許翊 陸妍 武海萍 卜瑩

[摘要]蛇類中藥飲片具有較高的臨床藥用價值，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、通絡等功效，藥理作用明顯。近年來，由于野生動植物資源匱乏、蛇類中藥飲片價格昂貴，市場上出現(xiàn)了很多偽品和混淆品。傳統(tǒng)的中藥飲片鑒別方法包括基源、形態(tài)、顯微、理化鑒別四大方法體系，但這些方法都存在一些弊端，包括對中藥樣本有較高的形態(tài)學要求、鑒別過程復雜、易受主觀因素影響等。隨著分子生物學研究的深入和分子遺傳標記技術的發(fā)展，中藥鑒別方法逐漸多元化，一些新興的理論和技術被引入中藥材鑒別領域，RAPD技術、PCR反應、DNA條形碼分析等。該文將著重對當前蛇類中藥飲片的分子鑒別方法作簡要綜述。

[關鍵詞]蛇類中藥飲片； RAPD； PCR； DNA條形碼分析

Progress in molecular identification of snake drugs

XU Yi1， LU Yan1， WU Haiping2， BU Ying2*

（1China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China；

2 Institute for Drug and Instrument Control of Joint Logistics Department of Nanjing Military Area

Command， Nanjing 210008， China）

[Abstract]Snake drugs have high values in clinical medication for antiinflammatory， analgesia activities and dredging collaterals However， owing to their deficient resource and substantial profit， many counterfeits for snake drugs have appeared on the market Traditional methods for Chinese medicine authentication include identification of origin， morphology identification， microscopy and physiochemical identification But these methods are restricted in application because of their high morphological requirement for specimens， complex process for assays and indeterminate results guided by subjective With the development of molecular biology and molecular genetic techniques， new theories and technologies for molecular detection have been introduced to the authentication of Chinese medicine， such as RAPD， specific PCR amplification， DNA barcoding analysis and so on， improved the authentication system of Chinese medicine Here， we will give a brief review of molecular detection methods for snake drugs authentication

[Key words]snake drugs； RAPD； PCR； DNA barcoding analysis

中藥是中華民族的偉大瑰寶，蛇類藥材來源于藥用蛇類的特定部位，是動物類中藥材的重要組成部分。蛇類中藥飲片產(chǎn)地各異、形態(tài)多樣、成分復雜、作用靶點多，臨床主要用于祛風、通絡、止痙等。但是，市場上層出不窮的仿冒品對人民群眾的用藥安全構成了威脅，因此對其進行準確鑒別是當前對蛇類中藥飲片質量控制的首要前提。隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，中藥鑒別逐漸形成了基源、形態(tài)、顯微、理化四大方法體系。顯微和理化鑒別是借助現(xiàn)代化儀器對藥材的微觀形態(tài)特征和主要有效成分進行分析，從而達到鑒別的目的?，F(xiàn)代化分析技術既是對經(jīng)驗性鑒別方法的補充，也是對其科學的詮釋，不過這些方法也受到主觀判斷和環(huán)境變化的影響，僅憑有效成分不能準確鑒別藥材。中藥材不同于合成藥物，尤其是來源于動植物的藥材，雖然通過了多項炮制工藝，但是藥用部位的DNA依然保存完整。鑒別藥材特有的DNA序列將從根本上確定藥材的真?zhèn)巍?010年版《中國藥典》收入烏梢蛇Zaocys dhumnades、蘄蛇Agkistrodon acutus的PCR鑒別方法，明確了分子鑒別技術在蛇類藥材鑒別領域的作用。但是該方法存在目的基因單一、開管易污染、特異性差等缺點。本文通過回顧蛇類中藥飲片分子鑒別研究的發(fā)展歷程，希望對完善蛇類藥材的分子鑒別方法有所啟示。

