劉二偉，楊紹青，閆巧娟，江正強(qiáng),*

泡盛曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的條件優(yōu)化

劉二偉1，楊紹青2，閆巧娟3，江正強(qiáng)2,*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

從土壤樣品中篩選得到一株高產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌，經(jīng)鑒定為泡盛曲霉（Aspergillus awamori），命名為Aspergillus awamori CAU33。依次采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化了其液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的條件，得到該菌株產(chǎn)酶的最適條件為：玉米芯質(zhì)量濃度55 g/L、大豆蛋白胨質(zhì)量濃度25 g/L、曲拉通X-114質(zhì)量濃度23 g/L、初始pH 4.5、培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時(shí)間6 d。在此條件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力達(dá)到8 447 U/mL，為優(yōu)化前的17.6 倍。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶；液體發(fā)酵；優(yōu)化；泡盛曲霉

β-1,3-1,4-葡聚糖是由葡萄糖通過(guò)β-1,3和β-1,4混合的糖苷鍵鏈接而成的直鏈葡聚糖，主要存在于谷物的胚乳和細(xì)胞壁中[1]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）是一類重要的水解酶，可以水解谷物中的β-1,3-1,4-葡聚糖，這一特性使其在啤酒釀造和飼料工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[2]。在啤酒釀造過(guò)程中，β-1,3-1,4-葡聚糖酶可通過(guò)降低麥芽汁中β-葡聚糖的含量，從而降低黏度、提高過(guò)濾速率，提升啤酒生產(chǎn)效率和品質(zhì)[3]。在飼料生產(chǎn)過(guò)程中添加該酶可有效降低動(dòng)物消化道食糜的黏度，提高飼料的轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[4-5]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要來(lái)源于微生物，細(xì)菌中多以芽孢桿菌為主，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[6]、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefacien）[7]、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[8]和特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）[9]等。真菌如黑曲霉（Aspergillus niger）[10-11]、嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）[12]、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）[13-14]、樟絨枝霉（Malbranchea cinnamomea）[15]、局限曲霉（A. restrictus）[16]、土曲霉（A. terreus）[17]、康氏木霉（Trichoderma kongingii）[18]和碎囊毛霉（Mucor petrinsularis）[19]等也報(bào)道產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶。曲霉屬真菌是β-1,3-1,4-葡聚糖酶的主要來(lái)源之一，近年來(lái)曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究主要集中于黑曲霉（A. niger）[10-11]，尚鮮有泡盛曲霉（A. awamori）產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究報(bào)道。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是微生物生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中利用葡聚糖時(shí)產(chǎn)生的一種胞外酶，在發(fā)酵過(guò)程中其產(chǎn)酶量的高低主要與該菌株相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。同時(shí)β-1,3-1,4-葡聚糖酶也是一類誘導(dǎo)酶，通過(guò)一定外部培養(yǎng)條件的優(yōu)化可以提高其編碼基因的表達(dá)量，從而提高其酶活力。然而目前已報(bào)道野生菌發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的水平普遍較低[6,8-9,16-19]，其中米黑根毛霉來(lái)源β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力最高（6230 U/mL）[13]。本研究從自然界中篩選得到一株高產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌，對(duì)菌株進(jìn)行了鑒定并優(yōu)化了該菌株液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的發(fā)酵條件，為其后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

大麥β-葡聚糖 美國(guó)Sigma公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板初篩培養(yǎng)基：燕麥β-葡聚糖5 g/L、酵母提取物10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCl20.3 g/L、臺(tái)盼藍(lán)0.1 g/L、瓊脂20 g/L、青霉素1 g/L、卡那霉素1 g/L。

平板分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L。

搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基：燕麥粉20 g/L、酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCl20.3 g/L。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：燕麥粉20 g/L、酵母提取物10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCl20.3 g/L，自然pH值。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)試驗(yàn)設(shè)備廠；DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；TU-1800PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；BS-124S型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力及蛋白含量測(cè)定

參照Yang Shaoqing等[12]的方法測(cè)定β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力：添加50 μL 1 g/100 mL大麥β-葡聚糖于小試管中，55 ℃預(yù)熱3 min后加入150 μL用50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）適當(dāng)稀釋的酶液，55 ℃反應(yīng)10 min，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，采用DNS法測(cè)定產(chǎn)生的還原糖量。β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力單位（U）定義為在上述條件下每分鐘水解大麥β-葡聚糖生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量（U/mL）。

