鄧昌哲姚 慧安飛飛李開綿陳松筆,*

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 / 農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南儋州 571737;2海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南?？?5702281

木薯塊根有色體分離及其蛋白質(zhì)組學(xué)的研究

鄧昌哲1,2姚 慧1安飛飛1李開綿1陳松筆1,*

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 / 農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南儋州 571737;2海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南?？?5702281

木薯(Manihot esculenta Crantz)塊根有色體是類胡蘿卜素貯藏和調(diào)控多種生理生化過程的場所。本研究發(fā)現(xiàn)Percoll密度梯度離心法最適合于木薯塊根有色體的提取, 利用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)40%～50% Percoll梯度層富含完整有色體, Western blot分析顯示該層的線粒體標(biāo)志酶Vdac1雜交信號較低, 而質(zhì)體標(biāo)志酶RbcL雜交信號最高, 并以此確定木薯塊根有色體的分離方法。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法顯示SC9塊根有色體存在34個(gè)差異蛋白質(zhì), 其中上調(diào)表達(dá)17個(gè), 下調(diào)表達(dá)17個(gè); 涉及碳代謝及能量代謝相關(guān)蛋白所占比例最高。STRING蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)顯示, Enolase 2與Elongation Factor互作關(guān)系最多, 是整個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)的核心蛋白質(zhì)。qRT-PCR定量分析顯示Enolase 2在高類胡蘿卜素的蛋黃木薯SC9的表達(dá)水平顯著高于低類胡蘿卜素品種SC6068。推測其可能是影響SC9與SC6068類胡蘿卜素差異的主要蛋白質(zhì)之一。

木薯塊根; 有色體蛋白質(zhì); 分離; 蛋白質(zhì)組

木薯(Manihot esculenta Crantz)為大戟科木薯屬植物, 是世界熱帶地區(qū)近 8億人的主糧, 木薯不僅具有高光效和高淀粉積累特性, 而且耐貧瘠和干旱,對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)[1-3]。然而普通木薯栽培品種類胡蘿卜素含量較低, 長期食用會引起視力下降, 夜盲癥和干眼病等癥狀, 因此選育富含高類胡蘿卜素的木薯新品種越來越受到重視。

木薯塊根有色體是類胡蘿卜素的載體[4], 而類胡蘿卜素是光合作用的輔助色素, 為光合元件提供必要的保護(hù), 同時(shí)也是植物激素脫落酸(ABA)和獨(dú)角金內(nèi)酯(strigolactone)合成的前體[5]。開展木薯塊根有色體蛋白質(zhì)組研究, 有助于發(fā)掘有色體中與類胡蘿卜素合成, 有色體轉(zhuǎn)化等相關(guān)功能蛋白質(zhì)。而雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)手段, 該技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry, MS)、生物信息學(xué)技術(shù)連用, 能夠?qū)崿F(xiàn)對生物體某一個(gè)時(shí)期內(nèi)細(xì)胞全蛋白質(zhì)的高通量分離和功能蛋白質(zhì)高效、準(zhǔn)確鑒定[6-7]。隨著亞細(xì)胞分離技術(shù)的發(fā)展[8-11], 亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)已逐步成為植物研究的熱點(diǎn)。葉綠體[8-11]、線粒體[12]、液泡[13]等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組的研究已經(jīng)陸續(xù)開展。已有研究表明, 從植物組織中分離獲得完整的有色體, 常用的方法是加入適當(dāng)提取緩沖液后用攪拌機(jī)使植物組織破碎, 差速離心獲得有色體粗提物, 使用密度梯度離心法可以從有色體粗提物中獲得較多完整的有色體。番茄、辣椒、柑橘、花椰菜[14-17]等植物有色體分離方法研究表明, 使用不同方法從植物中獲得的有色體及其蛋白質(zhì)有較大差異。

