李洪艷，趙 剛

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

雞新城疫滅活疫苗免疫佐劑的研究

李洪艷，趙 剛

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

佐劑與抗原混合后注射動(dòng)物體內(nèi)，能非特異性改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮其輔佐作用。凡是可以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)均可稱(chēng)為佐劑。目前新城疫滅活疫苗的佐劑免疫增強(qiáng)效果不理想，亟待開(kāi)發(fā)一種適用于雞新城疫滅活疫苗的免疫佐劑。試驗(yàn)對(duì)雞新城疫滅活疫苗免疫佐劑進(jìn)行研究，結(jié)果表明，佐劑溶液中含有左旋咪唑2～10 mg·mL-1的用量配比效果最優(yōu)，且用此佐劑制成的雞新城疫滅活疫苗，疫苗免疫效果明顯提高。

免疫佐劑；雞新城疫滅活疫苗；制備

免疫佐劑其功能是與抗原混合后注射于動(dòng)物體內(nèi)，能非特異性改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮其輔佐作用。佐劑的種類(lèi)非常多，常規(guī)佐劑包括鋁鹽類(lèi)、油乳劑、蜂膠佐劑。最常見(jiàn)的佐劑為油類(lèi)佐劑，這類(lèi)佐劑通常具有良好的免疫增強(qiáng)作用。但是，目前新城疫滅活疫苗的佐劑免疫增強(qiáng)效果不理想，亟待開(kāi)發(fā)一種適用于雞新城疫滅活疫苗的免疫佐劑[1-5]。本文對(duì)雞新城疫滅活疫苗免疫佐劑進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為制備高效的雞新城滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與動(dòng)物

新城疫病毒La Sota株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，HA效價(jià)為28，-20℃保存?zhèn)溆?；鹽酸左旋咪唑注射液，白油佐劑購(gòu)自美國(guó)索諾邦公司；30日齡SPF雞，整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程均在公司生產(chǎn)的隔離器中進(jìn)行，飼料經(jīng)高壓滅菌，水為酸化水。采血用試驗(yàn)雞為成年SPF公雞。

2 試驗(yàn)方法

2.1 佐劑的制備

高濃度母液的配制：用市售的左旋咪唑含量為50 mg·mL-1的獸用鹽酸左旋咪唑注射液作為左旋咪唑母液，將其過(guò)濾除菌后備用。配制低濃度佐劑溶液：取50 mg·mL-1的左旋咪唑母液4 mL與白油佐劑96 mL混合均勻，即為每mL溶液中含有左旋咪唑?yàn)? mg的疫苗佐劑。

2.2 佐劑組分篩選試驗(yàn)

A組左旋咪唑與弗氏佐劑；B組左旋咪唑與皂苷；C組左旋咪唑與白油；D組白油與卡波姆（樹(shù)脂）；E組白油與黃芪多糖。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，C組（即左旋咪唑與白油組成的佐劑）的效果最好，表明這兩種成分有協(xié)同增效作用。

表1 不同佐劑接種后動(dòng)物的臨床反應(yīng)

表2 免疫后HI效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

2.3 雞新城疫滅活疫苗的制備

2.3.1 新城疫病毒在雞胚上增殖

將新城疫病毒La Sota株用滅菌生理鹽水分別各作10～5倍稀釋?zhuān)鹘臃N9～10日齡SPF胚10枚，0.1 mL·枚-1，接種后密封針孔，置于37℃繼續(xù)孵育，不必翻蛋，每天照胚2～3次。將在48 h前死亡的雞胚棄去，48 h后，每4～8 h照胚1次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至120 h，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2～8℃冷卻。將冷卻4～24 h的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無(wú)菌手術(shù)去除擬定部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛屑囊膜及羊膜，收集48～120 h死亡和120 h后的活胚的尿囊液，單胚單收，并分別測(cè)定每胚的HA效價(jià)及混合后原液的EID50。

2.3.2 新城疫滅活疫苗的制備

將滅活并檢驗(yàn)合格的雞胚尿囊液混于同一容器內(nèi)，先加入5%體積的吐溫-80，充分搖勻，至吐溫-80完全融解；再按l∶1.5體積分別加入本試驗(yàn)實(shí)施例1至3制備的佐劑或者加入白油佐劑，充分乳化后，取1支潔凈吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，不擴(kuò)散，判為合格。充分搖勻后，定量分裝，置2～8℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 新城疫滅活疫苗安全性試驗(yàn)