蛋白含量的測(cè)定參照Lowry等[20]方法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.2 菌種篩選

取約1 g土樣懸浮于1 mL無(wú)菌水中，混勻后取100 μL混合液用涂布棒涂抹均勻于初篩培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。挑取菌落周圍培養(yǎng)基呈現(xiàn)透明圈的菌株轉(zhuǎn)接到分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d。從PDA培養(yǎng)基上切下約1 cm2有透明圈的菌塊接入搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)4 d后取約1 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力。

1.3.3 菌種鑒定

菌種形態(tài)鑒定：觀察產(chǎn)酶菌株在鑒定培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：采用ITS基因序列鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

參照Wang Long等[21]的方法提取鑒定菌株DNA。ITS基因擴(kuò)增：ITS序列采用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進(jìn)行擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系：5 μL 10×PCR Buffer，4 μL dNTP，上游引物和下游引物各1 μL，0.2 μL DNA模板，0.2 μL ExTaqDNA聚合酶，滅菌雙蒸水定容至50 μL。PCR條件：94 ℃變性30 s、48 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s、30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下保溫。

DNA序列測(cè)定、序列比對(duì)和種屬發(fā)育分析：將PCR產(chǎn)物委托北京三博遠(yuǎn)志技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。測(cè)得菌株ITS的序列后，在NCBI上利用BLAST程序?qū)Ρ?，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取有關(guān)種的標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，用ClustalX進(jìn)行多序列對(duì)比分析，使用MEGA 6中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[22]，利用自展法檢驗(yàn)各分支置信度[23]。

1.3.4 泡盛曲霉CAU33液體發(fā)酵產(chǎn)酶單因素試驗(yàn)

將大小為1 cm2的菌絲塊接到裝有50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 d。然后將發(fā)酵液于4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，上清液即為β-1,3-1,4-葡聚糖酶粗酶液。

采用單因素試驗(yàn)法優(yōu)化泡盛曲霉CAU33液體發(fā)酵的產(chǎn)酶條件。碳源分別為可溶性淀粉、稻草、玉米桿、玉米芯、小麥麩皮、燕麥粉、葡萄糖、青稞粉，質(zhì)量濃度為10～70 g/L；氮源分別為酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、乙酸銨、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4，質(zhì)量濃度為10～60 g/L；表面活性劑質(zhì)量濃度為5～30 g/L；初始pH 2～7；培養(yǎng)溫度20～50 ℃；發(fā)酵時(shí)間為1～8 d。每組設(shè)3 個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取玉米芯、大豆蛋白胨和曲拉通X-114質(zhì)量濃度3 個(gè)因素為自變量，以酶活力為響應(yīng)值，以單因素試驗(yàn)所得最適結(jié)果為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心，進(jìn)行三因素五水平中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）響應(yīng)面試驗(yàn)，包括14 個(gè)分析試驗(yàn)和6 個(gè)中心試驗(yàn)，共20 組試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析及擬合度檢驗(yàn)，討論響應(yīng)面特征，確定液體發(fā)酵條件的最適條件。最后以優(yōu)化后的條件參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，驗(yàn)證模型的有效性。

表1 CCD響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素及水平Table 1 Factors and their corresponding levels used for CCD

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選與鑒定

圖1 菌株CAU33菌落形態(tài)（A）及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（B）Fig. 1 Colony morphology (A) and conidial fructification (B) of strain CAU33

通過(guò)反復(fù)定向初篩和搖瓶復(fù)篩，篩選出200多株能夠分泌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的菌株，大部分的原始產(chǎn)酶水平都較低，介于5～100 U/mL之間（數(shù)據(jù)略）。其中從采集自河南的一個(gè)土壤樣品中篩選出的一株絲狀真菌產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力較高，為453.7 U/mL。因此后續(xù)對(duì)該菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，該菌株在分離培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)迅速，30 ℃條件下培養(yǎng)4 d時(shí)直徑達(dá)到7 cm，菌落平坦，呈暗褐黑色，無(wú)溶出液，菌落邊緣為白色，菌落反面帶黃色（圖1A）。顯微鏡觀察該菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為球形，孢子呈球狀（圖1B）。菌落及孢子形態(tài)呈現(xiàn)典型的曲霉特征[24]。