木薯蛋白質(zhì)組學(xué)研究多集中在塊根和葉片等植物器官全蛋白組水平上, 如安飛飛等[18]采用苯酚抽提法提取木薯葉片蛋白質(zhì), 并通過 2-DE技術(shù)研究不同葉片蛋白質(zhì)組差異, 宋雁超等[19]利用2-DE技術(shù)研究木薯高淀粉與低淀粉種質(zhì)塊根的差異蛋白質(zhì)。對于木薯亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中有色體提取方法研究較少。本試驗(yàn)研究木薯塊根有色體提取分離方法, 同時(shí), 運(yùn)用2-DE結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分離2個(gè)木薯品種塊根有色體全蛋白質(zhì), 篩選和鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn),為木薯塊根有色體類胡蘿卜素的合成研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料SC6068 (圖1-A)和SC9 (圖1-B)取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃, 本課題組經(jīng)早期研究得出 SC9和SC6068栽培種塊根成熟期的β-胡蘿卜素含量分別為2.70 μg與0.65 μg[20], 差異達(dá)顯著水平。本研究選取生長達(dá)9個(gè)月且未被病蟲侵染的完整塊根, 用雙蒸水洗凈后提取有色體。

圖1 木薯栽培種SC6068(A)與SC9(B)塊根橫切面Fig. 1 Transverse section of the storage roots in cassava cultivars SC6068(A) and SC9(B)

1.2 木薯塊根有色體提取

1.2.1 Percoll密度梯度離心法 參考辣椒有色體提取方法[15]并加以改進(jìn)。取塊根500 g切碎, 加入預(yù)冷提取緩沖液500 mL [1 mmol L–1NaP2O7, 50 mmol L–1HEPES (pH 7.5), 330 mmol L–1山梨(糖)醇, 2 mmol L–1EDTA, 1 mmol L–1MgCl22 mmol L–1MnCl2, 2 mmol L–1DTT], 后用攪拌機(jī)破碎, 用Calbiochem生物公司的 4層神奇濾布過濾勻漿, 離心5 min (500×g, 4℃), 取上清液, 將上清液再次離心10 min (5000×g, 4℃), 取沉淀部分加入1 mL提取緩沖液懸浮。小心吸取平鋪于Percoll梯度液上層懸浮的有色體 (20%～30%、30%～40%、40%～50%、50%～60%各1.5 mL), 離心45 min (8000×g, 4℃), 小心吸取各個(gè)梯度的黃色分層, 用 5倍體積的提取緩沖液重復(fù)清洗3次后, 得到有色體沉淀。

1.2.2 蔗糖密度梯度離心法 參考番茄有色體提取方法[17]并加以改進(jìn)。取塊根500 g切碎, 加入預(yù)冷的提取緩沖液500 mL [50 mmol L–1HEPES (pH 7.5), 2 mmol L–1EDTA, 330 mmol L–1山梨(糖)醇, 5 mmol L–12-mercaptoethanol], 后用攪拌機(jī)破碎, 4層神奇濾布過濾勻漿, 離心5 min (500×g, 4℃), 去除粗淀粉, 取上清液再次離心10 min (5000×g, 4℃), 取沉淀部分, 得有色體粗提物。將有色體粗提物小心加入5 mL的50%蔗糖梯度液懸浮后, 小心平鋪于蔗糖梯度液(50%、30%、17%)上, 離心45 min (62 000×g, 4℃), 小心吸取各個(gè)梯度分層, 用 10倍體積的緩沖液重復(fù)清洗3次, 得到有色體沉淀。

1.2.3 Nycodenz密度梯度離心法 參考柑橘有色體提取方法[16]并加以改進(jìn)。取塊根500 g切碎, 加入預(yù)冷緩沖提取液500 mL [1 mmol L–1NaP2O7, 50 mmol L–1HEPES (pH 7.5), 330 mmol L–1sorbitol, 2 mmol L–1EDTA, 1 mmol L–1MgCl22 mmol L–1MnCl2, 2 mmol L–1DTT, pH 6.8], 用攪拌機(jī)破碎3次,每次10 s; 4層神奇濾布過濾勻漿。離心5 min (500×g,4℃), 取上清液再次離心10 min (6000×g, 4℃), 取沉淀部分, 得到有色體粗提物。而后加入2 mL提取緩沖液清洗。小心平鋪于Nycodenz粉劑配置而成的梯度液 (30%、24%、20%、15%)上, 離心 45 min (8000×g, 4℃), 小心吸取 0/15%與 15%/20%間的淡黃色梯度層, 加入10倍體積提取緩沖液重復(fù)清洗3次(5000×g, 10 min), 得到有色體沉淀。

