萬(wàn)海方+黃焱明+汪國(guó)香+羅宏+張相彩+陶凡+趙萃+王振

[摘要] 目的 建立以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)的高效液相色譜法測(cè)定丙泊酚血藥濃度方法。 方法 血清樣品用乙腈-甲醇（75：25）混合液蛋白沉淀后取上清液進(jìn)樣分析，以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)，采用UltimateRXB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以水（H3PO4調(diào)pH=1.8）-乙腈（70∶30）為流動(dòng)相，流速1.5 mL/min，檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)270 nm。結(jié)果 該法專屬性高，回收率高，日內(nèi)日間RSD低。丙泊酚血藥濃度在0.2～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.9998），最低檢測(cè)濃度0.2970 mg/L。 結(jié)論 本方法測(cè)定丙泊酚濃度方便、快捷、準(zhǔn)確度好、精密度高，為開(kāi)展血藥濃度檢測(cè)、藥動(dòng)學(xué)研究提供方法學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 丙泊酚；高效液相色譜法；血藥濃度；2，4-二叔丁基苯酚

[中圖分類號(hào)] R614 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）20-0105-04

[Abstract] Objective To establish a detecting method of propofol plasma concentration by HPLC with 2， 4-ditert-butyl phenol as internal standard. Methods The supernatant of serum samples were analyzed after protein precipitation by acetonitrile-methyl alcohol（75∶25） mixed liquor. With 2， 4-ditert-butyl phenol as internal standard， UltimateR XB-C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used. Water（H3PO4， pH=1.8）-acetonitrile（70∶30） was used as mobile phase， flow velocity=1.5 mL/min， and detecting excitation wave length=270 nm. Results This method had high specificity and recovery， with low intra-day and inter-day RSD. When the plasma concentration of propofol was between 0.2～10.0 mg/L， it showed a good linear relation（r2=0.9998）， and the lower limit of detection was 0.2970 mg/L. Conclusion This method is convenient and speedy， with high accuracy and precision， providing a methodological basis for plasma concentration detection and pharmacokinetic research.

[Key words] Propofol； HPLC； Plasma concentration； 2， 4-ditert-butyl phenol

丙泊酚（propofol），2，6-二異丙基苯酚，又名異丙酚，是速效短效靜脈麻醉藥。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)丙泊酚藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究較多[1-4]，但未見(jiàn)丙泊酚應(yīng)用于結(jié)核性膿胸患者的藥動(dòng)學(xué)研究。為開(kāi)展該研究，為臨床麻醉合理使用丙泊酚提供依據(jù)，本文建立了以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)的高效液相色譜法測(cè)定丙泊酚血藥濃度?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)，Agilent），配有G1311A四元泵、G1315D紫外檢測(cè)器、G1329A型進(jìn)樣器（配有20 μL 進(jìn)樣環(huán)）、G1316A柱溫箱和Agilent化學(xué)工作站；XS205 Dual Range分析天平（瑞士，Mettler Toledo）；Mettler Toledo Delta 320 pH計(jì)（瑞士，Mettler Toledo）；高速離心機(jī)（美國(guó)，Thermo Fisher）；Barnstead TII超純水系統(tǒng)（美國(guó)，Thermo Fisher）；-80℃冰箱（日本，SANYO）。

1.2 藥品與試劑

丙泊酚注射液（規(guī)格：200 mg/支，批號(hào)：AJ059）、丙泊酚對(duì)照品（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)，規(guī)格：25 g，批號(hào)：ZR28L-FK，純度>98.0%）；內(nèi)標(biāo)：2，4-二叔丁基苯酚（北京百靈威科技有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：100 g，批號(hào)：LI200111，純度≥99.5%）；色譜級(jí)乙腈和甲醇從美國(guó)天地公司購(gòu)得，本文中其他所有分析級(jí)化學(xué)品均由天津永大化學(xué)試劑有限公司購(gòu)得；實(shí)驗(yàn)用超純水均由美國(guó)賽默飛世爾Barnstead TII 超純水系統(tǒng)純化制得。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：UltimateRXB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭材料科技有限公司），流動(dòng)相：水（H3PO4調(diào)pH=1.8）-乙腈（70∶30）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃；流速：1.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 稀釋液 乙腈-甲醇（75：25）。

