安晶，潘澤，李鴻彬*

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆 石河子832003）

GDSL脂肪酶增強棉花對大麗輪枝菌的抗性

安晶，潘澤，李鴻彬*

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆 石河子832003）

大麗輪枝菌是影響棉花生長發(fā)育的一種通過土傳真菌維管束的病菌，嚴(yán)重影響棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)。為研究棉花GDSL脂肪酶（GDSL lipase,GLIP）在植物響應(yīng)大麗輪枝菌中的重要功能，本研究利用大麗輪枝菌懸浮液對新陸早42號及其轉(zhuǎn)GhGLIP基因的棉花株系葉片進行處理，分析轉(zhuǎn)GhGLIP棉花株系對大麗輪枝菌的生理生化響應(yīng)。結(jié)果表明，棉花GDSL脂肪酶基因GhGLIP能夠響應(yīng)大麗輪枝菌的刺激，轉(zhuǎn)GhGLIP基因棉花株系可顯著抑制大麗輪枝菌導(dǎo)致的葉片細(xì)胞死亡。與未處理相比，經(jīng)大麗輪枝菌處理后的野生型和轉(zhuǎn)基因棉花株系植株的GDSL脂肪酶活力顯著增加。同時，轉(zhuǎn)基因棉花株系植株過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化物酶的表達(dá)顯著提升，說明GhGLIP基因誘導(dǎo)了棉花對大麗輪枝菌的抗性。本研究為棉花抵抗大麗輪枝菌的分子機制解析，及進一步利用基因工程技術(shù)培育抗病棉花材料提供了有效參考。

GDSL脂肪酶；大麗輪枝菌；棉花抗?。豢寡趸到y(tǒng)酶類

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物，但是其生長發(fā)育受到多種病害的影響，尤其是大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病是較為嚴(yán)重的影響棉花產(chǎn)量的真菌病害。該病害廣泛分布于各個產(chǎn)棉地區(qū)，且有逐年加重的趨勢[1]。針對黃萎病的防治，目前未見對環(huán)境無污染的化學(xué)防治藥劑[2]，因此，運用基因工程技術(shù)培育抗病棉花品種是當(dāng)前主要的防治措施之一[3]。

植物GDSL脂肪酶是一個相對較大的家族酶類，具有多種功能，在植物生長發(fā)育、器官形態(tài)構(gòu)成、次生代謝以及防御反應(yīng)等生理活動中起到十分重要的作用[4]。植物GDSL脂肪酶基因的表達(dá)可以被多種生物因素及非生物因素的誘導(dǎo)，也受到植物激素如水楊酸（salicylic acid）、乙烯（ethylene）、茉莉酸（jasmonic acid）等的調(diào)控[5]。植物抗病性的表現(xiàn)是在一定的環(huán)境條件影響下寄主植物的抗病性基因和病原物的致病基因相互作用的結(jié)果[6]，GDSL脂肪酶能夠通過信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)或者直接破壞真菌孢子在植物體中結(jié)構(gòu)的完整性，限制其正常繁殖[7]。棉花在生長過程中會遇到各種生物和非生物脅迫，例如大麗輪枝菌會嚴(yán)重危害棉花的生長發(fā)育。植物在受到病害脅迫時，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[5]，從而影響植物的正常生長發(fā)育，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶可以清除ROS并保持細(xì)胞的氧化還原平衡[8-9]。

棉花GDSL脂肪酶與黃萎病相關(guān)的研究少有報道。本研究以前期獲得的過量表達(dá)GDSL脂肪酶基因GhGLIP的棉花株系為對象，利用大麗輪枝菌分別處理野生型和轉(zhuǎn)基因棉花葉片，GDSL脂肪酶顯著增強了轉(zhuǎn)基因棉花植株對于大麗輪枝菌的抗性，以期為解析棉花大麗輪枝菌的分子機制及培育抗病品種奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

陸地棉新陸早-42號野生型和轉(zhuǎn)基因棉花、大麗輪枝菌為本實驗室保存，大麗輪枝菌處理后的各種野生型和轉(zhuǎn)基因棉花材料氮速凍后，于-80℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取和qRT-PCR表達(dá)分析

各棉花材料采用CTAB方法提取棉花總RNA，參照試劑盒的實驗步驟說明，以棉花RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板進行qRT-PCR分析，所使用的引物利用Primer 5.0軟件進行設(shè)計，并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 使用的引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.2.2 大麗輪枝菌培養(yǎng)與接種處理