1.2.4 木薯有色體提取純度分析 利用光學(xué)顯微鏡檢測有色體的完整性, 同時(shí)使用Western blot檢測有色體的純度, 所用抗體分別為線粒體外膜標(biāo)記抗體(電壓依賴型陰離子通道抗體, Vdac1, 29 kDa, 1∶5000稀釋)和質(zhì)體標(biāo)記抗體(二磷酸核糖酮羧化酶大亞基、RbcL、53 kDa, 1∶5000稀釋)。

1.2.5 木薯有色體全蛋白質(zhì)提取 參考木薯塊根全蛋白質(zhì)提取方法[21]加以改進(jìn)。取已純化的SC9和SC068有色體1 g, 加入1 mL提取緩沖液(0.1 mol L–1Tris pH 8.0, 50 mmol L–1DTT, 2% SDS, 5%蔗糖, 2%蛋白抑制劑), 室溫渦混5 min, 加入等體積Tris-平衡酚, 渦混5 min。離心15 min (8300×g , 4℃), 將酚相轉(zhuǎn)移至新離心管, 并加入提取緩沖液(不含蛋白抑制劑)渦混5 min。離心15 min (8300×g , 4℃), 加入5倍體積的飽和乙酸銨甲醇溶液, –20℃保存6 h以上。離心15 min (8300×g, 4℃), 重復(fù)3次。加入5倍體積丙酮清洗沉淀, 離心 15 min (8300×g, 4℃),以80%丙酮再次清洗, 離心, 氮?dú)獯蹈? –20℃保存。

1.3 木薯有色體全蛋白質(zhì)樣品濃度測定

取已吹干的木薯有色體蛋白質(zhì)樣品, 加入蛋白質(zhì)樣品溶解液(9.5 mol L–1尿素; 2.0 mol L–1硫脲; 4% CHAPS; 1% DTT; 2.5 mmol L–1EDTA; 2.5 mmol L–1EGTA), 室溫溶解1 h, 室溫離心5 min (9500×g), 取上清液, 而后使用 BSA試劑盒(Thermo, USA)對蛋白質(zhì)溶液定量分析。

1.4 木薯有色體全蛋白質(zhì)雙向電泳分離

根據(jù)木薯有色體全蛋白質(zhì)定量結(jié)果, 使用pH4-7、13 cm的預(yù)制IPG膠條(Immobiline DryStrip, GE Healthcare, 下同)。配制樣品水化體系: 蛋白質(zhì)樣品 (300 μg)、水化液(7 mol L–1尿素、2 mol L–1硫脲、3% CHAPS、0.5% Trixon-100)、IPG 緩沖液和溴酚藍(lán)。在IPG泡漲盤(IPGbox, GE Healthcare)中水化 10 h以上, 結(jié)束后使用等電點(diǎn)聚焦儀器(Ettan IPGphor3 GE Healthcare), 參考An等[21]的程序進(jìn)行等電點(diǎn)聚焦。完成后將膠條置1% DTT和2.5% IAA分別平衡 15 min, 再轉(zhuǎn)移至分離膠濃度為 12%的 SDS-PAGE膠上端, 使用 EPS 601電泳儀(GE Healthcare)進(jìn)行第二向垂直電泳(100V 10 min; 160 V 300 min以上)。完成電泳后進(jìn)行固定染色, 用Image Scanner掃描儀掃描。

1.5 蛋白質(zhì)酶解及 MALDI-TOF-TOF–MS/MS鑒定

采用胰蛋白液酶解差異蛋白質(zhì)點(diǎn), 采用MALDI-TOF-TOF-MS/MS 進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定。參照An等[18]的方法。比對數(shù)據(jù)庫時(shí), 參照設(shè)置如下: 數(shù)據(jù)庫為NCBInr全庫, 胰酶消化, 最大允許漏切位點(diǎn)為1, 二級質(zhì)譜肽段質(zhì)量精確度為0.5 Da。多肽帶點(diǎn)情況為+1。

1.6 qRT-PCR驗(yàn)證關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)變化

取 SC6068與 SC9塊根各 100 mg, 參照TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit多糖多酚試劑盒說明書提取木薯塊根總 RNA。參照 TaKaRa公司PrimeScript RT regant Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)進(jìn)行基因組去除及RNA反轉(zhuǎn)錄。