用10～14日齡SPF雞10只，頸部皮下接種新城疫滅活疫苗1.0 mL，觀察14 d，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部或全身反應(yīng)。

2.4 動(dòng)物免疫效果試驗(yàn)

為了排除免疫抗原量對(duì)免疫效果的影響，將經(jīng)SPF雞胚擴(kuò)增的病毒液與含不同濃度左旋咪唑的白油佐劑，分別制備成油乳劑滅活苗，各組免疫相同劑量0.02 mL·只-1，免疫方式為頸部皮下注射，觀察免疫及保護(hù)效果。

試驗(yàn)動(dòng)物分組：A-表示胚毒與實(shí)施例1制備的每mL溶液中含2 mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；B-表示胚毒與實(shí)施例2制備的每mL溶液中含5 mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；C-表示胚毒與實(shí)施例3制備的每mL溶液中含10 mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；D-表示胚毒與不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；NC-空白對(duì)照組。每組10只SPF雞，同時(shí)留5只不免疫作為對(duì)照組。免疫前采血，HI抗體檢測(cè)均為陰性。分別在免疫后第7、14、21天翅下靜脈采血，分離血清，用HI方法測(cè)定血清抗體效價(jià)。

2.4.1 免疫雞淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

試驗(yàn)期間每周每組隨機(jī)剖殺2只雞，取脾做淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，以特異性全病毒蛋白刺激脾淋巴細(xì)胞，觀察淋巴細(xì)胞增殖情況。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)參照淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

雞脾淋巴細(xì)胞的制備：取SPF雞靜脈注射空氣處死后，放入70%酒精中浸泡5 min；之后無(wú)菌手術(shù)開(kāi)腹，取出脾臟，放于加有不完全RPMI-1640培養(yǎng)基的平皿中；將脾臟剪碎放在銅網(wǎng)上，用注射器針芯擠壓研磨脾臟；取出銅網(wǎng)，反復(fù)吹吸幾次后，將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30 mL，混勻，1 500 r·min-1、4℃離心6 min，棄上清；然后向細(xì)胞沉淀中加入10 mL紅細(xì)胞裂解液，重懸，37℃裂解5 min后，1 500 r·min-1、4℃離心6 min，棄上清；細(xì)胞沉淀用10 mL含3%血清的Hank's液洗滌2次；用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將制備好的脾淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整至2×106個(gè)·mL-1后，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL。每只雞脾淋巴細(xì)胞分別設(shè)9孔，其中3孔加入20 μL純化的新城疫病毒作為特異性刺激抗原作為試驗(yàn)孔，終濃度為5 μg·mL-1；3孔不加入任何刺激抗原作為細(xì)胞增殖的本底對(duì)照，3孔加入終濃度為20 μg·mL-1的刀豆球蛋白A（ConA）作為陽(yáng)性對(duì)照；37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60 h；加入10 μL的CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度，計(jì)算刺激指數(shù)。

刺激指數(shù)（SI）=試驗(yàn)組OD均值/相應(yīng)本底OD均值。

2.4.2 雞γ干擾素檢測(cè)

取制備好的脾淋巴細(xì)胞懸液加至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3 mL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d后移取細(xì)胞懸液，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，4℃暫存?zhèn)溆?。采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)雞γ干擾素（IFN-γ），具體操作按雞IFN-γELISA檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。向預(yù)先包被IFN-γ抗體的包被微孔中依次加入樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌后用底物TMB顯色。顏色的深淺和樣品中的IFN-γ呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度。

IFN-γ檢測(cè)操作步驟：從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔、空白孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔各加濃度為0、5、10、20、40、80 pg · mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL（樣品最終稀釋度為5倍），空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封板后置37℃恒溫箱溫育60 min；小心揭掉封板膜，棄去液體，吸水紙上甩干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上甩干，如此重復(fù)洗板5次；每孔先加入底物A 50 μL，再加入底物B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光孵育15 min；每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度；在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD450nm值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式；將樣品的OD450nm值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5），即為樣品的實(shí)際濃度。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 新城疫病毒的效價(jià)測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，新城疫病毒EID50為108.3/0.1 mL＞108.0/0.1 mL，HA為29，符合制苗要求。

