陳全勝 王名星 郭志明 范 沖 孫 浩 趙杰文

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013)

雞肉中假單胞菌的近紅外光譜快速識(shí)別

陳全勝 王名星 郭志明 范 沖 孫 浩 趙杰文

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013)

假單胞菌是雞肉腐敗最主要的致腐菌，為了快速識(shí)別雞肉中的假單胞菌，首先從腐敗雞肉中分離并篩選出致腐菌，進(jìn)一步利用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行生物學(xué)鑒別(分別為蓋氏假單胞菌、嗜冷假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌和熒光假單胞菌)；配置鑒定的4種假單胞菌和等體積混合的4種假單胞菌菌液，采集菌液近紅外透射光譜信息；然后運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，利用聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法篩選出特征波段；最后有比較地運(yùn)用K最近鄰法、最小二乘支持向量機(jī)和反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立5種假單胞菌菌液的近紅外光譜分類識(shí)別模型。其中反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)效果最佳，其訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的識(shí)別率分別為99.17%和95.00%。研究結(jié)果表明，近紅外光譜結(jié)合反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以快速識(shí)別雞肉中的假單胞菌。

雞肉； 近紅外光譜； 假單胞菌； 主成分分析； 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

引言

雞肉在屠宰、包裝、運(yùn)輸過程中極易受微生物的污染，使雞肉腐敗變質(zhì)，破壞雞肉的食用安全以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。假單胞菌是導(dǎo)致雞肉腐敗的最主要致腐菌，常用來作為肉制品有氧和真空包裝產(chǎn)品的加工衛(wèi)生、保存質(zhì)量和貨架期預(yù)測(cè)的指示菌種[2-3]。因此研究監(jiān)控雞肉中致腐假單胞菌的組成及其動(dòng)態(tài)變化情況，對(duì)雞肉食用安全的保障以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的發(fā)揮具有實(shí)際意義。

微生物鑒別方法主要有傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法[4]、分子生物學(xué)技術(shù)鑒定法[5]和免疫學(xué)分析技術(shù)[6]等。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和免疫學(xué)技術(shù)鑒別法前處理繁瑣、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率低，且鑒別的菌株種類有限；分子生物學(xué)技術(shù)鑒定法雖可準(zhǔn)確鑒別相應(yīng)菌株，但操作繁瑣、試劑昂貴、測(cè)定過程耗時(shí)長(zhǎng)，更難以實(shí)現(xiàn)菌種的快速鑒別及判斷[7]。

近紅外光譜分析技術(shù)是一種通過光譜信息反映物質(zhì)內(nèi)部成分的物理測(cè)試技術(shù)，具有分析成本低、操作簡(jiǎn)單、速度快、樣本無需前處理、樣本無損傷等特點(diǎn)，已被廣泛用于食品[8]、農(nóng)產(chǎn)品[9]的定量分析和定性分類。在微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用也越來越廣泛[10-14]。本文利用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)方法對(duì)雞肉中分離出的致腐目標(biāo)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒別后，采集菌體擴(kuò)大培養(yǎng)得到的單菌種菌懸液以及混合菌懸液的近紅外透射光譜信息，并結(jié)合聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法篩選出高相關(guān)性的特征波段，然后比較運(yùn)用K最近鄰法(K-nearest neighbor， KNN)、最小二乘支持向量機(jī) (Support vector machine，SVM)和反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (Back propagation-artificial neural network，BP-ANN) 建立5種假單胞菌的近紅外光譜分類識(shí)別模型，以期得到一種可對(duì)雞肉中致腐假單胞菌快速分類識(shí)別的方法。

1 材料與方法

1.1 雞肉中假單胞菌分離篩選

1.1.1 雞肉樣品準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)所用的雞肉均購(gòu)于江蘇省鎮(zhèn)江市歐尚超市肉制品專柜，均為新鮮雞胸脯肉。購(gòu)買后立即封裝于滅菌樣品袋中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于4℃冰箱保存。