經(jīng)差異蛋白質(zhì)組學(xué)及蛋白質(zhì)功能分析, 選取代謝途徑網(wǎng)絡(luò)核心的 2個(gè)蛋白質(zhì), 即點(diǎn) 4 (烯醇化酶Enolase 2)和點(diǎn)18 (延長因子elongation factor), 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證表達(dá)量的變化。Enolase 2蛋白質(zhì)的特異引物為Enolase 2-F (5′-GTCAGATCC TCCATCCCTTAG-3′)和Enolase 2-R (5′-GTTACCAT CGTCTCCGTCAG-3′), Elongation Factor蛋白的特異引物為Elongation Factor-F (5′-GCTTTGTGCAGT TCTGTTATGA-3′)和Elongation Factor-R (5′-CAACA CGATACCTTTGAGCCT-3′)。以木薯看家基因Actin為內(nèi)參基因, 引物序列為Actin-F (5′-TGATGAGTCT GGTCCATCCA-3′)和Actin-R (5′-CCTCCTACGACC CAATCTCA-3′), 依照TaKaRa公司的SYBR Prime Ex Taq試劑的要求混合反應(yīng)液, 其中含SYBR Prime Ex Taq II 5 μL, 上下游引物各0.5 μL, cDNA模板1 μL, dH2O 3μL。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為94℃ 1.5 min, 94℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán); 繪制熔解曲線。以SC6068的表達(dá)量為1, 采用2–ΔΔCt分析SC9的基因表達(dá)量。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù), 使用Image J軟件分析Western blot條帶, 用Microsoft Excel 2016軟件繪圖。采用Delta2D軟件對SC9及SC6068有色體蛋白質(zhì)圖譜斑點(diǎn)檢測, 對檢測出的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的總濃度均一化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種密度梯度法提取木薯有色體比較

圖 2所示, 木薯塊根有色體經(jīng)三種密度梯度離心后都有比較明顯的分層。其中蔗糖梯度分離法分離(圖2-A)的有色體粗體物共有3層, 各條帶間分層明顯, 分別為0/17%、17%/30%和30%/50%, 但所分離的各梯度層顏色較淡。Percoll密度梯度離心法(圖2-B)分離的有色體層共有 5層, 分別為 0/20%、20%/30%、30%/40%、40%/50%和50%/60%, 各梯度也有明顯的分離層, 且梯度層間的顏色較深。Nycodenz密度梯度離心法(圖 2-C)分離有色體粗提物共有4層, 分別為0/15%、15%/20%、20%/24%和24%/30%, 其中 0/15%的梯度層有明顯的深黃色條帶, 而 15%/20%的梯度層間分離不明顯, 20%/24%和24%/30%的梯度層僅有細(xì)的淡黃色條帶。光學(xué)顯微鏡下觀察, 蔗糖密度梯度法和Nycodenz密度梯度法所分離的有色體大多破碎, 且含有其他細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。而Percoll密度梯度離心法分離的有色體比較完整, 其在 40%/50%的梯度層間僅含有少量破碎的有色體。在光學(xué)顯微鏡下(圖3)可以看到木薯塊根的有色體具有膜結(jié)構(gòu)包圍, 主要積累晶狀有色體。

圖2 3種木薯有色體密度梯度離心法比較分析Fig. 2 Comparative analysis of centrifugation methods (DGCMs) with three density gradient in cassava root A: 蔗糖密度梯度離心法; B: Percoll密度梯度離心法; C: Nycodenz密度梯度離心法。A: sucrose DGCM; B: percoll DGCM; C: nycodenz DGCM.

