鄭晴+包怡敏

[摘要]自噬是一種利用溶酶體來清除細(xì)胞內(nèi)不必要或受損的細(xì)胞器，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的基本過程。近年來的研究表明，自噬在心肌缺血再灌注過程中發(fā)揮著重要的作用。在心肌缺血階段，適度的自噬可以保護(hù)細(xì)胞免受各種壓力；然而在再灌注階段時，過度的自噬使細(xì)胞死亡進(jìn)一步增強(qiáng)。因此，自噬在心肌缺血再灌注過程中具有的雙重作用為心臟疾病的治療提供了新的治療靶點。近年來，越來越多的中藥被證實可以通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的自噬水平，通過增強(qiáng)自噬或抑制自噬，對受損心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。該文綜述了心肌缺血再灌注損傷過程中自噬的主要分子機(jī)制和作用及中藥對其的調(diào)控作用。

[關(guān)鍵詞]中藥； 心肌缺血再灌注； 自噬

Regulatory effects of traditional Chinese medicine on

autophagy in myocardial ischemia reperfusion injury

ZHENG Qing， BAO Yimin*

（College of Basic Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

[Abstract]Autophagy is a basic process of eliminating unnecessary or damaged organelles by lysosome to maintain the internal environment homeostasis Recent studies have revealed that autophagy plays an important role in pathology of myocardial ischemia reperfusion In the phase of ischemia， moderate autophagy can protect the cells against various stress； but in the phase of reperfusion， excessive autophagy can increase the death of cells Therefore， the dual role of autophagy in myocardial ischemia reperfusion provides a new therapeutic target for the treatment of heart disease In recent years， more and more Chinese medicines have been proved to adjust the autophagy in myocardial cells， and protect the damaged myocardium by enhancing or inhibiting autophagy This article would review the molecular mechanisms of autophagy and its role in myocardial ischemia reperfusion injury as well as the regulation effect of Chinese medicine on it

[Key words]traditional Chinese medicine； myocardial ischemiareperfusion； autophagy

自噬是指在細(xì)胞內(nèi)衰老、受損的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器通過溶酶體被降解成氨基酸等小分子物質(zhì)，從而為生物合成提供原料和能量，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程。細(xì)胞在饑餓、缺氧、氧化應(yīng)激、病原體感染和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等刺激條件下可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。研究表明，適度的自噬通過緩解能源危機(jī)、維持蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)、清除受損細(xì)胞等發(fā)揮對組織細(xì)胞的保護(hù)作用；但是自噬的長期上調(diào)可以導(dǎo)致細(xì)胞過度降解而死亡。近年來，關(guān)于自噬在心血管疾病中的作用的研究越來越多，但其在心肌缺血再灌注（ischemiareperfusion，I/R）中的作用仍存在爭議。隨著中醫(yī)藥研究的不斷發(fā)展，中藥在調(diào)節(jié)自噬方面取得了一定的進(jìn)展。本文旨在討論自噬在心肌缺血再灌注損傷中所發(fā)揮的作用與機(jī)制，以及中藥對其的影響。

1自噬與心肌缺血再灌注損傷

11自噬的類型和過程

自噬存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，是溶酶體依賴性的降解機(jī)制。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，自噬具有不同的分類方式。根據(jù)包裹物和運(yùn)輸方式的不同，可分為：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy），以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperonmediated autophagy，CMA），其中巨自噬為最主要的形式，即通常所說的自噬[1]。自噬過程可以分為4個階段：①自噬的誘導(dǎo)：細(xì)胞在自噬起始信號的調(diào)控下，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上生成歐米茄體，并形成了有雙層膜的杯狀隔離膜，也稱為前自噬泡；②自噬體的形成：前自噬泡不斷的向兩邊延伸，細(xì)胞器等細(xì)胞質(zhì)的成分也隨之被吞噬，最后隔離膜封閉形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體；③自噬溶酶體的形成：自噬小體的外膜與溶酶體融合形成自噬溶酶體；④自噬溶酶體的降解與再利用：溶酶體水解酶包括組織蛋白酶、脂酶等會降解自噬體的內(nèi)膜及其內(nèi)部成分，而被降解的產(chǎn)物會被送回到胞漿之中，供細(xì)胞重新循環(huán)利用[2]。