圖2 菌株CAU33的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of strain CAU33 based on ITS sequences

進(jìn)一步采用分子生物學(xué)的方法鑒定菌株。提取菌株CAU33的ITS基因序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增、測(cè)序后得到全長(zhǎng)為537 bp的基因序列，選取與GenBank中相似度較高的同屬菌株ITS基因序列進(jìn)行比對(duì)。利用ClustaX1.83和Mega 6進(jìn)行分析，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明該菌與A. awamori bxq33110的相似度最高（圖2）。結(jié)合菌落形態(tài)、孢子形態(tài)等特征進(jìn)行綜合分析，鑒定該菌為泡盛曲霉（A. awamori）[25]，命名為泡盛曲霉CAU33。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在食品和飼料工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，近年來(lái)受到了研究者的關(guān)注[4]。目前國(guó)內(nèi)外已有許多相關(guān)研究報(bào)道，但是真菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究仍相對(duì)較少[10-19]。曲霉屬菌株是酶制劑工業(yè)的重要生產(chǎn)菌種之一，迄今已有少量曲霉屬菌株產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究報(bào)道，如黑曲霉[10]、局限曲霉[16]和土曲霉[17]等。泡盛曲霉主要存在于土壤、空氣及各種腐敗的有機(jī)物上，有文獻(xiàn)報(bào)道泡盛曲霉能夠用于發(fā)酵制備β-1,4-葡聚糖酶、木聚糖酶、阿魏酸脂酶、菊粉酶以及葡糖淀粉酶等[26-30]，但是尚無(wú)該菌株發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究報(bào)道。

2.2 碳源對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

考察了可溶性淀粉、稻草、玉米桿、玉米芯、小麥麩皮、燕麥粉、葡萄糖、青稞粉不同碳源對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響，結(jié)果表明以玉米芯為碳源時(shí)酶活力最高為755.7 U/mL，其次為青稞粉（681.1 U/mL）（表2）。玉米芯誘導(dǎo)高產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶可能是由于玉米芯中含有豐富的纖維素等可提供泡盛曲霉CAU33代謝利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此選擇玉米芯作為泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最適碳源。

表2 不同碳源對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Table 2 Effect of carbon sources on β-1,3-1,4-glucanase production by A. awamoriCAU33U/mL

確定玉米芯為最適碳源后，進(jìn)一步考察玉米芯的添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明玉米芯添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響較為顯著，當(dāng)其質(zhì)量濃度由10 g/L增加到50 g/L時(shí)，酶活力逐漸升高，質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力最高為2 146 U/mL，之后繼續(xù)提高玉米芯質(zhì)量濃度時(shí)，酶活力沒(méi)有明顯增加（圖略）。此外，研究發(fā)現(xiàn)玉米芯的添加量增加到50 g/L以后發(fā)酵液變得非常濃稠，這可能不利于發(fā)酵液中氧的傳遞，進(jìn)而影響到微生物的生長(zhǎng)和代謝，導(dǎo)致產(chǎn)酶量保持穩(wěn)定。因此選擇50 g/L作為玉米芯的最適添加量。

2.3 氮源對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

表3 不同氮源對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Table 3 Effect of nitrogen sources on β-1,3-1,4-glucanase production by A. awamoriCAU33U/mL

氮源為微生物蛋白質(zhì)的合成提供著前體物質(zhì)，不同的氮源會(huì)影響微生物酶的合成與分泌。考察了酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨等有機(jī)氮源，以及硫酸銨、磷酸氫二銨等無(wú)機(jī)氮源對(duì)泡盛曲霉CAU33液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響（表3）。結(jié)果表明有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更有利于β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分泌，其中以大豆蛋白胨作為單一氮源時(shí)β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力最高（2 446 U/mL），其次為牛肉蛋白胨、酵母提取物與胰蛋白胨混合物（1∶1，m/m）、胰蛋白胨和酵母提取物。