1基于隨機引物擴增的RAPD技術

RAPD技術（random amplified polymorphism，RAPD）以PCR為基礎，以人工合成的大約10 nt的寡核苷酸單鏈作為隨機引物。隨機引物的退火溫度一般為36 ℃，既能與目的序列相互結合，又能保證一定的錯粘，擴大了DNA的檢測區(qū)域。待測模板上結合位點的突變將直接導致其PCR產(chǎn)物的改變。分析PCR產(chǎn)物在電泳圖上的分布，可從中獲得全基因組多態(tài)性的信息，這對后續(xù)如基因指紋圖譜[1]、動植物育種[2]、基因定位[3]、物種親緣關系的建立[4]等研究具有理論和實踐指導意義。endprint

目前，基因指紋圖譜是對中藥材進行質控的重要方法，RAPD技術可實現(xiàn)理想的分子標記。待測樣品經(jīng)隨機引物擴增后，其PCR產(chǎn)物在凝膠電泳上可呈現(xiàn)出物種特有的DNA指紋圖譜。研究者通過直接對比待測樣品和標準品的DNA指紋圖譜，即可鑒別藥材的真?zhèn)?。如通過基因組DNA電泳圖譜和標準圖譜的比對分析，對金錢白花蛇和烏梢蛇的混偽品具有良好的鑒別效果[5]。目前RAPD技術已經(jīng)成功地運用于多種中藥材以及其他動植物的遺傳多樣性分析和品種的鑒別中。RAPD技術在物種遺傳多樣性研究中，結合生物統(tǒng)計學，可實現(xiàn)物種的種屬劃分，達到鑒別的目的。如王義權等運用該技術研究了蛇類的種屬親緣關系[6]。

RAPD技術的優(yōu)點在于：①模板用量少，無需酶切、產(chǎn)物轉移、探針雜交等繁瑣的操作，簡單易行；②含多個隨機引物，標記的分子DNA序列多，可實現(xiàn)全基因組多態(tài)性分析；③實驗條件沒有嚴格的限制，如無需同位素標記、特異性引物設計。但是，近幾年RAPD技術的研究逐漸減少，研究者鮮有單獨使用RAPD技術研究物種DNA分子多態(tài)性。究其原因主要是該技術存在判定標準不同、有序列同源的干擾[7]、實驗結果不具穩(wěn)定性、重復性差[8]等不足。

綜合以上原因使RAPD的單獨使用受到了嚴重的限制。因此，尋找特異性的基因，增加實驗的穩(wěn)定性和重復性，將是蛇類中藥飲片分子鑒別的新方向。

2基于特異性引物擴增的DNA序列分析

在蛇類藥材的分子鑒別研究中，研究者發(fā)現(xiàn)了12S rRNA和Cytb這2個理想的保守基因，可應用特異性PCR擴增技術對其進行擴增檢測，以鑒別蛇類中藥飲片的真?zhèn)巍?/p>

21基于線粒體12S rRNA基因序列的鑒別研究12S rRNA存在于線粒體基因組DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）上，是一種核糖體RNA。作為核外DNA，12S rRNA具有母系遺傳、足夠的變異、結構簡單、無重組等特點。該序列在不同的物種間差異大，而在同一物種內又具有足夠的保守性。因此，可針對該基因序列設計特異性的引物，優(yōu)化實驗條件，最終，以產(chǎn)物在電泳中是否出現(xiàn)目的條帶判斷正偽。

對于蛇類中藥飲片的鑒別，2010年版《中國藥典》收入的烏梢蛇是基于12S rRNA的特異性PCR擴增方法，說明該序列特異性明顯。基于12S rRNA的鑒別研究發(fā)現(xiàn)種內差異對鑒別無影響[9]。12S rRNA序列還可以用于測序鑒別研究，不僅能鑒別烏梢蛇的正偽品，而且可以獲得待測樣本的種屬關系[10]。