2.2.2 丙泊酚對(duì)照品溶液 精密稱取40.00 mg丙泊酚對(duì)照品至10 mL容量瓶中，用稀釋液溶解，定容至刻度；精密移取上述溶液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，搖勻，待用。

2.2.3 2，4-二叔丁基苯酚儲(chǔ)備液 精密稱取10.00 mg 2，4-二叔丁基苯酚對(duì)照品至10 mL容量瓶中，用稀釋液溶解，定容至刻度。

2.2.4 2，4-二叔丁基苯酚對(duì)照品溶液 精密移取2，4-二叔丁基苯酚儲(chǔ)備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，搖勻，待用。

2.3 血樣處理

取出存放在-80 ℃冰箱中血樣，室溫解凍后取血樣400 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)2，4-二叔丁基苯酚儲(chǔ)備液，590 μL 稀釋液，渦旋5 min，2000 g離心15 min，取上層清液進(jìn)樣。

2.4 方法專屬性實(shí)驗(yàn)

取空白血樣400 μL，加入600 μL 稀釋液，渦旋5 min，2000 g離心15 min，取上層清液進(jìn)樣，得空白血清色譜圖1A，將一定濃度的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)加入空白血清，按2.3項(xiàng)操作得色譜圖1B，受試者注射丙泊酚后，同法操作，得色譜圖1C，可見(jiàn)丙泊酚與內(nèi)標(biāo)2，4-二叔丁基苯酚的保留時(shí)間分別為6.65 min和10.67 min，兩者峰形良好，分離完全，理論塔板數(shù)按丙泊酚計(jì)算不低于14 837。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取丙泊酚對(duì)照品，配制成濃度分別為0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L。以丙泊酚的濃度（X）為橫坐標(biāo)，丙泊酚的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=3.2733X-0.1223（r2=0.9998）。定量下限為0.2 mg/L。見(jiàn)圖2。

3.2 回收率試驗(yàn)

取空白血清加入丙泊酚對(duì)照品，制備成濃度分別為0.5、1.0、10.0 mg/L 的質(zhì)量控制血清樣品，各5份，按照2.3項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 精密度試驗(yàn)

取空白血清，加入丙泊酚對(duì)照品，制備成濃度分別為0.5、1.0、10.0 mg/L 的質(zhì)量控制血清樣品，各5份，按照2.3項(xiàng)下方法操作，1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，以測(cè)定日內(nèi)RSD。另取上述不同濃度的血清樣品，同樣處理，每日測(cè)定1次，重復(fù)測(cè)定5 d，以測(cè)定日間RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.4 臨床樣品準(zhǔn)備

胸外科結(jié)核性膿胸住院手術(shù)患者10例，年齡27～63歲，體重47～63.5 kg，1%丙泊酚按2 mg/kg的劑量單次靜脈給予，20 s注射完畢，分別于給藥結(jié)束后2、4、6、8、10、15、20、30、60、90 min通過(guò)橈動(dòng)脈測(cè)壓管采動(dòng)脈血1.5 mL，分離血清，存放在-80℃冰箱中，測(cè)定丙泊酚血藥濃度。結(jié)果見(jiàn)圖3。

