崔文慧，王岸娜，吳立根

河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 (鄭州 450001)

山奈酚羥基糖基化對(duì)其與獼猴桃糖蛋白相互作用的影響

崔文慧，王岸娜，吳立根*

河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 (鄭州 450001)

通過(guò)多種方法研究了獼猴桃糖蛋白GP2與山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷之間的相互作用。確定其作用的熒光猝滅機(jī)理、猝滅率、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；探究?jī)煞N多酚對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)構(gòu)象的改變。對(duì)兩種多酚與糖蛋白的相互作用進(jìn)行比較，研究山奈酚羥基糖基化對(duì)其與獼猴桃糖蛋白相互作用的影響。

糖蛋白；山奈酚；羥基糖基化；相互作用

獼猴桃因其具有較高的營(yíng)養(yǎng)成分和抗氧化能力，被認(rèn)為是極具利用價(jià)值的水果[1]。獼猴桃果實(shí)含有17種氨基酸，包括除色氨酸外的人體必需的7種氨基酸，其中蛋白質(zhì)含量0.86%～1.85%、總氨基酸含量10.74～17.94 mg/g[2]。獼猴桃含有大量的多酚和維生素C，食用獼猴桃可以預(yù)防心腦血管和神經(jīng)性等多種疾病的發(fā)生。山奈酚(Kaempferol)屬于多酚中的黃酮類(lèi)化合物，主要來(lái)源于植物山奈的根莖，人們已經(jīng)從茶葉，椰子和其他綠色植物中提取出其純品[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),山奈酚對(duì)肺癌、前列腺癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有較好的抑制作用[5]。大多數(shù)多酚類(lèi)化合物都與葡萄糖或鼠李糖結(jié)合成苷,部分以游離狀態(tài)或與鞣質(zhì)結(jié)合的形式存在。山奈酚-3-o-蕓香糖苷(Kaempferol-3-o-rutinoside)是山奈酚中一個(gè)羥基上的氫原子被蕓香糖苷取代而成的山奈酚的雙糖苷，目前對(duì)其研究較少。

多酚與糖蛋白的相互作用在食品生產(chǎn)和加工中較為常見(jiàn)，并且因?yàn)槎叩南嗷プ饔脮?huì)影響蛋白質(zhì)和多酚的特性，因此受到了較高關(guān)注。然而，多酚的種類(lèi)較為豐富，其不同的結(jié)構(gòu)，對(duì)二者的相互作用會(huì)產(chǎn)生不同的影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究山奈酚-3-o-蕓香糖苷和其苷元山奈酚分別與獼猴桃糖蛋白的相互作用，進(jìn)而對(duì)多酚羥基糖基化對(duì)其與獼猴桃糖蛋白相互作用的影響進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

獼猴桃糖蛋白GP2(實(shí)驗(yàn)室自行提取)，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蒸餾水、無(wú)水乙醇、山奈酚(純度≥98%，分子量286，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)、山奈酚-3-o-蕓香糖苷(純度≥98%，分子量595，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)。

溶液配制：糖蛋白GP2濃度為1.0×10-5mol/L；設(shè)置糖蛋白GP2與多酚濃度比為1/0,1/1,1/3,1/5,1/10,1/30,1/60。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；HZT-B5000電子天平，華騰科學(xué)儀器有限公司；pHS-25數(shù)顯pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；WQF-510傅里葉廣紅外光譜儀，天津天光有限公司；BT-1600圖像顆粒分布系統(tǒng)，丹東市百特儀器有限公司；759MC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；Cary Eclipase熒光分光光度計(jì)，美國(guó)VARIAN。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熒光光譜測(cè)定

熒光光譜法是研究蛋白類(lèi)大分子和特異性小分子等相互作用的應(yīng)用最多的一種手段，蛋白質(zhì)分子中的色氨酸殘基(348 nm附近)、酪氨酸殘基(303 nm附近)和苯丙氨酸殘基(282 nm附近)能發(fā)生熒光使其具有內(nèi)源熒光[6]，特異性分子加入后其熒光強(qiáng)度將發(fā)生變化，再根據(jù)有關(guān)方程可以求出二者的相關(guān)參數(shù)。

在溫度310 K下，掃描兩組溶液的熒光光譜。設(shè)置激發(fā)280 nm，范圍290～440 nm掃描猝滅光譜；設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)差值Δλ=15 nm、60 nm，范圍240～320 nm掃描其同步熒光光譜。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