參照張興華等[10]的方法，配制大麗輪枝菌孢子濃度為1×107個/mL的懸浮液，棉簽沾取菌液后在葉片表面涂抹，用水做對照處理，每棵植株處理3片葉片，每個處理設(shè)置9株作為重復(fù)。分別在接種0、1、3、5和 7 d后，摘下處理的葉片，置于 -80 ℃的冰箱，備用，用于酶活測定。

1.2.3 細(xì)胞染色

將經(jīng)過大麗輪枝菌處理后3 d的葉片，置于DAB（1 mg/mL，pH 3.8）中染色 12 h，用脫色液（無水乙醇∶乙酸∶甘油∶水 =8∶1∶1∶1）于 37 ℃條件下脫色36 h，將葉片放置在干凈的載玻片上，將Trypan blue染液均勻滴于葉面上，蓋上蓋玻片，靜置20 min，用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計葉片的壞死面積。細(xì)胞死亡率=細(xì)胞壞死面積/葉片總面積。

1.2.4 酶活力測定

脂肪酶（Lipase）的活力測定使用對硝基苯酚法[11]測定，并參照程璐等[12]的方法；多酚氧化酶（Polyphenolo-xi das，PPO）活力測定使用鄰苯二酚法；超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase，SOD）活力測定使用NBT方法；過氧化物酶（Peroxidase，POD）活力測定使用愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫酶（Catalase，CAT）測定使用紫外分光光度碘量方法；苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase,PAL）參照邢會琴等[13]的方法。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗所獲數(shù)據(jù)為獨立3次重復(fù)實驗的平均值，數(shù)據(jù)差異性檢驗分析用Student t test方法檢測，圖表制作運用Orgin 8.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhGLIP響應(yīng)大麗輪枝菌處理的表達(dá)分析

由圖1可見：經(jīng)大麗輪枝菌處理1 d時，轉(zhuǎn)基因棉花植株葉片中GhGLIP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和酶活力均顯著增加，在處理5 d時達(dá)到最大值，隨后保持穩(wěn)定，表明GhGLIP基因?qū)τ诖篼愝喼碳さ捻憫?yīng)迅速。

圖1 轉(zhuǎn)基因棉花中GhGLIP響應(yīng)大麗輪枝菌刺激的表達(dá)分析Fig.1 Analysis of GhGLIP expression in the transgenic cotton plants in response toVerticillium dahilaestimulus

2.2大麗輪枝菌處理棉花葉片的表型分析

利用大麗輪枝菌處理野生型和轉(zhuǎn)基因棉花葉片，野生型棉花在處理2 d時表面有褐色斑點出現(xiàn)，處理3 d時出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，并且出現(xiàn)較多的壞死斑點。轉(zhuǎn)基因棉花植株僅出現(xiàn)少量褐色斑點，無嚴(yán)重的萎蔫現(xiàn)象。DAB-臺盼藍(lán)染色定量分析細(xì)胞壞死的結(jié)果（圖2）顯示：野生型棉花葉片有大面積的死亡，死亡面積達(dá)55%以上，轉(zhuǎn)基因棉花植株葉片細(xì)胞死亡率為20%左右，表明GDSL脂肪酶顯著增強了棉花植株對大麗輪枝菌的抗性。

圖2 大麗輪枝菌處理轉(zhuǎn)基因棉花葉片的表型分析Fig.2 Phenotypic analysis of transgenic cotton leaf afterVerticillium dahilaetreatment

2.3 大麗輪枝菌處理后的棉花脂肪酶活性測定

大麗輪枝菌處理后的棉花脂肪酶活性測見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)基因棉花中GDSL脂肪酶活性測定Fig.3 Measurement of GDSL lipase enzyme activity of transgenic cotton plants underVerticillium dahilaetreatment

由圖3可見：經(jīng)大麗輪枝菌處理后，野生型和轉(zhuǎn)基因棉花中的脂肪酶活性均呈逐步增長的趨勢，在處理5 d時酶活力達(dá)到最高值，而后趨于穩(wěn)定；與野生型相比，轉(zhuǎn)基因棉花中的脂肪酶活力顯著增加。這表明GDSL脂肪酶的表達(dá)與植物響應(yīng)大麗輪枝菌的刺激密切相關(guān)。