確定大豆蛋白胨為最適氮源后，進(jìn)一步考察大豆蛋白胨的添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，大豆蛋白胨的添加量對(duì)泡盛曲霉CAU33產(chǎn)酶的影響比較顯著，當(dāng)其添加量為20 g/L時(shí)酶活力最高（2 478 U/mL），繼續(xù)提高大豆蛋白胨質(zhì)量濃度時(shí)，酶活力反而開(kāi)始逐漸下降（圖略）。因此選擇20 g/L作為大豆蛋白胨的最適添加量。

2.4 表面活性劑對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

表面活性劑通常有助于提高微生物的細(xì)胞壁通透性，從而有利微生物胞外酶的分泌?？疾炝送聹?0、40、60、80，曲拉通X-110、X-114不同表面活性劑（添加量5 g/L）對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響。結(jié)果表明在培養(yǎng)基中添加吐溫和曲拉通類表面活性劑均能夠明顯促進(jìn)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)酶，其中添加曲拉通X-114時(shí)β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力最高，為3 771 U/mL，其后依次為曲拉通X-110（3 629 U/mL）、吐溫-80（3 269 U/mL）、吐溫60（3 105 U/mL）、吐溫40（2 882 U/mL）和吐溫20（2 736 U/mL）（圖略）。

圖3 曲拉通X-114質(zhì)量濃度對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig. 3 Effect of Triton X-114 concentration on β-1,3-1,4-glucanase production by A. awamori CAU33

由圖3可知，泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的量隨著曲拉通X-114質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)添加量為20 g/L時(shí)酶活力最高（5 416 U/mL），之后繼續(xù)增大其質(zhì)量濃度時(shí)，酶活力反而開(kāi)始緩慢下降（圖3）。過(guò)高的表面活性劑濃度可能會(huì)破壞泡盛曲霉CAU33的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡或影響代謝。因此，選擇20 g/L作為曲拉通X-114的最適添加量。

2.5 初始pH值對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

由圖4可知，微酸環(huán)境適宜該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值在4.0～7.0時(shí)產(chǎn)酶量差別不大，當(dāng)初始pH值為4.5時(shí)，β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力最高，為5 637 U/mL。因此選取pH 4.5作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最適初始pH值。

圖4 初始pH值對(duì)泡盛曲霉CAU-33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig. 4 Effect of initial pH on β-1,3-1,4-glucanase production by A. awamori CAU33

2.6 發(fā)酵溫度對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)泡盛曲霉CAU33液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig. 5 Effect of incubation temperature on β-1,3-1,4-glucanase production by A. awamori CAU33

由圖5可知，泡盛曲霉CAU33的最適產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度為35 ℃，此時(shí)酶活力最高達(dá)到6 087 U/mL，當(dāng)發(fā)酵溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)都不利于菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶。

2.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

在確定以上最適條件的基礎(chǔ)上，最后考察了不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)泡盛曲霉CAU33發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響。結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為1～6 d時(shí)，β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力幾乎呈直線持續(xù)增加，在第6天時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，酶活力高達(dá)7 842 U/mL，此時(shí)發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)量濃度也達(dá)到最高值（6 mg/mL），之后隨著發(fā)酵時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)，酶活力開(kāi)始緩慢下降（圖6A）。同時(shí)采用SDS-PAGE法和酶譜法分析了發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間段發(fā)酵液中的蛋白組成變化情況及β-1,3-1,4-葡聚糖酶大致分子質(zhì)量。結(jié)果表明泡盛曲霉CAU33分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖分子質(zhì)量大概為30 kD左右（圖6B中第9道），為發(fā)酵液中的主要組分，且該組分蛋白的含量發(fā)酵初期隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在第6天時(shí)達(dá)到最大（圖6B），與酶活力的變化趨勢(shì)基本保持一致。

圖6 泡盛曲霉CAU33液體發(fā)酵產(chǎn)酶歷程（A）及粗酶液的SDS-PAGE與酶譜分析（B）Fig. 6 Time course profile of β-1,3-1,4-glucanase production (A) and SDS-PAGE and zymogram analysis of the crude enzyme (B)

2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表4 CCD設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果Table 4 CCD design with predicted and experimental values of β-1,3-1,4-glucanase activity

