何風(fēng)雷+陳貴英+彭富全+陳燕勤+郭秋平+莫國強(qiáng)+郭鐘慧

[摘要] 目的 觀察雷公藤的毒性作用及配伍補(bǔ)腎中藥后對其毒性的影響。 方法 根據(jù)動(dòng)物體重，將60只SD大鼠隨機(jī)分為陰性對照組、雷公藤組、配伍組（雷公藤配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿），每組20只。各組大鼠連續(xù)灌胃給藥30 d，每天1次，陰性對照組大鼠給予0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液。試驗(yàn)期間，每天觀察動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便性狀等，每周測定體重。給藥30 d后處死動(dòng)物，進(jìn)行血液學(xué)、激素水平及病理學(xué)等各項(xiàng)檢查。 結(jié)果 與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠體重增長遲緩（P < 0.05），血液學(xué)指標(biāo)白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)（RET）、網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（RET%）降低（P < 0.05），中性粒細(xì)胞數(shù)（NEUT）、中性粒細(xì)胞比率（NEUT%）、淋巴細(xì)胞比率（LYMPH%）降低（P < 0.05）；性激素檢查發(fā)現(xiàn)卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（TTE）降低（P < 0.05）；病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)雄性附睪管空虛，管腔縮小，管腔內(nèi)未見精子或細(xì)胞成分。與雷公藤組比較，配伍組動(dòng)物體重變化無明顯差異，動(dòng)物血液學(xué)指標(biāo)WBC、HGB、RET升高（P < 0.05），激素TTE升高（P < 0.05），附睪病變程度減輕。 結(jié)論 在本試驗(yàn)研究條件下，雷公藤具有明顯的生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)毒性作用，配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿可減輕其生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的毒性作用，具有明顯的配伍減毒作用。

[關(guān)鍵詞] 雷公藤；配伍減毒；生殖損傷；血液毒性

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（c）-0010-04

[Abstract] Objective To observe the toxicity effect of Tripterygium wilfordii and the influence on the toxicity after compatibility with Chinese nourishing kidney herbs. Methods Sixty SD rats were randomly divided into negative control group， Tripterygium wilfordii group and compatibility group （Tripterygium wilfordii combined with Cuscuta chinensis， Fructus Lycii and Epimedium davidii） according to the body weight of animals， with 20 rats in each group. All groups were administrated with corresponding drugs by intragastric administration once a day for 30 days， the rats of negative control group were treated with 0.5% sodium carboxyl methyl cellulose （CMC-Na）. During the test， the physical signs， behaviors， gland secretion， respiratory and stool characters of animals were observed every day， and weight was measured every week. After 30 days， the animals were killed for the examination of hematology， hormone levels and pathology. Results Compared with the negative control group， the body weight of Tripterygium wilfordii group was grown slowly （P < 0.05）， the hematological indexes such as white blood cell count （WBC）， hemoglobin （HGB）， mean corpuscular volume （MCV）， mean corpuscular hemoglobin （MCH）， mean corpuscular haemoglobin concentration （MCHC）， reticulocyte count （RET） and RET% were decreased significantly （P < 0.05）， neutrophile granulocyte （NEUT）， NEUT% and the ratio of lymphocyte （LYMPH%） were decreased significantly （P < 0.05）； hormone examination showed that follicle-stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and testosterone （TTE） were decreased （P < 0.05） in the Tripterygium wilfordii group； histopathologic examination showed that the male ductus epididymis was empty， the lumen was narrow， and no sperm or cell components in the lumen were found in the Tripterygium wilfordii group. Compared with Tripterygium wilfordii group， the body weight of compatibility group showed no significant difference， the hematology indexes such as WBC， HGB and RET were increased （P < 0.05）， TTE level was increased （P < 0.05） and the degree of epididymal lesions was reduced in compatibility group. Conclusion Under the experimental conditions， Tripterygium wilfordii has obvious toxic effects on reproductive system and blood system. Compatibility of Cuscuta chinensis， Fructus Lycii and Epimedium davidii can reduce the toxicity of Tripterygium wilfordii on reproductive system and blood system， which has obvious effects of attenuated toxicity by compatibility.