目前12S rRNA基因主要作為物種系統(tǒng)進化以及親緣關系的分子標記，除了蛇類研究以外，種屬關系研究較為廣泛和成熟的動物還有龜甲類、鳥類、蛙類、魚類[1114]等，并且都取得了顯著的成績。

22基于Cytb基因序列的鑒別研究Cytb是編碼線粒體內細胞色素b氧化酶亞基基因，與12S rRNA同為理想的基因標記位點：嚴格的母系遺傳，與核基因組DNA無共同序列，沒有基因重組現(xiàn)象。因此該基因在研究基因進化、物種親緣關系和物種的鑒定[1516]等方面同樣具有重要意義。在蛇類中藥飲片的鑒別中，可使用經(jīng)典的Cytb通用引物擴增相關蛇類的目的序列并測序。在中藥蛇類與混偽品的研究中發(fā)現(xiàn)，Cytb基因在同種蛇類中序列差別小，而在不同種蛇類中序列差別大[1718]，說明蛇類Cytb基因是一種理想的分子標記。如果能設計高特異性的引物，優(yōu)化反應條件如退火溫度、酶的活性、反應循環(huán)數(shù)等，不僅可以在種間高效地區(qū)分正偽，也能在序列差異較小的種內準確鑒別。以Cytb基因作為分子標記對銀環(huán)蛇目的序列進行特異性PCR擴增，可快速有效地鑒別銀環(huán)蛇來源的金錢白花蛇[19]，即使在多重PCR擴增體系中，特異性的引物也能穩(wěn)定擴增金錢白花蛇的目的序列，在其常見的偽品赤鏈蛇、赤練華游蛇、金環(huán)蛇中做出準確的鑒別[20]。

雖然基于Cytb基因和12S rRNA基因的物種DNA序列研究日趨完善，但是基于特異性引物擴增的方法在蛇類鑒別中還存在一些不足：①在不同種蛇類研究中，PCR實驗條件的摸索時間較長，成本高，且不容易轉向實際應用；②動物類藥材不同于植物藥材，不會固定生長，不同地區(qū)的同一個物種也可能因為環(huán)境、氣候、地理等原因在序列上存在差異。因此需要收集多個標準品進行對比[9]；③分子鑒別方法自身的不足。對于特殊的蛇類中藥飲片如金錢白花蛇[19]，其藥用基原是銀環(huán)蛇的幼蛇，如有成蛇混在正品中，此方法將無法進行區(qū)分。在實際的鑒別工作中，單考慮某個線粒體基因并不能充分鑒別一個物種，需要結合其他基因位點，并且需要聯(lián)合形態(tài)學和理化特征研究，才能準確鑒別。

3基于通用引物擴增的DNA序列條形碼分析

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術。近年來，基于DNA條形碼的序列擴增方法在物種鑒別領域中得到了快速的發(fā)展和應用，廣泛應用于動植物的鑒定和鑒別中，如昆蟲類[21]、鳥類[22]、魚類[2324]、蛇類[25]等，在物種保護、生物安全、生物多樣性研究等方面具有重要意義。

DNA條形碼技術操作簡便、結果準確、易于推廣。動物類中藥材采用的序列鑒定以細胞色素C氧化亞酶I基因（cytochrome C oxidase subanit Ⅰ gene，COⅠ）為主，以內部轉錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer，ITS2）為輔。COⅠ基因具有高度保守、插入和缺失較少、能夠被通用引物擴增等優(yōu)點，相比同為編碼蛋白的Cytb基因，其通用引物的普適性更強；而與12S rRNA序列相比，該基因片段插入和缺失更少，序列相對簡單，進化速度快，在親緣關系密切的物種鑒別中具有獨特的優(yōu)勢。