對(duì)于傅立葉變換紅外光譜，大多氨基酸殘基都是發(fā)色團(tuán)，蛋白和多糖的主鏈肽鍵會(huì)產(chǎn)生酰胺帶的振動(dòng)譜帶，常用的分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的是酰胺Ⅰ帶(1 700～1 620 cm-1)，在酰胺Ⅰ帶的譜圖中，1 610～1 640 cm-1范圍為β-折疊結(jié)構(gòu)、1 640～1 665 cm-1范圍為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、1 650～1 658 cm-1范圍為α-螺旋結(jié)構(gòu)、1 660～1 695 cm-1范圍為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[7-8]。近年紅外光譜技術(shù)已發(fā)展成熟，為研究蛋白等大分子的結(jié)構(gòu)功能提供了方便有效的手段。

在環(huán)境溫度下收集樣品的紅外光譜。測(cè)量在中紅外區(qū)域(4 000～400 cm-1)中進(jìn)行。干燥溴化鉀作為本底，掃描16次，分辨率為4 cm-1。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Origin92，PeakFit v4.12等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜法研究

2.1.1 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷對(duì)GP2內(nèi)源熒光的淬滅類(lèi)型

圖1 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷對(duì)獼猴桃糖蛋白GP2熒光猝滅光譜

熒光光譜法是研究藥物小分子與生物大分子之間作用的應(yīng)用較為廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)使用此方法定量的研究山奈酚和山奈酚-3-o-蕓香糖苷在磷酸鹽緩沖液中與獼猴桃糖蛋白GP2的結(jié)合。在350 nm附近，蛋白質(zhì)分子中色氨酸(Trp)的熒光強(qiáng)度最大[9]，選擇此處進(jìn)行計(jì)算，并且山奈酚和山奈酚-3-o-蕓香糖苷不會(huì)產(chǎn)生熒光。圖1可以看出，兩種多酚均可以使獼猴桃糖蛋白GP2的熒光發(fā)生猝滅，并且，隨著濃度的增大，猝滅程度依次增強(qiáng)。這表示兩種多酚都與獼猴桃糖蛋白GP2發(fā)生了結(jié)合，并且改變了其結(jié)構(gòu)。

圖2 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷對(duì)GP2的熒光猝滅相對(duì)變化

在310 K時(shí), 山奈酚和山奈酚-3-o-蕓香糖苷對(duì)GP2的猝滅狀況如圖2。在較高濃度范圍下，同濃度的山奈酚-3-o-蕓香糖苷更強(qiáng)地猝滅了GP2的內(nèi)源熒光,即山奈酚母核羥基的糖基化增加了其對(duì)糖蛋白GP2內(nèi)源熒光的猝滅，山奈酚-3-o-蕓香糖苷與色氨酸基團(tuán)的相互作用比山奈酚更強(qiáng)。

圖3 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷猝滅GP2內(nèi)源熒光的Stern-Volmer曲線

熒光猝滅過(guò)程被認(rèn)為有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。假定兩種多酚對(duì)GP2內(nèi)源熒光的猝滅為動(dòng)態(tài)淬滅過(guò)程,用式(1)Stem-Volmer方程式和圖3計(jì)算猝滅過(guò)程速率常數(shù)Kq，根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù),生物高聚物的不同猝滅劑的最大分散碰撞常數(shù)是2.0×1010L/mol·s。以此來(lái)判斷其猝滅類(lèi)型。

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

計(jì)算得到表1, 山奈酚和山奈酚-3-o-蕓香糖苷對(duì)GP2的雙分子猝滅速率常數(shù)Kq分別比2.0×1010L/mol·s大1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，這說(shuō)明GP2內(nèi)源熒光的猝滅不完全是由動(dòng)態(tài)猝滅引起的,而是形成了復(fù)合物引起的,即靜態(tài)猝滅過(guò)程或者是動(dòng)靜態(tài)聯(lián)合猝滅。

表1 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷與GP2相互作用的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv、猝滅速率常數(shù)Kq

項(xiàng)目Ksv/(104L/mol)Kq/(1012L/mol·s)山奈酚0．496±0．0020．496±0．002山奈酚-3-o-蕓香糖苷2．019±0．0022．019±0．003

2.1.2 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷與GP2相互作用作用的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

圖4 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷與糖蛋白GP2相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線圖

靜態(tài)猝滅過(guò)程可用式(2)計(jì)算有關(guān)結(jié)合參數(shù)，作圖4，分別根據(jù)兩條雙對(duì)數(shù)曲線的斜率和截距，得到山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷與糖蛋白GP2相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，表2所示。

lg [(F0- F)/F]=lgKa+nlg [Q]

(2)

表2 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷與糖蛋白GP2相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n、結(jié)合常數(shù)Ka

項(xiàng)目nKa/(L/mol)山奈酚0．506±0．0020．773×102±0．002山奈酚-3-o-蕓香糖苷1．074±0．0022．330×104±0．003

經(jīng)計(jì)算山奈酚和山奈酚-3-o-蕓香糖苷的表觀結(jié)合常數(shù)分別為77.321和2.331×104L/mol。山奈酚-3-o-蕓香糖苷的表觀結(jié)合常數(shù)比山奈酚大3個(gè)數(shù)量級(jí)。兩種物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為0.506與1.074,可認(rèn)為二者與GP2只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 同步熒光光譜法研究

