李堯鋒 彭 芳 陳向云 朱 璨 楊長福 田紫平 熊仕芳 張永萍*

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州益佰制藥股份有限公司，貴州 貴陽 550008

實驗研究

理氣活血滴丸對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)和抗氧化性的影響

李堯鋒1彭 芳1陳向云1朱 璨1楊長福1田紫平2熊仕芳2張永萍1*

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州益佰制藥股份有限公司，貴州 貴陽 550008

目的：研究理氣活血滴丸對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織的保護(hù)作用。方法：SD大鼠隨機分為假手術(shù)組，心肌缺血再灌注損傷模型組，陽性對照組和理氣活血滴丸低、中、高劑量組，陽性對照組大鼠給予辛伐他汀，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等量的生理鹽水。灌胃給藥10d后，采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法復(fù)制心肌缺血再灌注損傷大鼠模型。記錄大鼠心電圖ST段變化，TTC染色法檢測心肌梗死范圍，生化檢測心肌組織SOD、CAT活性及MDA含量。結(jié)果：理氣活血滴丸能降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心電圖ST段的抬高，縮小心肌梗死范圍，升高心肌組織SOD、CAT活性，降低MDA含量，且呈劑量依賴性。結(jié)論：理氣活血滴丸對心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌組織具有保護(hù)作用。

理氣活血滴丸；大鼠；心肌缺血再灌注損傷；抗氧化

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial Ischemia-reperfusion Injury，MIRI)是長時間缺血心肌組織在血液復(fù)灌后，出現(xiàn)比缺血前更為嚴(yán)重的功能性損傷，是心肌缺血患者冠脈暢通后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。目前，藥物性預(yù)適應(yīng)是防護(hù)缺血再灌注心肌損傷的便捷手段。中藥在保護(hù)心肌缺血再灌注損傷方面，具有毒副作用小、多靶點、多環(huán)節(jié)作用的優(yōu)點，近來被國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者廣泛關(guān)注[2-4]。理氣活血滴丸是根據(jù)貴州苗族民間驗方和傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論制成的中藥復(fù)方制劑，由苗藥米槁精油、川芎、薤白、艾片組成，具有溫陽寬胸，理氣活血的功效，在治療冠心病、心絞痛療效較好[5]。前期研究表明理氣活血滴丸對MIRI大鼠具有保護(hù)作用，該作用與其減少心肌細(xì)胞心肌酶漏出和抑制炎性損傷有關(guān)[6]，但其是否具有抗氧化作用尚不清楚。本研究采用結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法復(fù)制心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，再通過組織形態(tài)學(xué)方法和生化檢測抗氧化相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)一步明確理氣活血滴丸對MIRI大鼠心肌組織的保護(hù)作用。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠120只，雄性，體重(180±20)g，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0010。

1.2 藥物與試劑 理氣活血滴丸(批號：20140802，貴州益佰制藥股份有限公司)；辛伐他汀片(批號：141107，杭州默沙東制藥有限公司)；總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號：20151208)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(批號：20151214)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號：20151215)、總蛋白測定試劑盒(批號：20151102)購于南京建成生物工程研究所；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，批號：20150812)和蘇木精-伊紅(HE，批號：20151106)染色試劑盒購于北京索萊寶試劑有限公司。

1.3 儀器 BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)和HX-101E動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；石蠟切片機(德國萊卡公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將SD大鼠隨機分為6組，每組20只，分別為假手術(shù)(冠狀動脈前降支下穿線不結(jié)扎)組，心肌缺血再灌注損傷模型組，陽性對照組，理氣活血滴丸低(43.75mg/kg/d)、中(87.50mg/kg/d)、高(175.00mg/kg/d)劑量組。各組動物連續(xù)灌胃給藥7d，陽性對照組給予辛伐他汀(40mg/kg/d)，假手術(shù)組和模型組灌胃等量的生理鹽水。