4討論

結(jié)核病嚴(yán)重影響人民健康，是我國(guó)重點(diǎn)防治疾病之一[5]。對(duì)結(jié)核性膿胸及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷和有效的治療，不僅有利于患者健康，而且對(duì)消除傳染源、控制結(jié)核病流行起重要的作用。近年來(lái)結(jié)核性膿胸的發(fā)病有所增加，并且出現(xiàn)了耐藥菌，通過(guò)外科手術(shù)治療方法對(duì)患者的病灶給予清除，以達(dá)到縮短療程、治愈的目的[6-9]。丙泊酚是臨床上常用的麻醉藥[10，11]，其起效快，作用時(shí)間短，且麻醉后舒適感較好，是胸外科結(jié)核性膿胸患者靜脈麻醉首選藥物，還廣泛用于無(wú)痛腸鏡、無(wú)痛胃鏡檢查以及無(wú)痛人工流產(chǎn)術(shù)和重癥監(jiān)護(hù)室鎮(zhèn)靜等。近年來(lái)，丙泊酚濃度測(cè)定及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究較多，測(cè)定丙泊酚血藥濃度對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。丙泊酚血藥濃度的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[12]、氣-質(zhì)聯(lián)用（GC/MS）[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[14]。后兩種方法的靈敏度較高、特異性強(qiáng)、所需樣品量少，但儀器設(shè)備較昂貴，難以普及推廣。在高效液相色譜法中，電化學(xué)和二極管陣列檢測(cè)法國(guó)內(nèi)應(yīng)用較少。目前文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜法主要有高效液相-紫外檢測(cè)法（HPLC UV）、高效液相-熒光檢測(cè)法（HPLC Flu）。為適應(yīng)臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)色譜條件、內(nèi)標(biāo)確立和流動(dòng)相的選擇、方法專屬性實(shí)驗(yàn)等研究建立測(cè)定人血漿中丙泊酚濃度的方法，以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測(cè)定丙泊酚濃度。

本實(shí)驗(yàn)以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測(cè)定丙泊酚血漿藥物濃度，該方法簡(jiǎn)單、易行、可重復(fù)。雖然質(zhì)譜法檢測(cè)丙泊酚血藥濃度在很多研究中使用，但由于質(zhì)譜設(shè)備昂貴，很多實(shí)驗(yàn)室還沒(méi)有該設(shè)備[15，16]。研究報(bào)告顯示高效液相色譜法甚至可以與質(zhì)譜法達(dá)到相近的定量下限[17]。

本實(shí)驗(yàn)樣品預(yù)處理方法選擇乙腈-甲醇（75∶25）混合液蛋白沉淀法，較萃取法簡(jiǎn)單，并且不需要大量的有機(jī)溶劑如環(huán)己烷、氯仿-乙酸乙酯混合液[18，19]，也不需要花費(fèi)昂貴的試劑盒[14]。流動(dòng)相選用水（H3PO4 調(diào)pH=1.8）-乙腈（70∶30）時(shí)，丙泊酚和2，4-二叔丁基苯酚內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間合理，色譜峰形理想，而當(dāng)采用三氟乙酸調(diào)節(jié)水pH值時(shí)，雖然出峰時(shí)間合理，但色譜圖中基線不穩(wěn)定。血中代謝物質(zhì)和其他內(nèi)源性物質(zhì)的峰均不干擾丙泊酚的測(cè)定，說(shuō)明該方法具有較高的專屬性。

本方法測(cè)定丙泊酚濃度方便快捷，一天可以檢測(cè)完10例患者的100個(gè)血樣，臨床樣品測(cè)定結(jié)果表明，丙泊酚2 mg/kg 靜脈注射后2、4、6、8、10、15 min的平均血藥濃度與吳健等[20]報(bào)道的接近。該法檢測(cè)到最低濃度為0.2970 mg/L，靈敏度高，可滿足臨床藥動(dòng)學(xué)研究需要，為開(kāi)展血藥濃度檢測(cè)、藥代學(xué)研究提供方法學(xué)依據(jù)。

總之，以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測(cè)定丙泊酚在結(jié)核性膿胸患者血漿藥物濃度可行、方便，準(zhǔn)確，能夠?yàn)榕R床合理使用該藥物提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 吳健，何慧梁，祝勝美，等.原位肝移植患者術(shù)中不同時(shí)期異丙酚血藥濃度的變化[J].中華麻醉學(xué)雜志，2004， 24：264-267.