3.2 免疫效果檢測(cè)

不同試驗(yàn)組在免疫后不同時(shí)間的抗體水平見(jiàn)表3。

疫苗免疫后，雞群外觀、食欲均正常，無(wú)不良反應(yīng)，接種部位無(wú)紅腫現(xiàn)象，吸收效果良好，表明含左旋咪唑的雞新城疫滅活疫苗對(duì)雞只安全。血清抗體效價(jià)結(jié)果表明，添加不同濃度左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的HI抗體平均水平均明顯高于不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組和空白對(duì)照組。

表3 不同試驗(yàn)組在免疫后不同時(shí)間的抗體水平

3.3 免疫雞淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4結(jié)果可知，添加不同濃度左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的淋巴細(xì)胞數(shù)均高于不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組和空白對(duì)照組；含5或10 mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05）。表明左旋咪唑可促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞增殖，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫。

表4 雞免疫后脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

3.4 干擾素檢測(cè)

IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式為：y=0.0156x R2=0.9885。換算出不同ND疫苗免疫后各組脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 免疫后各組脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量 pg ·mL-1

表5結(jié)果表明，含左旋咪唑5或10 mg的白油佐劑制備疫苗免疫組的脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量均明顯高于其它免疫組；含左旋咪唑10 mg的白油佐劑制備疫苗免疫組的脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量最高。表明左旋咪唑可增強(qiáng)雞新城疫滅活疫苗的免疫功能，延長(zhǎng)疫苗免疫保護(hù)期。

4 結(jié)論

將左旋咪唑與白油佐劑按照不同用量配比制成的佐劑，通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，只有佐劑溶液中含有左旋咪唑2～10 mg·mL-1的用量配比效果最優(yōu)，且用此佐劑制成的雞新城疫滅活疫苗，疫苗免疫效果明顯提高，為制備高效的雞新城滅活疫苗奠定了基礎(chǔ)。

[1] 梁華麗,華炯鋼,徐輝,等.幾種雞新城疫油佐劑滅活疫苗免疫效果的比較[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,19（6）:418-422.

[2] 曹繪,李寶臣,李漫,等.雞新城疫和禽流感（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗不同佐劑的免疫效果試驗(yàn)[J].浙江畜牧獸醫(yī),2015（6）:1-3.

[3] 張興曉,劉美麗,楊靈芝,等.類(lèi)脂作為佐劑對(duì)新城疫滅活疫苗免疫效果的影響[J].中國(guó)家禽,2007,29（17）:11-13.

[4] 王學(xué)斌,張志民,任向陽(yáng),等.黃芪多糖油乳佐劑新城疫滅活苗對(duì)雞免疫功能的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2007（4）:103-105.

[5] 柴家前,龐昕,劉金華,等.雞新城疫納米蜂膠滅活疫苗免疫作用機(jī)理[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,30（9）:1 151-1 155.

Study on Immune Adjuvant Inactivated Newcastle Disease Vaccine

LI Hongyan,ZHAO Gang
（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

Adjuvant mixed with antigens after injection in the animal,can enhance the body or non-specific changes of specific immune response to the antigen,play its supporting role.Any substance that enhances the antigenspecific immune response can be called an adjuvant.However,current adjuvant Newcastle disease inactivated vac?cine enhancement effect is not ideal,the need to develop a suitable Newcastle disease inactivated vaccine adjuvant.The paper studied the immune adjuvant of chicken Newcastle disease inactivated vaccine,the result showed that the best content of levamisole in a adjuvant solution was 2～10 mg· mL-1.Newcastle disease inactivated vaccine which was made with this adjuvant could increase vaccine immunization effect obviously.

adjuvant;newcastle disease inactivated vaccine;preparation

S831；S852.65+9.5

A

1001-0084（2017）08-0039-04

2017-06-03

李洪艷（1978-），女，遼寧建平人，獸醫(yī)師，主要從事于疫苗生產(chǎn)。