12再灌注過程中自噬的調(diào)控機(jī)制

121活性氧介導(dǎo)自噬發(fā)生活性氧（ROS）是經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑[3]，細(xì)胞內(nèi)的活性氧或細(xì)胞外過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以通過上調(diào)自噬維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，自噬可導(dǎo)致氧化應(yīng)激條件下的細(xì)胞死亡，清除活性氧可明顯的抑制自噬[4]。最新研究表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或者氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和自噬流導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。

122Beclin1介導(dǎo)的自噬Beclin1是自噬的關(guān)鍵蛋白之一，它參與了自噬體膜的形成過程，可作為自噬的標(biāo)記蛋白。在心肌缺血期間，自噬的誘發(fā)主要依賴AMPK信號通路；而在再灌注期間則主要依賴Beclin1，且自噬的激活又可以引起B(yǎng)eclin1的上調(diào)。因此，隨著自噬的不斷增強(qiáng)，Beclin1蛋白表達(dá)也隨之增加。目前也有研究發(fā)現(xiàn)通過競爭性結(jié)合Beclin1和Bcl2以及Beclin1與Bcl2的磷酸化修飾，可以在介導(dǎo)凋亡機(jī)制發(fā)生的同時，促進(jìn)自噬的發(fā)生[6]。

123Bnip3介導(dǎo)線粒體自噬Bnip3位于線粒體外膜，它不僅是一種可以誘導(dǎo)線粒體功能發(fā)生障礙和細(xì)胞死亡的促凋亡蛋白，也是細(xì)胞自噬的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑。Bnip3的過表達(dá)可以引起成年心肌細(xì)胞自噬增多。有研究稱在再灌注過程中由于活性氧、鈣超載等因素影響，導(dǎo)致Bnip3調(diào)控的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）開放，使線粒體膜通透性增加，同時釋放細(xì)胞色素C等促凋亡信號，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，mPTP的抑制劑環(huán)孢素可以阻斷mPTP的開放，并在HL1細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注后使自噬減弱[7]，說明mPTP可能是心肌I/R損傷中調(diào)節(jié)自噬的上游分子。但也有報道稱，作為心肌細(xì)胞中自噬的有效誘導(dǎo)物，Bnip3可以不依賴于活性氧、鈣超載、mPTP開放而是通過破壞Beclin1和Bcl2之間的相互作用而誘發(fā)自噬[8]。目前也有研究表明，Bnip3可以與自噬關(guān)鍵蛋白LC3相互作用，誘導(dǎo)線粒體自噬，通過清除受損的線粒體發(fā)揮對心肌的保護(hù)作用[9]。

124PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）屬于磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）相關(guān)激酶（PIKK）家族成員，影響自噬體成熟階段的形成。心肌缺血時，mTOR被抑制，誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生；再灌注時，mTOR被激活，從而抑制自噬[10]。PI3K/Akt信號通路是mTOR眾多調(diào)控機(jī)制中最經(jīng)典的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也是自噬起始階段最主要的信號通路。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第3位羥基磷酸化的磷酯酰肌醇激酶，按照結(jié)構(gòu)可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型PI3K激活可以抑制自噬；Ⅱ型PI3K激活與自噬無太大關(guān)系；Ⅲ型PI3K參與初期自噬體的形成，并促進(jìn)自噬。Akt是PI3K的下游分子，活化后可通過影響mTOR對細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)控。最近的研究證明，在I/R早期，自噬被過度激活，藥物治療可刺激PI3K/Akt磷酸化，進(jìn)一步增強(qiáng)mTOR信號從而抑制自噬[11]。

心肌缺血再灌注損傷中自噬的主要調(diào)控機(jī)制見圖1。

13自噬在心肌缺血再灌注過程中的雙重作用

131自噬在心肌缺血再灌注過程中起到的保護(hù)作用從心肌缺血階段開始，自噬信號的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ATP以緩解能源危機(jī)。有研究證實，自噬抑制劑3甲基嘌呤可以降低ATP的產(chǎn)生，加重缺糖損傷時的心肌細(xì)胞死亡[12]。自噬在心肌缺血再灌注階段作為一種能量的恢復(fù)過程，是心肌細(xì)胞存活的關(guān)鍵。同時，自噬對蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)也有重要的影響。泛素蛋白酶系統(tǒng)和自噬是2種主要的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)，可以通過清除錯誤折疊和受損的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器，起到維護(hù)細(xì)胞完整性的作用。但是在心肌缺血再灌注過程中，泛素蛋白酶系統(tǒng)功能失調(diào)，導(dǎo)致心肌泛素化蛋白聚集體的合成增加[13]；而此時自噬活性的增加可以彌補(bǔ)泛素化蛋白受損的功能，并使蛋白水解維持在一個適當(dāng)?shù)乃健Ｒ虼?，在心肌缺血再灌注的起始階段，自噬對心肌是起到保護(hù)作用的。