1.1.2 雞肉致腐菌篩選

首先用已殺菌的剪刀從腐敗冷卻雞肉表面取樣10 g，剪碎后放入裝有玻璃珠和90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，封口后置于搖床120 r/min振搖30 min制成菌懸液。將菌懸液逐級(jí)進(jìn)行10倍的稀釋，選取3個(gè)合適稀釋度(10-8～10-6)的菌液，各取100 μL涂布于CFC瓊脂選擇培養(yǎng)基[15]的平板上適溫培養(yǎng)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。然后挑取菌落典型特征不同的單菌落，進(jìn)行平板劃線分離2次，得到純化的單菌落，轉(zhuǎn)接于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基斜面保存待用。

1.1.3 雞肉致腐菌生物學(xué)鑒定

采用PCR技術(shù)對(duì)篩選的菌株進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增測(cè)定。首先取培養(yǎng)12 h的單菌落于30 μL無菌雙蒸水中制成菌懸液，置于PCR儀中100℃煮沸10 min破壁制得模板DNA。采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因；然后以模板DNA 2 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上游引物27F(10.4 nmol/L)1 μL、下游引物1541R (9.9 nmol/L)1 μL和無菌雙蒸水 8.5 μL作為25 μL的PCR反應(yīng)體系；設(shè)置PCR參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸90 s(重復(fù)上述3個(gè)步驟35個(gè)循環(huán))，延伸72℃、10 min，最后10℃冷卻5 min；再用1×TAE配制1%的瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與定量的上樣緩沖液混合后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳時(shí)間30 min；同時(shí)用凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳圖譜；最后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京諾賽基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，登錄美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，所得序列與數(shù)據(jù)庫已知序列進(jìn)行比對(duì)，獲得相似性99%以上的菌株序列，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.2 假單胞菌菌液近紅外光譜采集

1.2.1 菌液樣品準(zhǔn)備

將保藏備用的4種假單胞菌單菌落挑取出來，分別溶于胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Trypticase soy broth, TSB) 中30℃培養(yǎng)12 h，分別取100 μL均勻菌液40管5 mL TSB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)12 h(達(dá)到細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，菌體濃度為107CFU/mL)得到160個(gè)樣本；考慮到在實(shí)際雞肉樣本致腐菌檢測(cè)過程中，不僅存在單一的一種假單胞菌，而通常是多種類別假單胞菌同時(shí)存在，實(shí)驗(yàn)分別將4種細(xì)菌等體積混合的菌液100 μL加入到40管5 mL TSB培養(yǎng)基中相同條件培養(yǎng)作為第5種假單胞菌；由此共制得200個(gè)樣本。

1.2.2 菌液光譜采集和儀器參數(shù)設(shè)置

采用Antaris II型傅里葉變換近紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。光譜采集波數(shù)范圍4 000～10 000 cm-1，波數(shù)間隔為3.856 cm-1，含有1 557個(gè)變量。掃描次數(shù)16次，分辨率8 cm-1。實(shí)驗(yàn)選用透射模式，以儀器內(nèi)置背景為參比，采用儀器標(biāo)配的光程為5 mm、容量約1 mL的標(biāo)準(zhǔn)管為樣品池。在實(shí)驗(yàn)過程中，保持室溫25℃、相對(duì)濕度60%。每個(gè)菌液樣本分裝于4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管，平行采集光譜，4個(gè)光譜數(shù)據(jù)的均值作為該樣本對(duì)應(yīng)的原始光譜數(shù)據(jù)。每種菌液配置40個(gè)樣本，經(jīng)傅里葉變換近紅外測(cè)定后，總共得到200個(gè)樣本的光譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理采用Matlab R2009b(美國(guó)Mathworks公司)軟件完成。