[Key words] Tripterygium wilfordii； Attenuated toxicity by compatibility； Reproductive damage； Hematotoxicity

國家食品藥品監(jiān)督管理總局自2007年來積極采取了多項(xiàng)措施，鼓勵(lì)或要求對上市后藥品開展再評價(jià)工作，特別是國務(wù)院頒發(fā)了《國家藥品安全十二五規(guī)劃》，著重強(qiáng)調(diào)了藥物再評價(jià)。目前復(fù)方中藥物配伍多以藥效的協(xié)同增效以及減毒作用為依托。市場常見的治療關(guān)節(jié)炎的免疫抑制劑多為雷公藤制劑[1-2]，但是雷公藤在發(fā)揮藥效的同時(shí)，對機(jī)體的消化系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生毒性作用[3-4]，因此降低其毒性，保證其用藥安全具有重要意義。本研究觀察了雷公藤的毒性作用，并進(jìn)行了配伍減毒的研究。

1 材料與方法

1.1 藥物

雷公藤木部水提物由廣州陳李濟(jì)藥廠有限公司提供（批號：10021）；雷公藤配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿的復(fù)方由廣州陳李濟(jì)藥廠有限公司提供（批號：TG1081）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，4～5周齡，SPF級，雌雄各半，體重120～160 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：SCXK（粵）2013-0004；飼養(yǎng)環(huán)境：每天12 h照明/12 h黑暗交替，溫度（24±2）℃，相對濕度50%～60%。

1.3 試劑

凝血質(zhì)控（批號：548192）、凝血酶原時(shí)間（PT）（批號：545388）、凝血酶時(shí)間（TT）（批號：40621）、纖維蛋白原（Fib）（批號：40678）均由美國DADE BEHRING公司提供；血液質(zhì)控（批號：12280802）、白細(xì)胞溶血素（批號：R1025）、白細(xì)胞染液（批號：R1056）、血紅蛋白（HGB）溶血素（批號：1007）、網(wǎng)織紅細(xì)胞（RET）試劑盒（批號：ZA1025）均由日本Sysmex公司提供。促性腺激素釋放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（TTE）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均由武漢伊萊瑞特生物科技有限公司提供。

1.4 儀器

電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），3-18K高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司），Sysmex2000iv型全自動(dòng)血液分析儀（日本Sysmex公司），Sysmex CA-510型凝血儀（日本Sysmex公司），RM2235型切片機(jī)（德國Leica公司），BX 41、BH-2型生物熒光顯微鏡（日本 Olympus公司）。

1.5 方法

選取檢疫合格的SD大鼠60只，按體重隨機(jī)分成三組，分別為陰性對照組、雷公藤組和配伍組（雷公藤配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿）。陰性對照組給予0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，雷公藤劑量為0.512 g/kg（按體表面積換算法換算為等效劑量的4倍），菟絲子、枸杞子、淫羊藿配伍劑量為0.648 g/kg（按體表面積換算法換算為等效劑量的4倍）。各組動(dòng)物的給藥體積均為10 mL/kg。每天1次，共給藥30 d。給藥30 d后處死動(dòng)物，進(jìn)行血液學(xué)、激素水平及病理學(xué)等各項(xiàng)檢查。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般狀況及體重測定 試驗(yàn)期間，每天觀察動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便性狀等。每周稱1次體重，觀察雷公藤提取物及配伍藥物對大鼠體重變化的影響。

1.6.2 血液學(xué)檢測 末次給藥后，各組大鼠禁食16～20 h，用20%烏來糖0.75 mL/100 g麻醉，腹主動(dòng)脈取血。凝血功能指標(biāo)PT、部分凝血激酶時(shí)間（APTT）、TT、Fib用0.109 mol/L的枸櫞酸鈉（和血液的體積比為1∶9）抗凝，3600 r/min（離心半徑13.5 cm），20℃離心15 min，用凝血儀測定；白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板體系相關(guān)指標(biāo)以EDTA抗凝，2000 g離心15 min，取血漿，用全自動(dòng)血液分析儀測定。

1.6.3 性激素水平檢測 采用ELISA試劑盒，按試劑盒說明書操作，分別測定雄性大鼠血清中GnRH、FSH、LH和TTE的含量。

1.6.4 附睪組織病理學(xué)檢查 將附睪組織用10%中性福爾馬林固定，酒精脫水，石蠟包埋，2～3 μm切片，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色封片，光學(xué)顯微鏡下檢查。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所得結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。進(jìn)行方差分析，如F值有顯著性差異，用Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤提取物及配伍藥物連續(xù)灌胃給藥30 d對大鼠一般狀況及體重的影響

灌胃給藥30 d后，陰性對照組及各給藥組動(dòng)物未見外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、糞便性狀、呼吸等異常變化。與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠體重增長遲緩（P < 0.05），配伍組動(dòng)物體重明顯增加，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 雷公藤提取物及配伍藥物連續(xù)灌胃給藥30 d對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

