祖立闖，謝金文，王金良，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

我國豬流行性腹瀉流行現(xiàn)狀分析及變異毒株鑒別檢測方法研究進展

祖立闖1，謝金文2，王金良2，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的以仔豬嘔吐、腹瀉、脫水、死亡為主要特征的一種急性、高度接觸性、病毒性腸道傳染病[1-2]。該病于1971年在英國被首次報道，隨后在日本、德國和比利時等許多國家均有報道，我國于1983年首次發(fā)現(xiàn)該病[3]，隨后開始在我國呈散發(fā)性、區(qū)域性流行，其流行和危害程度得到了一定的控制。但自2010年末開始，我國豬場陸續(xù)暴發(fā)了由PEDV變異毒株引起的以新生仔豬嚴重嘔吐、水樣腹瀉、腸道出血和高病死率為主要特征的“頑固性腹瀉”疫情[4-5]，引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注，甚至普遍認為變異型PED將是未來幾年內(nèi)危害仔豬最為嚴重的腹瀉病之一。為全面掌握目前我國豬群中PED流行現(xiàn)狀，筆者查閱2010年變異毒株開始流行以來我國在PEDV毒株分離鑒定、流行病學監(jiān)測、遺傳變異等方面研究資料，整理與分析出了目前我國PEDV的流行現(xiàn)狀與流行特點，并綜述了PEDV變異株的鑒別檢測方法，對目前我國PED的防控具有一定的參考價值。

1 病毒分離鑒定情況

如表1所示，對2010年至今國內(nèi)PEDV野毒株的分離鑒定情況進行匯總分析，呈現(xiàn)出以下幾個顯著特點。

1.1 分離鑒定率高

2011—2016年，6年時間里國內(nèi)共分離鑒定出PEDV野毒株高達38株，平均6.33株/年，病毒分離鑒定率較高。

1.2 變異毒株成為優(yōu)勢毒株

在38株P(guān)EDV野毒株中有28株完成了毒株類型的鑒定，而這完成了毒株類型鑒定的28株均為變異毒株，變異株已成為當前PEDV的流行優(yōu)勢毒株。

1.3 分離范圍廣

38株P(guān)EDV野毒株覆蓋了福建、江蘇、四川、上海、廣東、河北、山東、安徽、云南、新疆、內(nèi)蒙古、吉林、青海、貴州、北京、湖北、甘肅、山西、浙江、陜西、江西等21個省市，呈全國性流行。

1.4 由南向北、由沿海向內(nèi)陸逐步流行

病毒開始由福建、江蘇、四川、廣東向安徽、上海、山東、河北流行，隨后逐步流行至北京、吉林、內(nèi)蒙古。

表1 2010年以來PEDV野毒株分離鑒定情況匯總

2 流行病學監(jiān)測情況

隨著PEDV變異毒株的日益流行，以及我國對PEDV感染的逐步重視，我國研究學者對不同地區(qū)的PEDV感染情況進行了大量的流行病學監(jiān)測。如表2所示，自2010年以來，我國豬場PEDV陽性感染率一直居高不下，區(qū)域性流行特點顯著，如2012—2013年四川的感染率高達86.67%，2014—2015年山西的感染率達73.26%，2015—2016年黑龍江、吉林、遼寧等3省的感染率達74.62%。PEDV在我國豬群中已廣泛流行，且在個別地區(qū)感染率較高，感染情況比較嚴峻，應(yīng)加強重視。