1.3 光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

原始光譜數(shù)據(jù)存在干擾信息，如各種儀器噪聲、樣品背景以及雜散信號(hào)等，這些干擾信息對(duì)建立穩(wěn)定可靠的模型會(huì)有很大的影響；標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(Standardized normal variable transformation, SNV)、多元散射校正、標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)校正、一階導(dǎo)數(shù)以及二階導(dǎo)數(shù)等方法可對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，期望減弱甚至消除這些干擾信息。原始光譜有1 557個(gè)變量，其中存在與待測(cè)樣品無關(guān)的物質(zhì)信息，比如菌液的大量水分子和大量有機(jī)成分的含氫基團(tuán)(如O—H、C—H、N—H等)在近紅外光譜區(qū)產(chǎn)生的各級(jí)倍頻和合頻的吸收；這些非相關(guān)物質(zhì)信息的光譜區(qū)間導(dǎo)致建模過程繁瑣、計(jì)算量大，也會(huì)導(dǎo)致模型的穩(wěn)定性和魯棒性不好。采用聯(lián)合偏最小二乘法(Synergy interval PLS，SiPLS)篩選變量，SiPLS的基本原則是將整個(gè)光譜劃分成若干較小的等距區(qū)間，然后將局部模型精度較高的2～4個(gè)子區(qū)間聯(lián)合起來預(yù)測(cè)樣本品質(zhì)指標(biāo)，利用交互驗(yàn)證均方根誤差(Root mean square error of cross validation, RMSECV)來評(píng)價(jià)聯(lián)合區(qū)間的預(yù)測(cè)能力，RMSECV最小時(shí)為最佳的區(qū)間組合，根據(jù)結(jié)果提取出區(qū)間的全部變量，完成光譜變量的篩選[17]，剔除那些噪聲較大和非相關(guān)的光譜區(qū)域，篩選出高度相關(guān)的特定光譜區(qū)間和具有代表的有效變量；期望模型計(jì)算得到簡(jiǎn)化，建立預(yù)測(cè)能力強(qiáng)、穩(wěn)健性好的識(shí)別模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定結(jié)果

凝膠成像系統(tǒng)拍攝記錄的電泳圖譜如圖1所示，可見4種篩選得到的致腐菌均得到了1.5 kb左右的條帶，于是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序；待測(cè)菌株序列與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫已知序列的比對(duì)，利用同源性在99%以上的菌株序列與目標(biāo)菌株構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出：P9與蓋氏假單胞菌(PseudomonasgessardiiIHBB 9179)親緣關(guān)系最近，P8與嗜冷假單胞菌(Pseudomonaspsychrophilastrain Den-03) 親緣關(guān)系最近，S2與莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonasfragistrain PF04) 親緣關(guān)系最近，T3與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescensstrain PF01)親緣關(guān)系最近。

圖1 4個(gè)菌株的16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electropherogram of PCR amplification products of 16S rRNA

圖2 基于16S rRNA序列同源性的4株致腐菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of four strains based on 16S rRNA gene sequences

2.2 特征波段篩選結(jié)果

2.2.1 光譜預(yù)處理

5種假單胞菌的原始光譜數(shù)據(jù)如圖3a所示，可以看出假單胞菌光譜透射率具有相同的趨勢(shì)，而且相同的波數(shù)下吸收度不同，表明通過近紅外透射光譜信息能有效對(duì)菌株進(jìn)行定性識(shí)別[18]。由于環(huán)境、儀器所帶來的噪聲以及菌液分子不斷運(yùn)動(dòng)的影響，所采集的光譜數(shù)據(jù)摻雜了一些無關(guān)信息，若直接用原始數(shù)據(jù)建模會(huì)降低模型的預(yù)測(cè)效率，影響模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。為了減少近紅外光譜隨機(jī)噪聲的不良影響，使用多種預(yù)處理方法對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。經(jīng)反復(fù)比較，發(fā)現(xiàn)使用SNV的處理效果最佳。圖3b為經(jīng)過SNV預(yù)處理后的光譜，有效消除了光譜的背景和噪聲干擾。

圖3 5種假單胞菌的平均近紅外光譜及SNV預(yù)處理后的近紅外光譜Fig.3 Average original spectra and spectra processed by SNV of five Pseudomonas spp.

