備雜交潛力。

1材料與方法

1.1供試線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)源

蟲(chóng)株來(lái)源及編號(hào)見(jiàn)表1，各蟲(chóng)株都經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和特異引物擴(kuò)增詳細(xì)鑒定，在分類(lèi)上確認(rèn)無(wú)誤。

1.2PDA平板-灰葡萄孢培養(yǎng)

線(xiàn)蟲(chóng)的繼代培養(yǎng)采用灰葡萄孢Botrytis cinerea作為線(xiàn)蟲(chóng)食料。將少量灰葡萄孢菌絲塊接種至滅菌PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 ml）平板上，再翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使皿底向上，置于25 ℃恒溫箱中。培養(yǎng)5～7 d后菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)后放置4 ℃冰箱備用。

1.3未受孕雌線(xiàn)蟲(chóng)準(zhǔn)備

將在灰葡萄孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)的線(xiàn)蟲(chóng)用無(wú)菌水洗出，在體視顯微鏡下用挑針挑取單條大齡幼蟲(chóng)。顯微鏡下（×40）鏡檢鑒別雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)（雌蟲(chóng)陰門(mén)尚未分化，在體長(zhǎng)約2/3處可見(jiàn)白色區(qū)域，雄蟲(chóng)則直接挑出），將雌蟲(chóng)放入裝有2 ml無(wú)菌水的無(wú)菌微型培養(yǎng)皿中。挑入1～2根灰葡萄孢菌絲（飼喂線(xiàn)蟲(chóng)），25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，待線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)成成蟲(chóng)備用。

1.4松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)雜交測(cè)定

將培養(yǎng)好的單條未受孕雌成蟲(chóng)和3條異種雄成蟲(chóng)（正交母本為松材線(xiàn)蟲(chóng)，父本為擬松材線(xiàn)蟲(chóng)）挑入盛有灰葡萄孢菌絲塊的培養(yǎng)皿（直徑3 cm）中，讓其在灰葡萄孢菌絲塊上交配并繁殖；同時(shí)做反交交配組合（母本為擬松材線(xiàn)蟲(chóng)，父本為松材線(xiàn)蟲(chóng)）；以松材線(xiàn)蟲(chóng)、擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的種內(nèi)交配為對(duì)照。每個(gè)組合重復(fù)15次。25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，7 d后，用無(wú)菌水洗下培養(yǎng)皿中的所有線(xiàn)蟲(chóng)，在體視顯微鏡下逐一檢查是否有雜交后代產(chǎn)生并統(tǒng)計(jì)雜交后代的數(shù)量，計(jì)算每個(gè)組合的交配率、平均后代數(shù)、性比和死亡率。

交配率（%）=（產(chǎn)生后代培養(yǎng)皿數(shù)/ 重復(fù)培養(yǎng)皿數(shù)）× 100%

平均后代數(shù)=產(chǎn)生后代的培養(yǎng)皿內(nèi)的線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量總和/產(chǎn)生后代的培養(yǎng)皿數(shù)

死亡率（%）=（死亡總蟲(chóng)數(shù)/后代總蟲(chóng)數(shù)） ×100%

1.5雜交后代繁殖力測(cè)定

為進(jìn)一步了解各雜交后代的繁殖能力，對(duì)ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm組合的正反交后代進(jìn)行繼代培養(yǎng)，測(cè)定每代的交配率、性比、死亡率等，以ZJBx、FrBm和CBm的種內(nèi)交配繼代培養(yǎng)作為對(duì)照。取F1代培養(yǎng)好的1條未受孕雌蟲(chóng)和1條活躍雄蟲(chóng)繼續(xù)在盛有灰葡萄孢菌絲塊的培養(yǎng)皿（直徑3 cm）中培養(yǎng)，做正交和反交組合，并以同種內(nèi)交配產(chǎn)生的F1代作為對(duì)照，每個(gè)組合重復(fù)15次。25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，7 d后，用無(wú)菌水洗出各培養(yǎng)皿中的F2代，在體視顯微鏡下逐一檢查是否有后代產(chǎn)生并統(tǒng)計(jì)后代數(shù)量，計(jì)算每個(gè)組合的交配率、平均后代數(shù)、性比和死亡率。雜交出的每一代（每隔7 d）都按此方法進(jìn)行雜交和統(tǒng)計(jì)，直至雜交出來(lái)F5代。