[2] Adeishvili-Andguladze LV，Makharadze RV，Kurtsikidze MSh，et al. Investigation of conjugation and metabolism of propofol with the method of high performance liquid chromatography[J]. Georgian Med News，2009（169）：98-100.

[3] Song JC，Sun YM，Zhang MZ，et al. Propofol pharmacokinetics in patients with obstructive jaundice[J]. Curr Drug Deliv，2009，6（3）：317-320.

[4] Smuszkiewicz P，Wiczling P，Przybyowski K，et al. The pharmacokinetics of propofol in ICU patients undergoing long-term sedation[J]. Biopharm Drug Dispos，2016，37（8）：456-466.

[5] World health Organization. Global Tuberculosis Report 2014[M]. Geneva：World Health Organization，2014：237-246.

[6] Park SK，Lee CM，Heu JP，et al.A retrospective study for the outcome of pulmonary resection in 49 patients with multidrug-resistant tuberculosis[J].Int J Tuberc Lung Dis，2002，6（2）：143-149.

[7] Shiraishi Y，Nakajima Y，Katsuragi N，et al.Resectional surgery combined with chemotherapv remains the treantment of choice for multidrug-resistant tuberculosis[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，2004，（128）：523-528.

[8] 張培元.肺結(jié)核診斷和治療指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（2）：70-74.

[9] 于大平，傅瑜. 耐多藥肺結(jié)核133例外科治療效果探討[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32（6）：450-453.

[10] 陳蘭鳳，張瑞東，朱邵軍，等.瑞芬太尼復(fù)合丙泊酚或七氟烷對(duì)小兒扁桃體切除術(shù)術(shù)后躁動(dòng)的影響[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（6）：84-87.

[11] 韓利平，邵紅玲，宋美麗. 不同初始劑量丙泊酚在無(wú)痛胃鏡麻醉中的效果探討[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（31）：103-110.

[12] Kivlehan F，Chaum E，Lindner E. Propofol detection and quantification in human blood：The promise of feedback controlled， closed-loop anesthesia[J].Analyst，2015，140（1）：98-106.

[13] Colucci AP，Gagliano-Candela R，Aventaggiato L.Suicide by self-administration of a drug mixture（propofol，midazolam，and zolpidem）in an anesthesiologist：the first case report in Italy[J]. J Forensic Sci，2013，58（3）：837-841.

[14] Cohen S，Lhuillier F，Mouloua Y，et al. Quantitative measurement of propofol and in main glucuroconjugate metabolites in human plasma using solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007， 854（1-2）：165-172.

[15] Bajpai L，Varshney M， Seubert CN，et al. A new method for the quantitation of propofol in human plasma：Efficient solid phase extraction and liquid chromatography/APCI-triple quadruple mass spectrometry detection[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2004， 810（2）：291-296.

[16] Miekisch W，F(xiàn)uchs P，Kamysek S，et al. Assessment of propofol concentrations in human breath and blood by means of HS-SPME-GC-MS[J]. Clin Chim Acta，2008， 39：32-37.

[17] Yarbrough J，Harvey R，Cox S. Determination of propofol using high performance liquid chromatograhpy in whole blood with fluorescence detection[J]. J Chromatogr Sci，2012，50（3）：162-166.

[18] Dawidowicz AL，Kalityński R. HPLC investigation of free and bound propofol in human plasma and cerebrospinal fluid[J]. Biomed Chromatogr，2003，17（7）：447-452.

[19] Klausz G，Róna K，Kristóf I，et al. Evaluation of a fatal propofol intoxication due to self administration[J].J Forensic Leg Med，2009，16：287-289.

[20] 吳健，王珊娟，杭燕南. 老年和青壯年病人異丙酚全麻誘導(dǎo)的藥代動(dòng)力學(xué)比較[J]. 中華麻醉學(xué)雜志，2002， 22：645-649.

（收稿日期：2017-05-03）