2.2.2 特征波段篩選

光譜數(shù)據(jù)變量篩選的結(jié)果如圖4所示，表明將全光譜數(shù)據(jù)劃分成16個(gè)子區(qū)間，主成分?jǐn)?shù)為7時(shí)，聯(lián)合[1 5 8 9]4個(gè)子區(qū)間，獲得的模型最佳，RMSECV為0.19。[1 5 8 9]特征光譜區(qū)間所對(duì)應(yīng)的波數(shù)區(qū)間為3 999.64～4 597.46 cm-1，6 406.37～7 004.19 cm-1，8 211.41～8 805.38 cm-1，8 809.24～9 403.20 cm-1，共622個(gè)變量。篩選的特征光譜區(qū)間中包含了假單胞菌細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等大分子物質(zhì)含量、構(gòu)型和構(gòu)象等信息，可以很好地反映假單胞菌的特征性吸收，提高模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

圖4 聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘模型選擇的最佳子區(qū)間[1 5 8 9]Fig.4 Optimal spectral regions [1 5 8 9] selected by SiPLS

2.3 識(shí)別模型

2.3.1 主成分聚類分析

主成分分析是在盡量不丟失原特征變量的信息前提下，通過正交變換將可能存在相關(guān)性的變量轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)的變量(主成分)，使主成分盡可能多地表征原變量的數(shù)據(jù)特征，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維的多元統(tǒng)計(jì)方法[19]。研究采用主成分分析對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)中的1 557個(gè)變量進(jìn)行數(shù)據(jù)降維壓縮，去除光譜中的重疊信息以及與菌液內(nèi)部化學(xué)成分不相關(guān)的信息。圖5為5種菌液的三維主成分得分圖。

圖5 三維主成分得分圖Fig.5 Three-dimensional projection of PCA results

圖5表明，主成分分析聚類效果顯著，蓋氏假單胞菌、嗜冷假單胞菌、熒光假單胞菌都能很好地聚類分開；莓實(shí)假單胞菌分別與蓋氏假單胞菌以及嗜冷假單胞菌有重疊，原因可能是這3種菌在液體生存條件下內(nèi)部細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)、脂肪較熒光假單胞菌更為類似；混合生長(zhǎng)的假單胞菌菌液集合了所有的4種假單胞菌的化學(xué)物質(zhì)和代謝成分，其中與蓋氏假單胞菌的重疊最多，原因是蓋氏假單胞菌的核酸、蛋白質(zhì)、脂肪含量較其他更高；還有可能是前3個(gè)主成分不能完全代表原始光譜數(shù)據(jù)的信息，需要進(jìn)一步利用模式識(shí)別算法對(duì)其進(jìn)行分類。如圖5所示，前3個(gè)主成分累計(jì)可信度已經(jīng)達(dá)到99%，即前3個(gè)主成分基本能反映原始光譜數(shù)據(jù)的主要信息。

主成分因子數(shù)對(duì)模型的訓(xùn)練和預(yù)測(cè)都有一定的影響，研究依次選取前10個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)為輸入變量(幾乎代表原始變量)，建立分類識(shí)別模型。實(shí)驗(yàn)共采集200個(gè)樣本的近紅外光譜數(shù)據(jù)，采用隨機(jī)分組的方式將全部數(shù)據(jù)分為120個(gè)訓(xùn)練集樣本，80個(gè)預(yù)測(cè)集樣本。

2.3.2 KNN識(shí)別模型

K最近鄰法是一種典型的基于類比的算法，基本思想是給定一個(gè)樣本，如果它與k個(gè)樣本距離最近，則判別這個(gè)樣本與k個(gè)樣本為一類[20]。研究通過優(yōu)化主成分?jǐn)?shù)和k值，建立KNN識(shí)別模型，預(yù)測(cè)集識(shí)別率作為優(yōu)化結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

如圖6b所示，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為7，k為9時(shí)，KNN最佳預(yù)測(cè)集識(shí)別率為65.63%。當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為8，參數(shù)k為7時(shí)，識(shí)別效果最優(yōu)，訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集識(shí)別率分別為65.00%和63.75%。結(jié)果表明，KNN模型并不能很好地對(duì)5種假單胞菌進(jìn)行分類識(shí)別。原因可能是5種假單胞菌的近紅外光譜數(shù)據(jù)并不是線性關(guān)系，嘗試用非線性的方法進(jìn)行模型建立效果可能會(huì)更好。

圖6 KNN模式識(shí)別的訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集Fig.6 Calibration and prediction results for identification of five bacilli based on KNN