132自噬在心肌缺血再灌注過程中起到的損害作用雖然自噬有利于ATP的生成和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，但在再灌注時過度的自噬可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的過度死亡。自噬是一種負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)底物降解的過程，若自噬激活超過一定水平，溶酶體酶增加，過度清除了必要的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，可導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，引起細(xì)胞自噬性死亡。有研究證實，使用自噬抑制劑3MA或敲除Beclin1時可以減少在心肌缺血再灌注損傷時的細(xì)胞死亡[14]。

自噬的另一個有害原因可能是自噬與凋亡之間的串?dāng)_。Bcl2蛋白是Bcl2家族中的抑制凋亡的蛋白，參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其表達(dá)下降可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。值得注意的是，Bcl2蛋白表達(dá)上調(diào)可以抑制Beclin1依賴性自噬，并且再灌注時Beclin1的激活與Bcl2蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)[15]。

2中藥通過抑制自噬來減輕心肌缺血再灌注損傷

研究表明，一些中藥及其有效成分在心肌缺血再灌注損傷的過程中具有抑制自噬的作用，如黃芩甲苷[16]、香青蘭總黃酮[17]、加味丹參飲[18]等，均可下調(diào)再灌注心肌Beclin1，LC3II，Atg5等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。中藥及有效成分對自噬的抑制作用是通過多條途徑進(jìn)行的。

21通過抗氧化途徑抑制自噬

現(xiàn)階段有研究證實，一些中藥提取物可以通過抗氧化應(yīng)激來調(diào)控過度的自噬。例如銀杏總黃酮[19]、青蒿素[20]和橙皮苷[21]在治療大鼠心肌缺血再灌注模型時，氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)丙二醛（MDA）水平明顯降低而超氧化物歧化酶（SOD）水平明顯升高，同時自噬的相關(guān)基因LC3II/I和Beclin1水平明顯降低，心肌損傷標(biāo)記物肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）表達(dá)下降，說明它們是通過抗氧化應(yīng)激抑制自噬從而緩解心肌缺血再灌注損傷。

22通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬

PI3K/Akt/mTOR通路是目前研究最多的自噬相關(guān)機(jī)制之一。丹酚酸B（Sal B）來源于中藥丹參，它在自噬早期通過阻斷自噬流以及影響自噬體的形成來抑制自噬，并且減輕了自噬期間的細(xì)胞凋亡[22]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Sal B可以通過下調(diào)Beclin1和LC3II的表達(dá)來抑制自噬，然而在使用PI3K抑制劑LY294002后，消除了Sal B誘導(dǎo)的pAkt表達(dá)以及抗自噬的作用。因此Sal B抑制自噬減輕心肌細(xì)胞I/R損傷可能是通過對PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)[23]。九龍?zhí)倏傸S酮（BCF）是龍須藤莖提取物的主要活性成分，以往的研究表明，BCF可清除自由基，改善心肌能量代謝，減輕炎癥反應(yīng)和心肌損傷，抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞的存活率[24]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BCF通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制細(xì)胞凋亡及過度的自噬，從而緩解心肌缺血再灌注損傷。BCF預(yù)處理可以下調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1，LC3II，上調(diào)PI3K和pAkt蛋白的表達(dá)，增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白水平 [25]。也有報道認(rèn)為，BCF上調(diào)mTOR，下調(diào)Beclin1并影響了Beclin1誘導(dǎo)的自噬、凋亡互反饋的信號通路，抑制過度自噬，從而發(fā)揮對心肌的保護(hù)作用[26]。有報道稱，從玉郎傘中提取的玉郎傘查爾酮（YLSC）能降低再灌注造成的心肌Beclin1基因和LC3II蛋白表達(dá)的上調(diào)，抑制自噬的同時升高Akt的磷酸化水平，對PI3K/Akt通路下游的多個靶點（eNOS，NO，Caspase3）的表達(dá)也有影響，其作用可被PI3K特異性抑制劑wortmannin所阻斷，說明YLSC 是通過激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制過度自噬來減輕缺血/再灌注損傷[27]。因此，多種中藥有效成分被證實是通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬而發(fā)揮抗I/R損傷作用。