2.4 轉(zhuǎn)基因棉花抗氧化酶活分析

經(jīng)大麗輪枝菌處理后，以水處理作為對照，與野生型棉花相比，轉(zhuǎn)基因棉花植株中的CAT、POD和SOD的表達(dá)均有顯著的提升。CAT和POD的酶活力在大麗輪枝菌處理5 d時達(dá)到峰值并保持穩(wěn)定表達(dá)，SOD酶活力在大麗輪枝菌處理3 d時，表現(xiàn)出快速的響應(yīng)表達(dá)（圖4）。這表明轉(zhuǎn)基因棉花中的抗氧化系統(tǒng)酶類對于大麗輪枝菌的刺激響應(yīng)具有較高的敏感性，并與棉花的抗病性獲得聯(lián)系緊密。

圖4 轉(zhuǎn)基因棉花植株的抗氧化酶活性分析Fig.4 Activity analysis of antioxidant enzyme in the transgenic cotton plants

2.5 轉(zhuǎn)基因棉花PAL和PPO酶活性分析

大麗輪枝菌處理棉花后，野生型和轉(zhuǎn)基因棉花中的PAL和 PPO的表達(dá)均顯著升高，且在轉(zhuǎn)基因棉花中的表達(dá)高于野生型棉花。PAL和PPO酶活力均在處理5 d時達(dá)到峰值；PPO對于大麗輪枝菌的刺激響應(yīng)更敏感，處理3 d時呈現(xiàn)出顯著提升（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)基因棉花植株P(guān)AL和PPO酶活性分析Fig.5 Activity analyses of PAL and PPO enzymes in the transgenic cotton plants

3 討論

GDSL脂肪酶在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。GDSL脂肪酶能夠誘導(dǎo)植物對真菌產(chǎn)生抗病性，與野生型植株相比，glip-1突變體植株對腐生真菌蕓苔表現(xiàn)為更強的敏感性[16-17]。許多研究表明植物的體內(nèi)過量表達(dá)GDSL1可以增強對多種病原真菌和細(xì)菌的抗性，并且在這個過程中乙烯介導(dǎo)的信號途徑誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗病性發(fā)揮著重要作用[18-19]。本研究以過量表達(dá)GDSL脂肪酶基因的轉(zhuǎn)基因棉花為對象，轉(zhuǎn)基因棉花對于大麗輪枝菌的抗性獲得了顯著增強。

GDSL脂肪酶具有引起對多種病原體的廣譜抗性的活性[20]，植物可利用多層免疫系統(tǒng)來抵抗病原體的攻擊[21]。植物被病原菌侵染時，一些生理生化反應(yīng)如植保素等次級代謝產(chǎn)物的合成、β-1、與3-葡聚糖酶以及幾丁酶等與病原相關(guān)蛋白的激活、富含羥脯氨酸蛋白在細(xì)胞壁中的積累等不會被誘導(dǎo)[22]。一些抗氧化酶類如PPO和PAL等則會大量累積。PPO在植物抗病反應(yīng)中起到重要的作用，PPO能夠催化木質(zhì)素及其它酚類氧化產(chǎn)物的生成，構(gòu)成保護性屏障從而抵抗病菌的侵入[23-24]；PAL是苯丙氨代謝的第一關(guān)鍵酶，與包括木質(zhì)素、香豆素、類黃酮、羥基肉桂酸酯以及異類黃酮衍生物等在內(nèi)的植物抗毒素的合成有密切關(guān)系[25]。本研究中轉(zhuǎn)基因棉花的抗氧化系統(tǒng)酶類CAT、SOD和POD，以及PAL和PPO的均能響應(yīng)大麗輪枝菌菌刺激并具有較高的表達(dá)，表明了這些酶表達(dá)在病菌響應(yīng)過程中的重要作用。

植物響應(yīng)大麗輪枝菌的過程十分復(fù)雜，與多個生理生化過程密切相關(guān)，本研究為棉花抗病分子機制解析和利用基因工程技術(shù)培育抗病棉花新材料奠定了一定基礎(chǔ)。

[1]林玲，張昕，鄧晟.棉花黃萎病研究進展[J]棉花學(xué)報，2014，26(3):260-267.Lin L，Zhang X，Deng C.Research advance in cottonVerticllium wilt[J].Cotton Science，2014，26(3):260-267.

[2]郭寶生，師恭曜，王凱輝，等.黃萎病菌侵染下陸地棉D(zhuǎn)irigent-like蛋白基因表達(dá)差異分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué).2014，47(22):4349-4359.Guo B S，Shi G Y，Wang K H，et al.Expression differences of Dirigent like protein genes in upland cotton responsed to infection byVerticillium dahlia[J].Scientia Agricultura Sinica，2014，47(22):4349-4359.