圖3 光學(xué)顯微觀察Percoll密度梯度離心法40%/50%梯度層分離所得有色體Fig. 3 Chromoplast isolated from 40%/50% Percoll DGCM under optical microscope

2.2 Western blot分析有色體純度Actin相對表達(dá)水平

Western blot檢測不同密度梯度離心法表明, 以看家基因 Actin (圖 4-A)蛋白質(zhì)表達(dá)水平作為內(nèi)參,均一化處理后, 質(zhì)體標(biāo)記抗體RbcL (圖4-C)的雜交信號在Percoll梯度離心法的40%/50%梯度層間的含量最高, 對比其他層間達(dá)到顯著水平, 表明有色體在該梯度得到高度富集。Nycodenz梯度法的雜交信號最低, 表明該方法所分離各梯度層中的有色體含量較少。蔗糖梯度法居中, 表明其在各梯度間也富集了部分有色體。相反, 在各梯度層檢測不到或較少檢測到其他亞細(xì)胞器標(biāo)記蛋白的雜交信號。線粒體標(biāo)記抗體 Vdac1 (圖 4-B)在 40%/50% Percoll DGCM梯度層中的雜交信號對比其他分離層含量較低, 對比其他梯度層達(dá)到顯著水平。而蔗糖梯度分離法17%/30%與30%/50%梯度層中Vdac1的雜交信號最高, 表明其受到了線粒體的污染。而 Nycodenz梯度分離法所分離的梯度層Vdac1雜交信號也較低。

2.3 木薯塊根有色體差異蛋白質(zhì)KEGG分析

從雙向電泳圖譜(圖5), 經(jīng)Delta2D分析軟件分析, 選取表達(dá)量差異為 2.0倍[15]以上的蛋白質(zhì)點(diǎn) 34個(gè)(圖5-C)。其中上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)為17個(gè)(圖5-A,用黑色箭頭表示), 下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn) 17個(gè)(圖5-B, 用白色箭頭表示)。運(yùn)用 KEGG數(shù)據(jù)庫鑒定出的蛋白質(zhì)點(diǎn)按功能分為8類(表1)即碳代謝及能量代謝相關(guān)蛋白(12個(gè), 蛋白質(zhì)點(diǎn)1、2、3、4、5、7、8、17、21、22、33)、抗氧化及解毒蛋白(6個(gè), 蛋白質(zhì)點(diǎn) 10、11、12、23、27、30)、氨基酸代謝蛋白質(zhì)(3個(gè), 蛋白質(zhì)點(diǎn)9、24、31)、蛋白質(zhì)生物合成蛋白(5個(gè), 蛋白質(zhì)點(diǎn)6、14、29、20、18)、分子伴侶蛋白(1個(gè), 蛋白質(zhì)點(diǎn)13)、DNA及RNA代謝相關(guān)蛋白質(zhì)(1個(gè), 蛋白質(zhì)點(diǎn)15)、DNA結(jié)合蛋白質(zhì)(1個(gè), 蛋白質(zhì)點(diǎn)19)及未知功能蛋白質(zhì)(5個(gè), 蛋白質(zhì)點(diǎn)16、25、26、28、34)。其中, 碳代謝與能量代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)所占比例最大(35.2%), 抗氧化及解毒的蛋白質(zhì)(17.6%)其次。結(jié)合差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對表達(dá)量可以看到, 碳代謝與能量代謝、分子伴侶、DNA及RNA代謝相關(guān)蛋白在SC9塊根有色體中大部分上調(diào)表達(dá)。而抗氧化及解毒、蛋白質(zhì)生物合成、氨基酸代謝等在SC9和SC6068均有上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。

圖4 Western blot分析有色體純度Fig. 4 Purity analysis using Western blot of chromoplast isolated by different methods A: Actin; B: Vdac1; C: RbcL.

圖5 SC9(A)和SC6068(B)塊根有色體雙向凝膠電泳及其疊加圖(C)Fig. 5 2-DE images of the chromoplast global proteins from cassava storage roots of SC9 (A) and SC6068 (B), and their overlap map (C)

表1 SC9與SC66068塊根有色體差異蛋白質(zhì)鑒定Table 1 Identification of chromoplast differential proteins from cassava storage roots of SC9 and SC6068

(續(xù)表1)