1.6雜交后代同親本回交能力測(cè)定

為了解雜交后代同親本的回交能力，把ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm組合的正反交后代（F1、F2）與親本進(jìn)行回交。挑取F1、F2代單條未受孕雌成蟲(chóng)和3條親本雄蟲(chóng)挑入盛有灰葡萄孢菌絲塊的培養(yǎng)皿（直徑3 cm）中，讓其在灰葡萄孢菌絲塊上交配并繁殖。每個(gè)組合重復(fù)15次。25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，7 d后，用無(wú)菌水洗出各培養(yǎng)皿中的所有線(xiàn)蟲(chóng)，在體視顯微鏡下逐一檢查是否有后代產(chǎn)生并統(tǒng)計(jì)后代數(shù)量，計(jì)算每個(gè)組合的交配率、平均后代數(shù)、性比和死亡率。

2結(jié)果與分析

2.1松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)雜交結(jié)果

分別對(duì)來(lái)自浙江和馬鞍山的松材線(xiàn)蟲(chóng)株系和來(lái)自中國(guó)、法國(guó)的擬松材線(xiàn)蟲(chóng)株系進(jìn)行種間雜交和種內(nèi)交配，培養(yǎng)7 d后觀(guān)察其F1代產(chǎn)生情況（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明，供試的4個(gè)雜交組合（無(wú)論是正交還是反交）均有后代產(chǎn)生，交配率在133%～467%之間，每個(gè)組合平均后代數(shù)為11～47，F(xiàn)1代死亡率為158%～282%。不同雜交組合交配率、平均后代數(shù)和死亡率有所差異，中國(guó)浙江松材線(xiàn)蟲(chóng)株系（ZJBx）和法國(guó)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)株系（FrBm）雜交組合交配率、平均后代數(shù)較高，且死亡率偏低；中國(guó)馬鞍山松材線(xiàn)蟲(chóng)株系（MASBx）和法國(guó)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)株系（FrBm）雜交組合交配率、平均后代數(shù)較低；其余組合交配率、平均后代數(shù)位于二者之間。同一雜交組合內(nèi)，正交與反交的交配率、平均后代數(shù)和死亡率有所差異，總體上以擬松材線(xiàn)蟲(chóng)為母本的反交組合的交配率、平均后代數(shù)稍高于正交組合。種內(nèi)交配的所有組合，交配率、平均后代數(shù)都遠(yuǎn)高于雜交組合，且后代死亡率較低。交配率在600%～100%之間，每個(gè)組合平均后代數(shù)為117～131，F(xiàn)1代死亡率為90%～168%。

由此可知，盡管與種內(nèi)交配相比，供試雜交組合交配率和平均后代數(shù)偏低，且F1代死亡率稍高，但在實(shí)驗(yàn)室條件下松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)可以成功雜交，且雜交后代可以存活。

2.2雜交后代繁殖能力

供試的兩個(gè)雜交組合（無(wú)論正交還是反交）F2至F5代繁殖能力均較強(qiáng)（見(jiàn)表3）。ZJBx×FrBm組合F2至F5代交配率在400%～800%之間，每對(duì)產(chǎn)生的平均后代數(shù)在27～51之間，后代死亡率為163%～221%。ZJBx×CBm組合F2至F5代交配率、平均后代數(shù)稍高，分別為467%～800%和50%～68%，后代死亡率為135%～255%。

與對(duì)照Z(yǔ)JBx、FrBm種內(nèi)交配相比較，2個(gè)種種內(nèi)交配F2至F5代交配率均高于兩個(gè)雜交組合， ZJBx種內(nèi)交配F2至F5代平均后代數(shù)高于兩個(gè)雜交組合，死亡率相當(dāng)，而FrBm種內(nèi)交配F2至F5代平均后代數(shù)與ZJBx×FrBm組合相當(dāng)，稍低于ZJBx×CBm組合，死亡率相當(dāng)。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，供試松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株不僅在實(shí)驗(yàn)室條件下可以雜交，而且雜交產(chǎn)生的后代繁殖能力較強(qiáng)，F(xiàn)2至F5代交配率、平均后代數(shù)等均較高，后代死亡率較低。