利用Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。經(jīng)回歸擬合后，酶活力的預(yù)測(cè)值Y可以用以下三元二次回歸方程表示：

Y＝7 728.52+509.44A+620.56B+475.44C-113.37AB-125.87AC+68.13BC-336.11A2-308.74B2-767.11C2

表5 各因素的估計(jì)回歸系數(shù)Table 5Analysis of variance of regression model

如表5所示，模型回歸系數(shù)方差分析表明方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，線性回歸系數(shù)值P＜0.05，表現(xiàn)為極顯著性，說(shuō)明該試驗(yàn)方法可行。失擬項(xiàng)系數(shù)值P為0.053 0（＞0.05），表現(xiàn)為不顯著，表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合度較好，試驗(yàn)的誤差等偶然因素對(duì)試驗(yàn)的影響不顯著。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為95.14%，二次方程的擬合度高，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，說(shuō)明此模型預(yù)測(cè)結(jié)果比較準(zhǔn)確。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知模型一次項(xiàng)A、B和C極顯著，二次項(xiàng)A2、B2和C2均極顯著，交互項(xiàng)AB、AC和BC均不顯著。

2.9 各因素交互作用響應(yīng)面分析

圖7 各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface plot showing the effect of interactions among three factors on β-1,3-1,4-glucanase activity

圖7 分別反映了玉米芯質(zhì)量濃度、大豆蛋白胨質(zhì)量濃度、曲拉通X-114質(zhì)量濃度這3 個(gè)因素的兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。利用Design-Expert 8.0軟件分析計(jì)算得到最適實(shí)驗(yàn)參數(shù)為玉米芯55.43 g/L、大豆蛋白胨24.7 g/L、曲拉通X-114 23.07 g/L，相應(yīng)的酶活力為8 231 U/mL。經(jīng)修正選擇玉米芯55 g/L、大豆蛋白胨25 g/L和曲拉通X-114 23 g/L進(jìn)行產(chǎn)酶驗(yàn)證，最后測(cè)定實(shí)際酶活力為8 447 U/mL，與預(yù)測(cè)值相近，為優(yōu)化前的17.6 倍。

通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化液體發(fā)酵條件后β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力達(dá)到8 447 U/mL。這一酶活力水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他已報(bào)道野生型微生物產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶，如米黑根毛霉（6 230 U/mL）[13]、特基拉芽孢桿菌（2 978 U/mL）[9]、解淀粉芽孢桿菌（1 516 U/mL）[7]、地衣芽孢桿菌（562 U/mL）[6]、嗜熱擬青霉（136 U/mL）[12]以及樟絨枝霉（100 U/mL）[15]等，為目前已報(bào)道野生型微生物液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最高水平。此外，該菌株能夠利用農(nóng)業(yè)廢棄物（玉米芯）為碳源高效發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶，降低了發(fā)酵產(chǎn)酶的生產(chǎn)成本。另外，作為野生菌株該菌的發(fā)酵粗酶液中蛋白質(zhì)組分相對(duì)簡(jiǎn)單，主要以β-1,3-1,4-葡聚糖酶為主，這一特征非常有利于后續(xù)酶的精制純化。較高的產(chǎn)酶水平、廉價(jià)的發(fā)酵碳源和簡(jiǎn)單的粗酶液蛋白組成使泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有潛在的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

從土壤樣品中篩選得到一株高產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的絲狀真菌-泡盛曲霉（A. awamori）CAU33。采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到了菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最適條件，即發(fā)酵碳源玉米芯質(zhì)量濃度55 g/L、氮源大豆蛋白胨質(zhì)量濃度25 g/L、曲拉通X-114質(zhì)量濃度23 g/L、初始pH 4.5、培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時(shí)間6 d。在優(yōu)化后的最適條件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力達(dá)到8 447 U/mL，為優(yōu)化之前的17.6 倍，為迄今已報(bào)道野生型微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最高水平。

[1] WOODWARD J R, FINCHER G B, STONE B A. Water-soluble (1→3),(1→4)-β-D-glucans from barley (Hordeum vulgare) endosperm.Ⅱ.fine structure[J]. Carbohydrate Polymers, 1983, 3(3): 207-225. DOI:10.1016/0144-8617(83)90019-X.