2.4 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

34個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中通過質(zhì)譜分析(使用Phytozome及NCBI數(shù)據(jù)庫比對), 得到匹配的28個(gè)蛋白質(zhì)(點(diǎn)1、2、3、4、5、7、8、17、21、22、33、10、11、23、27、30、9、24、31、14、29、6、20、18、13、15、25 和 26)。通過 String 在線軟件(http://www.string-db.org/)將其構(gòu)建蛋白質(zhì)互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 并隱藏沒有相互作用的蛋白質(zhì)點(diǎn)。由圖 6得知共有16個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)建立18種互作關(guān)系, 連接線的粗細(xì)代表互作的強(qiáng)弱關(guān)系。其中互作最多的蛋白質(zhì)是點(diǎn) 4 (Enolase 2)與點(diǎn) 18 (elongation factor, partial-Triticum aestivum), 均與6種蛋白質(zhì)發(fā)生互作關(guān)系, 點(diǎn)4為上調(diào)表達(dá), 點(diǎn)18為下調(diào)表達(dá)。其次為點(diǎn)21 (phosphoglycerate kinase,下調(diào))共與4種蛋白質(zhì)有互作關(guān)系, 再次為點(diǎn) 17 (phosphoglucomutase, 上調(diào))、點(diǎn)20 (elongation factor Tu, chloroplastic-like, 上調(diào))和點(diǎn)5 (ATP synthase beta subunit, 上調(diào)), 都與3種蛋白質(zhì)發(fā)生互作。點(diǎn)1 (Starch phosphorylase, 上調(diào))、點(diǎn) 2 (aconitase, 上調(diào))、點(diǎn) 15 (glycine-rich RNA-binding protein)均與2種蛋白質(zhì)發(fā)生互作。點(diǎn)24 (sensory transduction histidine kinase, 下調(diào))、點(diǎn)7(ccaat-binding transcription factor subunit A, 上調(diào))、點(diǎn)14 (initiation factor eIF5-A, 上調(diào))、點(diǎn)33 (putative inorganic pyrophosphatase, 上調(diào))、點(diǎn) 22 (sinapyl alcohol dehydrogenase, 下調(diào))、點(diǎn)30 (ferritin 2 precursor family protein, 下調(diào))、點(diǎn) 11 (ferritin, plant, putative, 上調(diào))等僅與1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)生互作。

2.5 差異蛋白質(zhì)點(diǎn) Enolase 2和 Elongation Factor基因表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證

qRT-PCR顯示, SC9的Enolase 2基因表達(dá)水平顯著高于SC6068的表達(dá)水平, 為1.48倍, 與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果相一致。在轉(zhuǎn)錄水平上, SC9的Elongation Factor基因的表達(dá)量顯著高于 SC6068,為其 2.12倍, 但在差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析上, Elongation Factor在 SC9中下調(diào)表達(dá), 表達(dá)量僅為SC6068的0.42倍, 轉(zhuǎn)錄水平與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果相反。以SC6068作為對照, Enolase 2和Elongation Factor基因表達(dá)結(jié)果變化如圖7所示。

圖6 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 Interaction network of different proteins黑色箭頭標(biāo)示上調(diào), 黃色箭頭標(biāo)示下調(diào)。蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的連接線的粗細(xì)標(biāo)示互作的強(qiáng)弱。The black arrows mena up-regulation, the yellow arrows mean down-regulation. The thickness of lines lelwean protein spots means the strength of interactions.

圖7 SC9和SC068塊根Enolase 2和Elongation Factor基因表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證Fig. 7 Expression of Enolase 2 and Elongation Factor genes in the SC9 and SC6068 cassava storage roots validated by qRT-PCR