2.3雜交后代同親本回交能力

結(jié)果如表4所示，ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm組合的雜交后代（F1、F2）都可以和親本回交，交配率在在167%～667%之間，產(chǎn)生的平均后代數(shù)在10～35之間，后代死亡率為126%～563%?？傮w上來(lái)說(shuō)，同一個(gè)組合內(nèi)，F(xiàn)1代同親本回交的交配率和平均后代數(shù)稍高于F2代，后代死亡率相當(dāng)。F1（ZJBX♀×CBm♂）×ZJBX♂、F2（ZJBX♀×CBm♂）×ZJBX♂回交組合回交后代數(shù)量較少，其死亡率較高，這可能是導(dǎo)致回交后代雌雄比例不合理的原因，從而可以推測(cè)回交后代繼續(xù)繁殖的可能性會(huì)降低，但是ZJBX♀×CBm♂、ZJBX♀×CBm♂F1、F2代同父本擬松材線(xiàn)蟲(chóng)CBm回交的交配率、平均后代數(shù)和死亡率都和其它組合相當(dāng)。其它組合也表現(xiàn)出該特征，即F1、F2代更易和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)回交。

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)雜交后代可以和親本回交，F(xiàn)1代同親本回交的交配率和平均后代數(shù)稍高于F2代，后代死亡率相當(dāng)。F1、F2代更易和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)回交。

3討論

學(xué)術(shù)界關(guān)于松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)能否雜交及雜交后代能否存活一直存在爭(zhēng)議，不同研究者所得出的結(jié)論各不相同。最早Mamiya用日本的3個(gè)松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株和8個(gè)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株開(kāi)展雜交研究，結(jié)果各組合均能產(chǎn)生F1代，但F1代都不能繁育F2代，也不能與親本回交，因此認(rèn)為松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種間存在明顯的生殖隔離[5]。這一研究結(jié)論不久就受到質(zhì)疑。Hajaukiewicz用一個(gè)日本松材線(xiàn)蟲(chóng)株系與法國(guó)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)株系進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)二者具有很高的雜交潛力，雜交后代可以產(chǎn)生多代，且繁殖能力很強(qiáng)[6]。Bolla等收集了北美、日本和法國(guó)松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株，其中不少蟲(chóng)株可以雜交，且F1代可繁育F2等后代[7]。Braasch用德國(guó)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)株系與日本松材線(xiàn)蟲(chóng)株系雜交，二者能雜交并產(chǎn)生有致病能力的后代[8]。Riga認(rèn)為松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)未發(fā)展出生殖隔離，在實(shí)驗(yàn)室條件下可成功雜交，但自然界二者不存在基因交流[9]。劉偉等研究表明有部分雜交組合產(chǎn)生了F2、F3等后代，通過(guò)回交也得到了可繁殖的后代，但后代數(shù)量少，認(rèn)為自然界存在雜交種的可能性不大[10]。季宏鐵的研究結(jié)果表明，絕大多數(shù)的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)雜交產(chǎn)生的后代在一代或多代之后就不可再繁殖，只有法國(guó)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)和北美松材線(xiàn)蟲(chóng)雜交才可以產(chǎn)生可育的后代[11]。賁愛(ài)玲等研究發(fā)現(xiàn)不同國(guó)家的松材線(xiàn)蟲(chóng)均能和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)生雜交且雜交率較高，但雜交后代較難成活[12]。縱觀(guān)前人研究結(jié)果，除了Mamiya認(rèn)為二者絕對(duì)不能雜交以外，其他研究盡管采用的蟲(chóng)株和雜交方法有所差異，但均在實(shí)驗(yàn)室條件下培育出了可繁育的后代。本研究中多個(gè)雜交組合均能雜交或回交成功，產(chǎn)生的后代大部分存活較好。