2.3.3 SVM識(shí)別模型

支持向量機(jī)是一個(gè)有監(jiān)督功能的學(xué)習(xí)模型，基本原理是遵循結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小化準(zhǔn)則構(gòu)造決策超平面，實(shí)現(xiàn)空間點(diǎn)的劃分，從而進(jìn)行分類識(shí)別，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、適應(yīng)性強(qiáng)、全局最優(yōu)等特點(diǎn)，用于線性和非線性的多元建模[21]。SVM的分類精度主要取決于核函數(shù)與參數(shù)的選取，先確定懲罰系數(shù)C，然后采用網(wǎng)格搜索法對(duì)參數(shù)進(jìn)行2次尋優(yōu)計(jì)算，確定最優(yōu)的參數(shù)(γ,σ2)組合(γ表示正則化參數(shù)，σ表示基于RBF核函數(shù)的參數(shù))。圖7為2次尋優(yōu)計(jì)算過程，尋找的最終組合參數(shù)為(1.722 39，38.667 9)(圖中以紅色五角星標(biāo)記)，SVM訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集識(shí)別率為91.67%和86.25%。結(jié)果表明，基于SVM的5種假單胞菌近紅外光譜分類識(shí)別模型效果顯著。

圖7 網(wǎng)格搜索法尋找的最優(yōu)參數(shù)組合(γ,σ2)Fig.7 Grid search method to find optimal parameters (γ,σ2)

2.3.4 BP-ANN識(shí)別模型

反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，基本原理是通過迭代優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值使得輸入與輸出之間的實(shí)際映射關(guān)系與所期望的映射關(guān)系一致，采用梯度下降算法調(diào)整優(yōu)化各層權(quán)值，使目標(biāo)函數(shù)最小化，具有很強(qiáng)的自學(xué)習(xí)性、自適應(yīng)性、魯棒性以及容錯(cuò)性等特點(diǎn)，是一種靈活的非線性建模算法[22]。依次選取前10個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)為輸入層，模型的輸出層單元數(shù)設(shè)為1個(gè)(即菌株類別)，傳遞函數(shù)為雙曲正切函數(shù)(tanh)，初始權(quán)重為0.95，訓(xùn)練過程中的學(xué)習(xí)因子和動(dòng)量因子都為0.1，訓(xùn)練迭代 100次，結(jié)果如圖8所示。當(dāng)主成分為8時(shí)，BP-ANN的訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的識(shí)別率最高，分別為99.17%和95.00%。

圖8 基于BP-ANN的各主成分的識(shí)別率Fig.8 Identification rate of each principal component based on BP-ANN

2.3.5 3種模型比較分析

3種模式識(shí)別模型結(jié)果如表1所示，近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合BP-ANN方法識(shí)別5種致腐假單胞菌的效果最好。KNN 算法是一種線性的惰性學(xué)習(xí)方法，該方法不事先建立分類模型，主要靠周圍有限、鄰近的樣本，而不是靠判別類域的方法來確定所屬類別，對(duì)于同種不同株的假單胞菌效果不明顯；SVM和BP-ANN都是非線性監(jiān)督機(jī)制的學(xué)習(xí)方法，能有效對(duì)同種不同株的假單胞菌進(jìn)行識(shí)別，2種算法能夠多維度地分析光譜信息特點(diǎn)，更適合對(duì)同種不同株的假單胞菌進(jìn)行分類識(shí)別。因此，研究采用非線性的模式識(shí)別方法對(duì)5種假單胞菌進(jìn)行分類識(shí)別，相較于SVM，BP-ANN利用誤差反向傳遞迭代建模，能更有效根據(jù)光譜信息區(qū)分種內(nèi)菌液的化學(xué)成分和代謝產(chǎn)物。使用BP-ANN算法對(duì)菌種識(shí)別效果最好，識(shí)別率可以達(dá)到95.00%。

表1 基于KNN、SVM和BP-ANN模式的識(shí)別率Tab.1 Identification rates based on KNN，SVM and BP-ANN %

3 結(jié)論

利用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別方法，實(shí)現(xiàn)了雞肉中5種致腐假單胞菌的快速識(shí)別：

(1)首先從腐敗雞肉中篩選分離出了相關(guān)致腐菌并利用PCR技術(shù)鑒定目標(biāo)菌株分別為蓋氏假單胞菌、嗜冷假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌和熒光假單胞菌。