[3]Cary J W，Rajasekaran K J，Jesse M.Transgenic expression of a gene encoding a synthetic antimicrobial peptide results in inhibition of fungal growth in vitro and in planta[J].Plant Science，2000，154(2):171-181.

[4]II Seok O，Ae R P，Seok B M，et al.Secretome analysis reveals anArabidopsis lipaseinvolved in defense againstAlternaria brassicicola[J].Plant Cell，2005，17(10):2832-2847.

[5]Lee D S，Kim B K，Kwon S J，et al.Arabidopsis GDSL lipase 2 plays a role in pathogen defense via negative regulation of auxin signaling[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，379(4):1038-1042.

[6]劭佳麗，繆衛(wèi)國，劉海洋，等.新疆主要棉區(qū)棉花黃萎病菌致病力分化及其遺傳多樣性分析[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，46(1):122-127.Shao J L，Niu W G，Liu H Y，et al.Analysis on pathogenicity differentiation of cottonVerticillium dahliaestrainsand its genetic diversity in Xinjiang[J].Xinjiang Agricultural Sciences，2009，46(1):122-127.

[7]Naranjo M A，F(xiàn)orment J M，Serrano R，et al.Overexpression ofArabidopsis thalianaLTL1，a salt-induced gene encoding a GDSL-motif lipase，increases salt tolerance in yeast and transgenic plants[J].Plant Cell&Environment，2006，29(10):1890-1900.

[8]田秀明，徐利鋒.棉花對枯黃萎病的抗性與過氧化物酶活性的關(guān)系[J].植物病理學(xué)報，1991，21(2):94.Tian X M.，Xu L F.The relations between resistance of cotton toVerticilliumandFusarium wiltand peroxidase activity[J].Acta Phytopathologica Sinia，1991，21(2):94.

[9]汪紅，劉輝，袁紅霞，等.棉花黃萎病不同抗性品種接菌前后體內(nèi)酶活性及酚類物質(zhì)含量的變化 [J].華北農(nóng)學(xué)報，2001，16(3):46-51.Wang H，Liu H，Yuan H X，et al.The Change of enzymes activity and phenois content in cotton cultivars with different esistanrce toV.dahliaeafter inoculation[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica，2001，16(3):46-51.

[10]張興華，李捷.棉花抗枯、黃萎病研究進展及其抗性鑒定方法[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，20(3):43-49.Zhang X H，Li J.Study progress and resistance identification method of cotton to fusarium wilt andVerticillium wilt[J].Acta Agriculturae Jiangxi，2008，20(3):43-49.

[11]江慧芳，王雅琴，劉春國.三種脂肪酶活力測定方法的比較[J].化學(xué)與生物工程，2007，24(8):72-75.Jiang H F，Wang Y Q，Liu C G.Comparison and improvement of three determination methods for lipase activity[J].Chemistry and Bioengineering，2007，24(8):72-75.

[12]程璐，賀春貴，胡桂馨，等.苜蓿斑蚜危害對5種苜蓿品種(系)PAL、POD、PPO 酶活性的影響[J].植物保護，2009，35(6):87-90.Chen L，Hei C G，Hu G X，et al.The effects of Therioaphis trifolii on the activities of PAL，POD and PPO in five alfalfa varieties[J].Plant Protection，2009，35(6):87-90.

[13]邢會琴，李敏權(quán)，徐炳良，等.過氧化氫酶和苯丙氨酸解氨酶與苜蓿白粉病抗性的關(guān)系 [J].草地學(xué)報，2007，15(4):376-380.Xing H Q，Li M Q，Xu B L，et al.Relationships between leaf POD and PAL and the resistance of alfalfa cultivars against powdery mildew[J].Acta Agrestia Sinica，2007，15(4):376-380.

[14]Huang L M，Lai C P，Chen L F，et al.Arabidopsis SFAR4 is a novel GDSL-type esterase involved in fatty acid degradation and glucose tolerance[J].Botanical Studies，2015，56(1):1-12.

[15]Sugui J A，Julian P，Yun C C，et al.Role of laeA in the regulation of alb1，gliP，conidial morphology and virulence inAspergillus fumigatus[J].Eukaryotic Cell，2007，6(9):1552-1561.

[16]Zuo K J，Wang J，Wu W，et al.Identification and characterization of differentially expressed ESTs ofGossypium barbadenseinfected byVerticillium dahliaewith suppression subtractive hybridization[J].Mol Biol(Mosk)，2005，39(2):214-223.