3 討論

類胡蘿卜素具有抗氧化、預(yù)防腫瘤和心血管疾病的重要作用, 同時(shí)也是維生素A和植物激素ABA合成的前體物質(zhì), 對改良木薯的品質(zhì)具有重要作用[4],研究木薯塊根有色體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異, 可為揭示塊根類胡蘿卜素的差異提供一定的理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞器的純度及完整性是繼續(xù)進(jìn)行其蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵, 提取分離方法決定了所得到亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的純度和完整性[8-11]。在柑橘、辣椒、番茄等植物中已有研究[14-17], 首先將植物材料破碎差速離心獲得有色體的粗提物, 再將粗提物用提取緩沖液稀釋后平鋪于Nycodenz、Percoll、蔗糖密度梯度液進(jìn)行高速離心, 從而分離獲得完整有色體。本研究顯示, Percoll密度梯度離心法優(yōu)于其他兩種提取方法并能夠從木薯塊根中分離得到完整的有色體。蔗糖法的提取緩沖液所粗提得到的有色體含量較少,原因是蔗糖密度梯度液中蔗糖分子是高滲透性分子,在對木薯塊根有色體分離的過程中造成滲透壓的變化引起有色體的破裂, 破壞了有色體的完整性。Nycodenz梯度離心法與 Percoll梯度離心法所用的提取緩沖液的配方一致。但Percoll法的20%-30%-40%-50%-60% Percoll密度液能夠較好地對有色體粗提物懸浮液進(jìn)行充分分離, 提高樣品分離率。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有色體結(jié)構(gòu)完整主要分布在40%～50%分離層的Percoll梯度層, 且此梯度間的樣品經(jīng)Western blot純度檢測, Vdac1的雜交信號要顯著低于其他層間, 而有色體提取過程中極易混雜線粒體等細(xì)胞器[22], 表明該層有色體的純度較高。而質(zhì)體標(biāo)記性抗體 RbcL的雜交信號要顯著高于各個(gè)Percoll分離層及其他分離方法, 表明有色體在該層間得到高度富集。

本研究以低類胡蘿卜素含量的木薯品種SC6068為對照, 分析比較高類胡蘿卜素的SC9塊根有色體蛋白質(zhì)變化, 鑒定得到 34個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn),分屬 8個(gè)不同的蛋白質(zhì)家族, 其中包含碳代謝及能量代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成等諸多代謝途徑,表明木薯塊根有色體含有豐富的代謝途徑, 這與鑒定得到番茄有色體蛋白質(zhì)組的結(jié)果相近[14]。其中最多的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)屬于碳代謝與能量代謝途徑的蛋白質(zhì), 共有11個(gè)且大部分上調(diào)。表明有色體作為異養(yǎng)型質(zhì)體存在一系列合成代謝途徑, 并依賴于能量的供給來推動必要的新陳代謝活動[23-24]。腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)ADP與ATP。膜的形成與擴(kuò)增是有色體生物合成與發(fā)育的重要特征, 在異養(yǎng)型細(xì)胞器中, 腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠優(yōu)先調(diào)節(jié) ATP進(jìn)入質(zhì)體中影響新陳代謝的強(qiáng)度, 能夠提供額外的能量形成有色體膜結(jié)構(gòu)進(jìn)而促進(jìn)有色體的發(fā)育[25-26]。SC9與SC6068差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中的點(diǎn)7 (轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)蛋白)和點(diǎn)5 (ATP合成相關(guān)蛋白)都在SC9中上調(diào)表達(dá), 可能與SC9有色體和類胡蘿卜素含量高有關(guān)。最新的蛋白質(zhì)組分析表明與ATP合成及轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)蛋白質(zhì)為有色體中豐度最高的蛋白質(zhì), 表明能量產(chǎn)生及轉(zhuǎn)運(yùn)體在有色體中的重要性[27]。此外鑒定得到一個(gè)參與碳代謝的點(diǎn) 4 (Enolase 2)參與互作的關(guān)系最多且在SC9中上調(diào)表達(dá)。該酶催化2-磷酸甘油酸脫水生成磷酸烯醇式丙酮酸, 而最終產(chǎn)物丙酮酸作為類胡蘿卜素生物合成的前體物質(zhì)參與了有色體代謝。本研究還進(jìn)一步運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上對Enolase 2基因進(jìn)行驗(yàn)證, 發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量在SC9塊根要顯著高于SC6068。SC9中該酶的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)了類胡蘿卜素前體物質(zhì)在有色體積累, 這可能是造成SC9與SC6068差異的原因之一。