(2)運(yùn)用SNV和SiPLS對(duì)光譜預(yù)處理和特征波段篩選，篩選的波段為3 999.64～4 597.46 cm-1，6 406.37～7 004.19 cm-1，8 211.41～8 805.38 cm-1和8 809.24～9 403.20 cm-1，這些波段與假單胞菌細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等大分子物質(zhì)含量、構(gòu)型和構(gòu)象等信息極相關(guān)。

(3)有比較地運(yùn)用KNN、SVM和BP-ANN建立了5種假單胞菌的分類識(shí)別模型。結(jié)果表明，主成分為8時(shí)的BP-ANN模型預(yù)測(cè)效果最佳，對(duì)應(yīng)的訓(xùn)練集識(shí)別率為99.17%，預(yù)測(cè)集識(shí)別率為95.00%。

(4)研究表明近紅外光譜分析技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、無損地識(shí)別雞肉中分離的4種致腐假單胞菌單菌種及其混合菌種菌液，將有效實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地監(jiān)控雞肉中假單胞菌以及其他致腐微生物的群落組成及其動(dòng)態(tài)變化，縮短檢測(cè)時(shí)間，為雞肉貨架期的延長(zhǎng)提供了有效的參考。

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Rapid Identification ofPseudomonasspp. in Chicken by Near-infrared Spectroscopy

CHEN Quansheng WANG Mingxing GUO Zhiming FAN Chong SUN Hao ZHAO Jiewen

(SchoolofFoodandBiologicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

Pseudomonasspp. is the main bacteria involved chicken degradation which ultimately affects the meat quality and the potential of posing health public health threats. The use of near infrared spectroscopy (NIRS) for rapid identification and monitoring of four strains ofPseudomonasspp. in degrading chicken was attempted. Initially, fourPseudomonasstrains namelyPseudomonasgessardii,Pseudomonaspsychrophila,PseudomonasfragiandPseudomonasfluorescenswere isolated from samples of degrading chicken and identified via polymerase chain reaction (PCR) technology. The different isolatedPseudomonasspp. were cultured in trypticase soy broth (TSB) and incubated at 30℃ for 12 h to growth. The four isolates ofPseudomonasspp. and their combined mixture in equal proportions were all prepared from the incubated inoculum by using 100 mL∶5 mL and each replicated 40 times. The preprocessed data outcomes of the 200 samples using standard normal variable transformation (SNV) exhibited superiority compared with other deployed data preprocessing algorithms such as multiplicative scatter correction (MSC), calibration standard score, first derivative (DB1) and second derivative (DB2). Synergy interval partial least squares (SiPLS) was employed to select relevant characteristics wavelengths such as 3 999.64～4 597.46 cm-1, 6 406.37～7 004.19 cm-1, 8 211.41～8 805.38 cm-1and 8 809.24～9 403.20 cm-1. Principal component analysis (PCA) was performed prior to the model development with loadings of 97.02% in PC1, 2.47% in PC2 and 0.27% in PC3 which indicated the possibility of developing models for the classification of the different samples ofPseudomonasspp. The recognition rates for KNN (65.00%, 63.75%), SVM (91.67%, 86.25%) and BP-ANN (99.17%, 95.00%) were obtained in the training and prediction sets. The model results obtained for SVM was sufficiently high and may be combined with NIRS system for the possiblePseudomonasspp. classification. However, the best result was obtained with BP-ANN built model. These high recognition rates implied near-infrared spectroscopy combined with BP-ANN can be deployed for the rapid detection of differentPseudomonasspp. strains in chicken for the purpose of safeguarding its deteriorating chicken quality.

chicken; near-infrared spectroscopy;Pseudomonasspp.; principal component analysis; artificial neural network

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.08.039

2016-12-16

2017-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371770)、江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(16KJB550002)和江蘇大學(xué)高級(jí)人才基金項(xiàng)目(15JDG169)

陳全勝(1973—)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品、農(nóng)產(chǎn)品快速無損檢測(cè)研究，E-mail: qschen@ujs.edu.cn

O657.33

A

1000-1298(2017)08-0328-07