基于COⅠ條形碼的分子鑒別，由于可以使用通用引物擴增、獲取未知的目的序列，所以可以使用計算機軟件，將擴增的序列進行測序、序列比對和遺傳距離分析，并構建系統(tǒng)分支樹，從聚類圖中獲得物種的種屬關系；同時也可建立COⅠ數(shù)據(jù)庫，最后進行品種鑒定。這也為蛇類中藥飲片的鑒別提供了定性的方法，COⅠ條形碼技術能夠區(qū)分親緣關系極為接近的烏梢蛇和灰鼠蛇[26]，金錢白花蛇及其混偽品[27]，相比于其他分子標記方法準確性更高。基于COⅠ條形碼的分子鑒別研究已經(jīng)顯現(xiàn)出強大的應用前景，2015年版《中國藥典》已經(jīng)收入記載了中藥材分子鑒定法指導原則。endprint

綜上所述，DNA條形碼技術在物種分子鑒別領域發(fā)展迅速，對于物種親緣關系和遺傳多樣性的研究相比于其他線粒體DNA分子標記物準確性更高，包含的遺傳信息更多。但是仍然存在不足之處：①不能用于混合物鑒別；②中藥材炮制過程中，硫磺熏蒸對DNA檢測存在干擾；③同一物種若存在種內變異，如何確定種內閾值是個難題[28]；④mtDNA中假基因的存在容易產(chǎn)生旁系同源擴增，干擾結果判斷[29]。

4其他分子檢測方法

以上3種分子鑒別方法根據(jù)靶序列性質的不同，分別采用隨機引物、特異性引物、通用引物進行PCR擴增，但它們最后都通過凝膠電泳進行檢測。雖然凝膠電泳是常見的核酸分離方法，但是在實際操作中需要開管取樣，易產(chǎn)生交叉污染，且耗時長，增加了分子檢測的時間和人工成本。實時熒光PCR檢測方法雖然可實現(xiàn)閉管無污染的檢測[30]，但儀器昂貴、技術要求高，限制了其在基層單位的應用。近幾年，隨著材料學的發(fā)展，可視化的檢測方法引起了研究者的興趣，其中最為典型的是基于熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的陽離子高分子聚合物（cationic conjugated polyelectrolytes，CCP）[31]，目前，已有文獻報道將CCP用于蛇類中藥飲片的正偽鑒別中。水溶性的CCP可與帶負電荷的DNA鏈結合，在紫外光激發(fā)下，吸收光能量而顯色。若PCR產(chǎn)物中存在靶序列，CCP與之結合后，能量將傳遞至DNA鏈上修飾了熒光基團的dUTP（fluoresceinlabeled dUTP，F(xiàn)dUTP）上。而CCP自身的能量降低，波長紅移，指示顏色發(fā)生變化。FdUTP作為DNA鏈合成的原料出現(xiàn)在目的PCR產(chǎn)物中，而引物二聚體較短，即使含有少量的FdUTP，也不能引起CCP的顏色變化，因此無假陽性干擾。研究者已經(jīng)對蛇類樣本聯(lián)合運用特異性PCR擴增和CCPFRET進行檢測，證明該檢測方法操作簡單、靈敏度高，在紫外下可實現(xiàn)可視化檢測，且檢測結果與基因測序比對結果一致，具有高度準確性[32]?；谝陨蠑⑹?，有理由相信分子生物學與材料學、物理學乃至更多的學科之間相互交叉融合、優(yōu)勢互補，可促進中藥材鑒別學的快速發(fā)展。

5展望

我國中藥資源豐富，中藥市場潛力巨大，中藥材的準確鑒別是中藥標準化和現(xiàn)代化的第一步。動物類藥材攜帶有自身特有的DNA序列，為分子鑒別奠定了生物學基礎。隨著分子生物學研究的不斷深入，DNA序列分析也將實現(xiàn)科學化與規(guī)范化。如何在實際運用中發(fā)揮它的優(yōu)勢、完善不足是接下來的研究目標，相信分子生物學的不斷進步也將為蛇類中藥飲片鑒別領域的發(fā)展帶來新的突破，為中藥市場的繁榮和穩(wěn)定做出貢獻。

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[責任編輯呂冬梅]endprint