在松材線(xiàn)蟲(chóng)傳入中國(guó)之前，沒(méi)有擬松材線(xiàn)蟲(chóng)大面積致病的報(bào)道，早期研究亦認(rèn)為，擬松材線(xiàn)蟲(chóng)不具致病性或致病性非常弱，只在松樹(shù)受到惡劣環(huán)境影響或其他有害因子的危害造成松樹(shù)樹(shù)勢(shì)衰弱時(shí)，起到加速松樹(shù)枯死的作用。近幾年來(lái)不斷有強(qiáng)致病性擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株報(bào)道出現(xiàn)并且中國(guó)有很多地區(qū)都發(fā)現(xiàn)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)致使成片松林枯死。這些現(xiàn)象引起了筆者的關(guān)注，是否自然界存在著松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的基因交流，從而導(dǎo)致擬松材線(xiàn)蟲(chóng)致病性增強(qiáng)。

從本研究結(jié)果來(lái)看，母本為擬松材線(xiàn)蟲(chóng)、父本為松材線(xiàn)蟲(chóng)的條件下種間雜交和后代數(shù)量更高。而F1、F2更容易和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行回交，這表明松材線(xiàn)蟲(chóng)的基因滲入擬松材線(xiàn)蟲(chóng)更加容易，與Taga等人的研究結(jié)果較為一致[13]。這一結(jié)論似乎能一定程度上闡釋擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病性增強(qiáng)現(xiàn)象與松材線(xiàn)蟲(chóng)入侵后二者基因交流有關(guān)系，因此不能完全否定自然界存在著松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的基因交流，今后仍需要加強(qiáng)相關(guān)研究。

參考文獻(xiàn)

[1]楊寶君，潘宏陽(yáng)，湯堅(jiān)，等.松材線(xiàn)蟲(chóng)?。˙ursaphelenchus xylophilus）[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2003：19.

[2]黃悅悅，任澤君，曹紅珍.德興市馬尾松枯死樹(shù)中擬松材線(xiàn)蟲(chóng)致病性測(cè)定[J].江西林業(yè)科技，1999（1）：910.

[3]張治宇，林茂松，余本淵.擬松材線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)黑松苗的致病性[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（1）：4650.

[4]陳鳳毛，史延梅，王姝穎，等.不同株系擬松材線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)黃山松和黑松苗木的致病性[J]. 林業(yè)科學(xué)，2010，46（12）：8690.

[5]Mamiya Y. Interspecific Hybridization between Bursaphelechus xylophilus and B.mucronatus （Aphelench ida： Aphelencho ididae）[J]. Applied Entomology and Zoology，1986，21（1）：159163.

[6]Hajaukiewicz P T. Myers R T.ExPerimental crossing of selected isolates of Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus [J]. Phytopathology，1988，78（11）：15071508.

[7]Bolla R I， Boschert M.Pine wood Nematode species complex：Interbreeding potential and Chromosome number[J].Journal of Nematology，1993，25（2）：227238.

[8]Braasch H.Intraand interspecific crossing experiments with a German and a Siberian isolate of Bursaphelenchus mucronatus （Nematoda： Aphelenchoididae） and related Bursaphelenchus species[J].

[9]Riga E，Bechenbach K，WebsterJ M.Taxonomic relationships of Bursaphelenchus xylophilus and B.mucronatus based on interspeeific and intraspecific crosshybridization and DNA analysis [J]. Fundamental and Applied Nematology，1992，15：391395.

[10]劉偉，楊寶君.松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的雜交遺傳差異研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，1994，7（5）：469 474.

[11]季宏鐵.松材線(xiàn)蟲(chóng)（Bursaphelenchus xylophilus）與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)（B.mucronatus）生物學(xué)雜交研究[D].南京：南京南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[12]賁愛(ài)玲，過(guò)曄，韓正敏.松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)雜交及后代的致病性[J].林業(yè)科學(xué)，2010，8（46）：114118.

[13]Taga Y，Goto S，Matsunaga K.Temporal changes in characteristics of populations originating from interbreeding between Bursaphelenchus xylophilus and B.mucronatus [J]. Nematology， 2011，13（6）：701712.

（責(zé)任編輯：夏劍萍）