表2 2010—2017年P(guān)EDV流行病學監(jiān)測情況匯總

3 遺傳變異分析情況

對病毒進行遺傳變異分析可以從分子水平發(fā)現(xiàn)PEDV流行病毒株之間的差異以及遺傳和衍化規(guī)律，明確PEDV不同時間、不同地區(qū)流行毒株的基因亞型與變異情況，能夠為尋找病毒的傳播路徑以及為不同地區(qū)因地制宜的制定防控措施提供指導。吳旺霞等[5]對浙江省2011—2016年P(guān)EDV流行毒株與疫苗株的S基因和ORF3基因進行了RT-PCR擴增、克隆及測序，并對其序列變異、遺傳進化和抗原位點進行分析?；蜃儺惙治鼋Y(jié)果顯示，與國內(nèi)疫苗株CV777相比，流行毒株S基因存在15個核苷酸插入和6個核苷酸缺失，導致氨基酸序列存在5個氨基酸插入（58QGVN61和140N）和2個氨基酸缺失（163DI164），且在主要突變區(qū)S1區(qū)的2個中和表位（499-638和764-771 aa）有8處氨基酸突變，且ORF3基因有7處氨基酸變異。遺傳進化分析結(jié)果顯示，流行毒株S基因與亞洲主要疫苗株（國內(nèi)疫苗株CV777和韓國弱毒疫苗株DR13）的同源性僅為93.3%～94.9%，而與2011—2016年中國流行株（BJ-2011和Hu N）的同源性高達97.8%～99.9%，表明PEDV已呈現(xiàn)較大程度的遺傳變異。王飛等[53]對2014—2015年分離的9株P(guān)EDV毒株的S基因進行克隆和測序，并將其分別與疫苗株、中國2010年前經(jīng)典毒株、中國2010—2013年出現(xiàn)的毒株及韓國、美國近年來流行毒株進行S基因序列比對、分析。結(jié)果顯示，9株P(guān)EDV S基因核苷酸同源性為98.4%～99.5%，與疫苗株和中國2010年前經(jīng)典毒株相比核苷酸同源性為93.4%～96.2%，與中國、韓國、美國近年來暴發(fā)的毒株相比核苷酸同源性為97.4%～99.2%，現(xiàn)階段PEDV S基因已發(fā)生較大變異，存在高度相似的缺失，插入和變異，且在中和表位區(qū)域存在多處變異。遺傳進化樹顯示，我國常用的疫苗毒株CV777處于G1組，這9株毒株S基因均位于G2組，說明我國當前流行毒株與疫苗株和早期經(jīng)典毒株的親緣性相去較遠。表明我國PEDV流行毒株以變異株為主，變異毒株的抗原位點、糖基化位點和跨膜螺旋較以往的疫苗株發(fā)生了較大變異，提示PEDV在近年呈現(xiàn)快速變異和進化的趨勢，常規(guī)疫苗有可能無法提供良好的免疫保護，需要開發(fā)新型疫苗以及制定更具針對性的防控措施來控制PEDV的流行與暴發(fā)。

4 變異株鑒別檢測方法

通過對PEDV流行毒株的分離鑒定以及遺傳變異分析表明PEDV變異毒株目前是我國的優(yōu)勢流行毒株，且其感染率較高。PEDV變異毒株感染應(yīng)該是造成我國目前PED疫苗免疫失敗和仔豬高致死率的主要原因，亟待建立可以準確區(qū)分PEDV變異毒株的鑒別診斷方法。對于PEDV變異毒株的鑒別診斷，主要依靠基于PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、疫苗毒株核酸序列差異的分子生物學方法和基于高特異性單克隆抗體的血清學方法。本文綜述了PEDV變異株的鑒別診斷方法，以期對PEDV變異株感染進行早期快速、準確診斷，淘汰凈化變異毒株感染豬，為制定PED綜合防控措施提供依據(jù)。

4.1 RT-PCR方法

RT-PCR首先以病毒的基因組RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，能檢測到病原體特有的核苷酸序列，是疾病病原檢測中最常用的一種分子生物學診斷技術(shù)。多重RT-PCR方法是在單一RT-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上建立起來的，可在同一個反應(yīng)體系中加入多對引物同時對多個目的基因進行擴增，可在一次PCR反應(yīng)過程中檢測到多個致病原。秦毅斌等[54]根據(jù)Gen－Bank中PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因，設(shè)計合成2對特異性擴增引物，通過目的片段的數(shù)量和片段大小來判斷PEDV的毒株類型，建立了檢測不同PEDV毒株類型的雙重RT-PCR鑒別檢測方法，該方法中PEDV變異毒株能同時擴增出234 bp和826 bp的2條目的條帶，PEDV經(jīng)典毒株只能擴增出1條234 bp的目的條帶，弱毒疫苗株只能擴增出1條185 bp的目的條帶，該方法檢測A群豬輪狀病毒（PRoVA）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒（PPV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬嵴病毒（PKV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細環(huán)病毒（TTV）均為陰性，能檢測到的最低核酸濃度為2.3×10-4ng/μL，該方法檢測91份臨床腹瀉樣品，變異毒株陽性感染率為62.64%（57/91），經(jīng)典毒株陽性感染率為3.30%（3/91），弱毒疫苗株陽性率為4.40%（4/91）。該多重RT-PCR鑒別檢測方法能特異性區(qū)分PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株，可用于PEDV經(jīng)典株、變異株和疫苗株的臨床快速鑒別檢測和流行病學調(diào)查。施開創(chuàng)等[55]針對PEDV S和ORF3基因序列設(shè)計3對特異性引物，經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了能夠同時檢測并區(qū)分PEDV經(jīng)典株、變異株、疫苗株的三重RT-PCR方法，該方法中能同時擴增429 bp和198 bp者為經(jīng)典株，能同時擴增274 bp和198 bp者為變異株，能同時擴增429 bp和148 bp者為疫苗株。該方法利用3對特異性引物實現(xiàn)了在同一個擴增反應(yīng)中鑒別檢測PEDV 3種不同毒株的目標，為PEDV變異毒株的鑒別診斷與流行病學調(diào)查提供了可靠的技術(shù)手段。PCR方法具有操作簡單、檢測迅速、特異、靈敏等優(yōu)點，特別適合具有一般試驗條件的基層實驗室使用，將具有廣闊的開發(fā)與推廣應(yīng)用前景。