實(shí)驗(yàn)采用固定波長(zhǎng)差的同步熒光光譜來(lái)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。當(dāng)發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)的差值為15 nm時(shí)，圖譜顯示出酪氨酸殘基的吸收峰，當(dāng)差值為60 nm時(shí)，顯示的為色氨酸殘基的特征峰[11]。

圖5所示，隨著山奈酚濃度的升高，色氨酸殘基和酪氨酸殘基的熒光吸收峰都依次降低，色氨酸殘基的最大熒光波長(zhǎng)發(fā)生明顯紅移，而酪氨酸殘基無(wú)明顯變化，說(shuō)明糖蛋白GP2的構(gòu)象發(fā)生了改變，疏水性降低，肽鏈變得更加伸展，并且表明山奈酚與糖蛋白GP2相互作用的結(jié)合位點(diǎn)偏向于色氨酸。

注：依次為Δλ=15、60 nm。 圖5 310 K山奈酚與糖蛋白GP2相互作用的同步熒光光譜

圖6所示，隨著山奈酚-3-o-蕓香糖苷濃度的升高，色氨酸殘基和酪氨酸殘基的熒光吸收峰都依次降低，色氨酸殘基則出現(xiàn)了明顯的紅移，表明糖蛋白GP2的構(gòu)象變化，色氨酸殘基附近的疏水性降低，肽鏈伸展，可能是由于山奈酚-3-o-蕓香糖苷與糖蛋白GP2相互作用的結(jié)合位點(diǎn)偏向于色氨酸。

2.3 傅里葉變換紅外光譜法研究

通過(guò)傅里葉變換紅外光譜法量化多酚類(lèi)型和性質(zhì)對(duì)獼猴桃糖蛋白GP2二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究中，α-螺旋結(jié)構(gòu)表現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子的致密性，其它結(jié)構(gòu)反映了蛋白質(zhì)分子的松散性，如β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲等[12]。獼猴桃糖蛋白GP2二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的定量分析示于表3中。糖蛋白GP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為15.1%α-螺旋，37.1% β-折疊，28.9%β-轉(zhuǎn)角和16.3%無(wú)序結(jié)構(gòu)。糖蛋白GP2與山奈酚結(jié)合后，濃度對(duì)結(jié)果的影響沒(méi)有明顯的規(guī)律。在濃度比為1/5時(shí)，α-螺旋和β-折疊增加到最大，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)序結(jié)構(gòu)含量最低，表明在此濃度下，糖蛋白GP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最大。糖蛋白GP2與山奈酚-3-o-蕓香糖苷結(jié)合后，在濃度比為1/60時(shí)，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲程度最大。

注：依次為Δλ=15、60 nm。 圖6 310 K山奈酚-3-o-蕓香糖苷與糖蛋白gp2相互作用的同步熒光光譜

表3 山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷與糖蛋白GP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究了山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷和獼猴桃糖蛋白GP2的相互作用，研究表明，山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷都使糖蛋白GP2發(fā)生了熒光猝滅，類(lèi)型為靜態(tài)猝滅或動(dòng)靜態(tài)聯(lián)合猝滅；相比山奈酚，山奈酚-3-o-蕓香糖苷和GP2有更大的結(jié)合常數(shù)。兩者與GP2均只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)都偏向與酪氨酸；兩者都引起了糖蛋白GP2構(gòu)象上的變化，并且反應(yīng)的濃度比對(duì)GP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)有較大影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于從分子層面上解析探索多酚與糖蛋白之間的相互作用，以及二者相互作用與多酚結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為其更好的利用提供價(jià)值。

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Effect on hydroxylation of karethapine on its interaction with kiwi glycoprotein

Cui Wenhui, Wang Anna, Wu Ligen*

School of Food Science and Technology， Henan University of Technology (Zhengzhou 450001)

The interaction between kiwifruit glycoprotein GP2 and kaempferol, kaempferol-3-o-rutanoside was studied by a variety of methods. The fluorescence quenching mechanism, the quenching rate, the binding constant and the number of binding sites were determined. The changes of secondary and tertiary conformations of two polyphenols were explored. The effects of the glycosylation of kaempferol on the interaction between the two polyphenols and the glycoprotein were studied.

glycoprotein; kaempferol; hydroxyl glycosylation; interaction

2017-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：31201294)；糧食公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào)：201313011)；河南省省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助(項(xiàng)目編號(hào)：2014YWJC05)。

崔文慧，女，1993年出生，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

*通訊作者：吳立根，男，1969年出生，副教授，研究方向?yàn)槭称芳庸づc營(yíng)養(yǎng)。

TS201

A

1672-5026(2017)04-031-05