[2] PLANAS A. Bacterial 1,3-1,4-β-glucanases: structure, function and protein engineering[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 2000, 1543(2): 361-382. DOI:10.1016/S0167-4838(00)00231-4.

[3] 畢靜. β-葡聚糖酶在啤酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)釀造, 2011, 30(9): 105-106. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2011.09.028.

[4] FERNANDES V O, COSTA M, RIBEIRO T, et al. 1,3-1,4-β-Glucanases and not 1,4-β-glucanases improve the nutritive value of barley-based diets for broilers[J]. Animal Feed Science and Technology, 2016, 211: 153-163. DOI:10.1016/j.anifeedsci.2015.11.007.

[5] 劉德海, 王紅云, 劉金娥. 飼用β-葡聚糖酶的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 飼料工業(yè), 2011(增刊1): 37-39. DOI:10.3969/j.issn.1001-991X.2011. z1.009.

[6] GAO Z. Purification and characterization of a novel lichenase from Bacillus licheniformis GZ-2[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2016, 63(2): 249-256. DOI:10.1002/bab.1206.

[7] 陳玉娟, 沈微, 陳獻(xiàn)忠, 等. 解淀粉芽孢桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表達(dá)[J]. 生物技術(shù), 2011, 21(2): 22-26. DOI:10.3969/j.issn.1004-311X.2011.02.039.

[8] 文鳳云, 廖富蘋, 林健榮, 等. 多黏類芽孢桿菌CP7 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43(22): 4614-4623. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2010.22.008.

[9] 劉曉玲, 王金晶, 李永仙, 等. 特基拉芽孢桿菌來(lái)源β-1,3-1,4-葡聚糖酶重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(2): 80-85. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2013.02.018.

[10] ELGHARBI F, HMIDA-SAYARI A, SAHNOUN M, et al. Purification and biochemical characterization of a novel thermostable lichenase from Aspergillus niger US368[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 98(1): 967-975. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.07.009.

[11] 吳鵬, 王知龍, 吳秀. 黑曲霉HS-5高產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)釀造, 2015, 34(3): 54-57. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2015.03.012.

[12] YANG Shaoqing, YAN Qiaojuan, JIANG Zhengqiang, et al. Biochemical characterization of a novel thermostable β-1,3-1,4-glucanase (lichenase) from Paecilomyces thermophila[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(13): 5345-5351. DOI:10.1021/jf800303b.

[13] TANG Yanbin, YANG Shaoqing, YAN Qiaojuan, et al. Purification and characterization of a novel β-1,3-1,4-glucanase (lichenase) from thermophilic Rhizomucor miehei with high specific activity and its gene sequence[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(9): 2354-2361. DOI:10.1021/jf2049799.

[14] YANG Shaoqing, XIONG Hao, YANG Hongye, et al. High-level production of β-1,3-1,4-glucanase by Rhizomucor miehei under solid-state fermentation and its potential application in the brewing industry[J]. Journal of Applied Microbiology, 2014, 118: 84-91. DOI:10.1111/jam.12694.

[15] YANG Shaoqing, XIONG Hao, YAN Qiaojuan, et al. Purification and characterization of a novel alkaline β-1,3-1,4-glucanase (lichenase) from thermophilic fungus Malbranchea cinnamomea[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2014, 41(10): 1487-1495. DOI:10.1007/s10295-014-1494-4.

[16] 孫玉英, 王瑞明, 劉慶軍, 等. 局限曲霉產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 飼料工業(yè), 2004, 25(1): 28-32. DOI:10.3969/ j.issn.1001-991X.2004.01.009.

[17] SARITHA M, SURENDER S, RAMESHWAR T, et al. Do cultural conditions induce differential protein expression: profiling of extracellular pteome of Aspergillus terreus CM20[J]. Microbiological Research, 2016, 192: 73-83. DOI:10.1016/j.micres.2016.06.006.

[18] 王金玲, 何國(guó)慶, 呂長(zhǎng)山. 響應(yīng)面法優(yōu)化康氏木霉產(chǎn)β-葡聚糖酶的液體發(fā)酵條件[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(9): 204-207.

[19] 丁葉梅, 贠建民, 魏龍, 等. 碎囊毛霉產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(11): 143-148. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201411029.