4.2 血清學方法

PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、疫苗株之間存在高度序列同源性和血清學交叉反應(yīng)性，因而難以用普通的血清學方法將PEDV變異毒株區(qū)分開。單克隆體抗體具有高度的特異性和敏感性，能夠識別病毒抗原結(jié)構(gòu)的微小差異，因此，獲得PEDV變異毒株的特異性單克隆體抗體成為建立區(qū)分PEDV變異毒株血清學診斷方法的關(guān)鍵。雷喜梅等[56]以純化的PEDV變異株（CH/ZMDZY/11）S蛋白N端高變區(qū)（22-380 aa）重組蛋白為抗原免疫BALB/C小鼠，以純化CH/ ZMDZY/11全病毒及帶His標簽的重組蛋白分別為篩選抗原，利用淋巴瘤雜交技術(shù)獲得了一株穩(wěn)定分泌抗S蛋白特異性單克隆抗體細胞株，該單克隆抗體誘生小鼠產(chǎn)生的腹水抗體效價為1∶3 200，免疫球蛋白類型為IgM。ELISA檢測該單克隆抗體與PEDV變異毒株與疫苗株的反應(yīng)顯著差異，可區(qū)分變異毒株和疫苗毒株，有望成為PEDV變異株抗原檢測的特異性抗體。李加飛等[57]將含有PEDV變異株S1基因的1個抗原表位（83-276 aa）的重組蛋白免疫BALB/C小鼠，成功制備了2株能夠產(chǎn)生抗PEDV S蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為1E5和5B7。間接免疫熒光試驗表明，5B7單克隆抗體可以識別天然狀態(tài)下的PEDV顆粒，與變異株和經(jīng)典毒株均發(fā)生反應(yīng)，而1E5單克隆抗體只與變異株發(fā)生特異性反應(yīng)，與經(jīng)典毒株不反應(yīng)。表明所制備的抗PEDV S蛋白的1E5單克隆抗體能夠有效檢測和區(qū)分PEDV變異株和經(jīng)典毒株，且對病原檢測具有較強的特異性，為研制基于單克隆抗體的PEDV變異毒株血清學鑒別診斷方法奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

5 結(jié)語

2010 年以來，我國PED流行現(xiàn)狀分析表明，PEDV變異毒株目前是我國PEDV流行的優(yōu)勢毒株，且其區(qū)域性流行特點顯著，部分地區(qū)感染率較高，感染情況比較嚴峻，變異毒株在我國豬群中的流行已不容忽視，應(yīng)加強重視。針對PEDV變異毒株鑒別診斷方法研究已經(jīng)有了突破性進展，研究學者已陸續(xù)建立了能夠鑒別診斷PEDV變異株的RT-PCR方法，以及研制了針對PEDV變異毒株的單克隆抗體，這都將大幅有助于我國對PEDV變異毒株的鑒別診斷和有效防控。但RT-PCR方法敏感性有限，且擴增后電泳檢測需要使用溴化乙錠（EB），對試驗人員身體健康和生態(tài)環(huán)境均造成潛在威脅；具有高度特異性、能夠區(qū)分PEDV變異毒株的單克隆抗體只是建立PEDV變異毒株血清學鑒別檢測方法的物質(zhì)基礎(chǔ)，故對于PEDV變異毒株的鑒別檢測方法仍需進一步完善。相信隨著PEDV變異毒株病原學和致病機制研究的不斷深入，高敏感性、高特異性PEDV變異毒株單克隆抗體的不斷獲得，以及分子生物學技術(shù)和免疫學技術(shù)尤其是熒光定量PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)在PEDV檢測中的不斷開發(fā)應(yīng)用，PEDV變異毒株熒光定量RT-PCR鑒別檢測方法和ELISA鑒別檢測方法將會陸續(xù)問世，進而為PEDV變異毒株的鑒別檢測提供敏感性更高、特異性更強、全封閉反應(yīng)、定量準確、不需要電泳的新型分子生物學檢測技術(shù)和操作簡單、檢測快速、敏感、特異、高通量的血清學檢測技術(shù)，實現(xiàn)PEDV變異毒株的準確、快速、鑒別診斷，逐步實現(xiàn)PEDV變異毒株區(qū)域凈化，并最終達到全國凈化的目標。

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（編輯：郭玉翠）

S858.285.3

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1002-1957(2017)04-0117-04

2017-06-29

山東省自然科學基金資助項目（ZR2016CM35）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-08-17）作者簡介：祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術(shù)研究工作.E-mail：zulichuang2008@126.com