本研究鑒定的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中有 6個(gè)與蛋白質(zhì)合成相關(guān), 3個(gè)與氨基酸代謝相關(guān), 1個(gè)與分子伴侶相關(guān)。分子伴侶蛋白作為質(zhì)子通道復(fù)合體蛋白的成員, 能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)前體的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要的作用[28],此外, 也能夠參與蛋白質(zhì)的折疊與去折疊, 組裝與去組裝[29-30]。本研究鑒定一個(gè)熱激蛋白在SC9中上調(diào)表達(dá), 而熱激蛋白能夠作為輔因子參與到質(zhì)體的分化和發(fā)育, 并參與穩(wěn)定質(zhì)體中部分折疊或未折疊蛋白質(zhì)的構(gòu)象。其中, 鑒定到 2個(gè)蛋白質(zhì)生物合成的延長因子(點(diǎn)18、點(diǎn)20)能夠參與蛋白質(zhì)的降解, 這些降解酶形成的復(fù)合體能夠驅(qū)動前體蛋白進(jìn)入質(zhì)體而后切除導(dǎo)肽[14]。不同發(fā)育時(shí)期或環(huán)境條件下, 質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和生理功能都發(fā)生明顯變化[31], 因此保持蛋白質(zhì)合成與降解相對平衡對于有色體的穩(wěn)定至關(guān)重要[32]。有研究表明, 此蛋白質(zhì)定位在質(zhì)體上且與質(zhì)體的發(fā)育和分化密切相關(guān), 該蛋白能夠影響植物生長及質(zhì)體的分化[33]。推測其在SC9中的下調(diào)表達(dá)可能與SC9質(zhì)體中類胡蘿卜素積累有密切的關(guān)系。但轉(zhuǎn)錄水平上, elongation factor基因表達(dá)與差異蛋白質(zhì)組的表達(dá)水平相反, 是否是轉(zhuǎn)錄后修飾造成表有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

建立一種適合木薯塊根有色體的提純方法。Percoll密度梯度離心法適合木薯塊根有色體的提取且提純的有色體具有較高的完整性和純度。差異蛋白質(zhì)涉及到以下途徑: 碳代謝與能量代謝、抗氧化及解毒、氨基酸代謝、分子伴侶、蛋白質(zhì)生物合成等。其中碳代謝與能量代謝所占比例最高, 表明高類胡蘿卜素品種與低類胡蘿卜素品種間在存在能量代謝上的差異, 而類胡蘿卜素合成的前體物質(zhì)是由能量代謝的中間產(chǎn)物所提供。尤其是互作網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白醛縮酶在SC9上調(diào)表達(dá)與質(zhì)體分化相關(guān)的延長因子蛋白下調(diào)表達(dá)是造成類胡蘿卜素差異的原因之一。

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Chromoplast Isolation and Its Proteomic Analysis from Cassava Storage Roots

DENG Chang-Zhe1,2, YAO Hui1, AN Fei-Fei1, LI Kai-Mian1, and CHEN Song-Bi1,*

1Tropical Crops Genetic resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Germplasm Resources Conservation and Utilization of Cassava, Danzhou 571737, China;2Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China

Chromoplasts are the sites to store carotenoids and regulate a variety of physiological and biochemical process in the storage roots of cassava (Manihot esculenta Crantz). In the present study, it was found that Percoll density gradient centrifugation was suitable for isolating the chromoplasts from cassava storage roots. Rich and intact chromoplasts were located in 40% to 50% layer of Percoll and the expression level of Vdac1, a mitochondrial marker, was the lowest and the expression level of RbcL, a plastid marker, was the highest compared with other layers using Western blot. Thirty-four differentially expressed proteins were detected in SC9, in which 17 were up-regulated, and the others were down-regulated. The differential proteins related to carbohydrate and energy metabolism accounted for the highest proportion. The STRING protein-protein interaction network showed that Enolase 2 and Elongation Factor were the hub proteins, which play the key roles in the whole regulatory network. Quantitative analysis by qRT-PCR confirmed the Enolase 2 expression was more significantly up-regulated in the high carotenoid cassava variety than in the low carotenoid cassava SC6068. These two proteins may be the key points for affecting the carotenoid content between SC9 and SC6068.

Cassava storage root; Chromoplast protein; Isolation method; Proteomics

(

): 2016-11-24; Accepted(接受日期): 2017-04-19; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-22.

10.3724/SP.J.1006.2017.01290

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271776)和海南省高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才基金項(xiàng)目(2012-2016)資助。

The study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31271776) and the Initial Fund of High-level Creative Talents in Hainan Province (2012–2016).

*通訊作者(Corresponding author): 陳松筆, E-mail: songbichen@catas.cn

聯(lián)系方式: E-mail: 344498529@qq.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170522.0916.010.html