[20] LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurement with the folin phenol reagent[J]. Journal of Biological Chemistry, 1951, 193(1): 265-275.

[21] WANG L, ZHUANG W. Designing primer sets for amplication of partial calmodulin genes from Penicilia[J]. Mycosystema, 2004, 23(4): 466-473. DOI:10.3969/j.issn.1672-6472.2004.04.004.

[22] WANG J, GUO M Z, XING L L. FASTJOIN, an improved neighborjoining algorithm[J]. Genetics & Molecular Research, 2012, 11(3): 1909-1922. DOI:10.4238/2012.July.19.10.

[23] FELSENSTEIN J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap[J]. Evolution, 1985, 39(4): 783-791. DOI:10.2307/2408678.

[24] 齊祖同, 孔華忠. 中國(guó)真菌志: 曲霉屬及其相關(guān)有性型[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1997: 4-10.

[25] 常敏, 王娟, 田峰, 等. 紅海欖根際土壤來(lái)源的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)F12及其代謝產(chǎn)物的抗菌活性分析[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2010, 50(10): 1385-1391.

[26] NGUYEN V T, QUYEN D T. Optimizing culture conditions for the production of endo-β-1,4-glucanase by Aspergillus awamori strain vietnam type culture collection (VTCC)-F099[J]. African Journal of Biotechnology, 2010, 9(38): 6337-6344. DOI:10.5897/AJB09.1744.

[27] BOTELLA C, DE ORY I, WEBB C, et al. Hydrolytic enzyme production by Aspergillus awamori on grape pomace[J]. Biochemical Engineering Journal, 2005, 26(2/3): 100-106. DOI:10.1016/ j.bej.2005.04.020.

[28] 杜小燕, 吳暉, 趙超敏, 等. 泡盛曲霉發(fā)酵麥麩過(guò)程中酚類物質(zhì)含量的變化與三種酶活性的相關(guān)性[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(4): 69-76. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.4.012.

[29] 鮑文琪, 朱啟忠, 鮑溫潔, 等. 泡盛曲霉產(chǎn)菊粉酶發(fā)酵條件的探究[J]. 中國(guó)釀造, 2013, 32(11): 39-42. DOI:10.3969/ j.issn.0254-5071.2013.11.009.

[30] HAYASHIDA S, NAKAHARA K, KANLAYAKRIT W, et al. Characteristics and function of raw-starch-affinity site on Aspergillus awamori var. kawachi glucoamylase Ⅰ molecule[J]. Agricultural & Biological Chemistry, 2014, 53(1): 143-149. DOI:10.1080/00021369.1 989.10869246.

Optimization of Liquid-State Fermentation Conditions for β-1,3-1,4-Glucanase (Lichenase) Production by Aspergillus awamori

LIU Erwei1, YANG Shaoqing2, YAN Qiaojuan3, JIANG Zhengqiang2,*
(1. College of Food Science and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 3. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The liquid-state fermentation conditions for β-1,3-1,4-glucanase production by Aspergillus awamori CAU33, a fungal strain isolated from soil sample, were optimized using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The highest β-1,3-1,4-glucanase activity of 8 447 U/mL was achieved after 6 days of culture at 35 ℃in a medium consisting of corncob 55 g/L, soybean peptone 25 g/L, and Triton X-114 23 g/L at an initial pH of 4.5, about 17.6 times higher than before the optimization.

β-1,3-1,4-glucanase; liquid-state fermentation; optimization; Aspergillus awamori

10.7506/spkx1002-6630-201716005

TS201.3

A

1002-6630（2017）16-0029-07

劉二偉, 楊紹青, 閆巧娟, 等. 泡盛曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 29-35. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716005. http://www.spkx.net.cn

LIU Erwei, YANG Shaoqing, YAN Qiaojuan, et al. Optimization of liquid-state fermentation conditions for β-1,3-1,4-glucanase (lichenase) production by Aspergillus awamori[J]. Food Science, 2017, 38(16): 29-35. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716005. http://www.spkx.net.cn

2016-11-02

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471688）

劉二偉（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：liuerwei3062@126.com

*通信作者：江正強(qiáng)（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zhqjiang@cau.edu.cn