[17]袁哈利，郝曉云，鄭學(xué)偉，等.陸地棉GDSL脂肪酶增強擬南芥對黃萎病菌的抗性[J].石河子大學(xué)(自然科學(xué)版),2015，33(5):529-534:Yuan H L，Hao X Y，Zheng X W，et al.Cotton GDSL lipase increases the resistance againstVerticillium dahilae[J].Journal of Shihezi University(Natural Science)，2015，33(5):529-534.

[18]Tian J，Zhang X，Liang B，et al.Expression of baculovirus anti-apoptotic genes p35 and op-iap in cotton(Gossypium hirsutumL.)enhances tolerance toVerticillium wilt[J].PlosOne，2010，5(12):e14218.

[19]Hye G K，Sun J K，Young J J，et al.GDSL lipase 1 regulates ethylene signaling and ethylene-associated systemic immunity in arabidopsis[J].FEBS Letters，2014，588:165-1658.

[20]Hong J K，Choi H W，Hwang I S，et al.Function of a novel GDSL-type pepper lipase gene GLIP1 in disease susceptibility and abiotic stress tolerance[J].Planta，2008，227(3):539-558.

[21]韓盛，向本春.植物病毒分子檢測方法研究進展[J].石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，24(5):550-553.Han S，Xiang B C.Advances of methods for the molecular detection of plant virus[J].Journal of Shihezi University(Natural Science)，2006，24(5):550-553.

[22]巧汪.植物抗病機理研究進展綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)通報，2015，21(8):25-30.Wang Q，Advances on the mechanism of plant disease resistance[J].Anhui Agri Sci Bull，2015，21(08):25-30.

[23]王志衛(wèi)，貝學(xué)軍，朱世平，等.植物激素在植物抗病過程中的作用研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(15):9035-9038.Wang Z W，Bei X J，Zhu S P，et al.Recent advances in phytohormone regulated plant resistance to pathogens[J].Journal of Anhui Agri Sci，2011，39(15):9035-9038.

[24]趙鳳軒，戴小楓.棉花黃萎病菌的侵染過程[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(4):786-792.Zhao F X，Dai X F.Infection process ofVerticillium dahliaeKlebahn in cotton[J].Genomics and Applied Biology，2009，28(4):786-792.

[25]Gayoso C，Pomar F，Novouzal E，et al.The Ve-mediated resistance response of the tomato toVerticillium dahliaeinvolvesH2O2peroxidaseand ligninsand drivesPAL gene expression[J].BMC Plant Biol，2010，10(1):232-239.

GDSL lipase increases the resistance againstVerticillium dahilaeinGossypium hirsutum

An Jing,Pan Ze,Li Hongbin*
(College of Life Sciences/Key laboratory of Agrobiotechnology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

Verticillium dahilaeis a soil-brone fungal pathogen through vasculature,and affects the yield and quality of cotton fiber seriously.To investigate the important function of cotton GDSL lipase (GLIP)in response toVerticillium dahilae,physiological analyses of wild-type (WT)cotton (Xinluzao 42)and transgenic cotton overexpressing GhGLIP underVerticillium dahilaetreatment were performed in this study.The results indicated that the expression of GhGLIP gene was induced underVerticillium dahilaestimulation,and transgenic cotton plants showed obviously inhibition of leaf cell death that was caused byVerticillium dahliae.Compared with the untreated control,GDSL lipase enzyme activity of both WT and transgenic cotton plants increased significantly afterVerticillium dahilaetreatment.Meanwhile,in transgenic cotton plants,the enzyme activities of catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD),peroxidase(POD),phenylalanine ammonialyas(PAL)and polyphenoloxidase(PPO)were significantly enhanced,demonstrating that GhGLIP induced the resistance of cotton plants toVerticillium dahilae.These results provided an effective reference for elucidating the molecular mechanism of cotton resistance toVerticillium dahliaeand improvement of cotton breeding through genetic engineering technology.

GDSL lipase;Verticillium dahilae;cotton resistance;antioxidant enzymes

S562；S432.44

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.04.005

1007-7383(2017)04-0420-05

2017-03-24

國家自然科學(xué)基金項目（31660408），新疆兵團現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化項目（2016AC017）

安晶（1991-），女，碩士研究生，專業(yè)方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)，e-mail：605805134@qq.com。

*通信作者：李鴻彬（1980-），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事植物分子生物學(xué)與基因工程研究，e-mail：lihb@shzu.edu.cn。