灌胃給藥30 d后，與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、HGB、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、RET、網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（RET%）降低（P < 0.05），中性粒細(xì)胞數(shù)（NEUT）、中性粒細(xì)胞比率（NEUT%）、淋巴細(xì)胞比率（LYMPH%）降低；與雷公藤組比較，配伍組大鼠WBC、HGB、RET升高（P < 0.05），其余指標(biāo)未見明顯差異（P > 0.05）。見表2。

2.3 雷公藤提取物及配伍藥物連續(xù)灌胃給藥30 d對雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響

灌胃給藥30 d后，與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠出現(xiàn)附睪管空虛、管腔縮小、管腔內(nèi)未見精子或細(xì)胞成分；與雷公藤組比較，配伍組大鼠附睪病變程度減輕。見圖1～2。

2.4 雷公藤提取物及配伍藥物連續(xù)灌胃給藥30 d對雄性大鼠性激素水平的影響

灌胃給藥30 d后，與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠血清中FSH、LH和TTE明顯降低（P < 0.05）。與雷公藤組比較，配伍組大鼠激素TTE明顯升高（P < 0.05）。見表3。

3 討論

雷公藤及其配伍菟絲子、枸杞和淫羊藿的復(fù)方是廣州陳李濟(jì)藥廠有限公司提供的受試藥物，參考我國《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》和委托方提供的與受試物相關(guān)的信息和相關(guān)文獻(xiàn)資料，在GLP條件下，本研究進(jìn)行了雷公藤及其配伍補(bǔ)腎中藥的毒性作用研究，旨在觀察連續(xù)30 d給予藥物對大鼠產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度，以及配伍能否降低其毒性，為臨床設(shè)計(jì)人用安全劑量和主要監(jiān)測指標(biāo)提供參考，也為藥物二次開發(fā)及多次給藥進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)。雷公藤及其制劑的毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)為對消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的損害[5-7]，本研究主要從血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)毒性入手，考察配伍補(bǔ)腎中藥能否減輕其毒性。

雷公藤對血液系統(tǒng)的毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)為白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板減少，以粒細(xì)胞減少最為常見[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)4周給予雷公藤提取物后，大鼠的WBC、HGB都有降低[11]。本研究中，血液學(xué)指標(biāo)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，配伍補(bǔ)腎藥物組大鼠的HGB、RET和WBC增多，表明配伍補(bǔ)腎藥物可從一定程度上減輕雷公藤對血液系統(tǒng)的毒性。

據(jù)報(bào)道，雷公藤對生殖系統(tǒng)的毒性反應(yīng)最為嚴(yán)重[12-14]。雷公藤對雄性動(dòng)物的毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)為附睪尾內(nèi)未成熟精子率及畸形精子率升高，睪丸和附睪發(fā)生明顯的病理變化；雌性動(dòng)物則表現(xiàn)為動(dòng)情周期紊亂，卵巢和子宮發(fā)生明顯的病理變化[15]。本研究中，病理研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤組雌性大鼠卵母細(xì)胞發(fā)育異常，卵巢閉鎖卵泡數(shù)量增加，各級卵母細(xì)胞均見減少，黃體數(shù)量亦減少，雄性大鼠附睪管空虛，管腔縮小，管腔內(nèi)未見精子或細(xì)胞成分；而配伍補(bǔ)腎中藥組雄性大鼠可見附睪病變程度減輕。激素水平的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，雷公藤組雄性大鼠FSH、LH、TTE降低；配伍補(bǔ)腎藥物后，雄性動(dòng)物的TTE水平升高。這些結(jié)果提示配伍補(bǔ)腎藥物可減輕雷公藤對生殖系統(tǒng)的毒性。

中藥配伍是降低有毒中藥毒性的主要途徑之一[16-18]。有研究用補(bǔ)腎中藥六味地黃丸干預(yù)雷公藤多苷導(dǎo)致的雄性幼鼠生殖損傷，結(jié)果表明，補(bǔ)腎中藥組睪丸病理改變較雷公藤多苷組為輕，提示補(bǔ)腎中藥可以降低雷公藤對生殖系統(tǒng)的毒性反應(yīng)[19]。補(bǔ)腎中藥也能減輕雷公藤多苷對雌性幼鼠生殖能力的損傷[20]。本研究將雷公藤與菟絲子、枸杞和淫羊藿配伍，觀察其對大鼠生殖毒性相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，雷公藤配伍上述中藥后，動(dòng)物體重、附睪的病理改變均得到不同程度的緩解，其機(jī)制可能與降低FSH、LH和T的分泌有關(guān)。

總之，在本研究條件下，雷公藤具有明顯的生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的毒性作用。配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿可減輕其對生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的毒性作用，具有明顯的配伍減毒作用。

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