2.2 造模 各組大鼠術(shù)前禁食禁水12h，末次給藥45min后，腹腔注射25%烏拉坦麻醉。將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，做氣管插管，連接小動物呼吸機(頻率80～90次/min，潮氣量2mL/100g，呼、吸比3∶2)。連接BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，記錄大鼠肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。然后開胸，剪開心包，暴露心臟，造模組用5號絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎)，以左室前壁呈紫紺或藍(lán)紫色及同步心電圖顯示QRS幅度升高，ST段抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志。缺血0.5h后松開絲線，復(fù)灌1h，建立MIRI大鼠模型[7]。

2.3 心肌組織生化指標(biāo)測定 復(fù)灌后留取心臟，用冰生理鹽水清洗干凈，稱重，加入預(yù)冷的生理鹽水，勻漿，制成10%的心肌組織勻漿液。然后采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，可見光法測定CAT活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，試驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 心肌梗死范圍測定 切取左心室，用生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干稱重。然后將其置于裝有1%TTC溶液的器皿中，37℃避光15min，染色過程中不時搖動染色液。染色后立即用蒸餾水沖洗掉多余的染液，非梗死區(qū)呈玫瑰紅色，梗死區(qū)呈白色或灰白色。小心分離梗死區(qū)與非梗死區(qū)，稱量梗死區(qū)質(zhì)量，然后計算梗死范圍占左心室的百分比。

3 結(jié)果

3.1 理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠心電圖ST段的影響 由表1可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在缺血0.5h和再灌注1h，其心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段均明顯抬高，表明建模成功。與模型組比較，理氣活血滴丸低劑量組大鼠心電圖ST段無明顯變化。與模型組比較，理氣活血滴丸中、高劑量組和陽性對照組大鼠ST段降低，且存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。

組別正常心電圖缺血0.5h心電圖再灌注1h心電圖假手術(shù)組0.101±0.0120.125±0.0160.123±0.013模型組0.099±0.0170.324±0.026**0.245±0.019**陽性對照組0.094±0.0150.257±0.014##0.141±0.012##理氣活血滴丸低劑量組0.098±0.0230.343±0.0170.240±0.030理氣活血滴丸中劑量組0.106±0.0130.297±0.040#0.167±0.021##理氣活血滴丸高劑量組0.100±0.0200.220±0.031##0.159±0.015##

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.2 理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠心肌梗死程度的影響 由表2可知，假手術(shù)組大鼠心肌組織染色后未見梗死區(qū)，模型組大鼠心肌梗死區(qū)占左心室重的百分比為35.68%。與模型組比較，理氣活血滴丸低劑量組大鼠心肌梗死程度未見明顯改善，其心肌梗死區(qū)占左心室重的百分比為32.21%，而理氣活血滴丸中、高劑量組和陽性對照組大鼠心肌梗死程度顯著改善，其心肌梗死區(qū)占左心室重的百分比分別為24.54%、22.31%和19.24%。

組別左心室/g梗死區(qū)/g梗死區(qū)/左心室/%假手術(shù)組0.707±0.05200模型組0.721±0.0530.257±0.05135.68±5.12陽性對照組0.695±0.0620.134±0.042##19.24±4.98##理氣活血滴丸低劑量組0.710±0.0700.229±0.03832.21±6.01理氣活血滴丸中劑量組0.697±0.0640.171±0.047##24.54±4.23##理氣活血滴丸高劑量組0.730±0.0720.163±0.060##22.31±4.61##

注：與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.3 理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠心肌組織SOD、CAT活性及MDA含量的影響 由表3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織SOD和CAT活性明顯降低，MDA含量明顯升高。與模型組比較，理氣活血滴丸低劑量組大鼠心肌組織SOD、CAT活性及MDA含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與模型組比較，理氣活血滴丸中、高劑量組和陽性對照組大鼠心肌組織SOD、CAT活性明顯升高，MDA含量明顯下降(P<0.05或P<0.01)。

組別SOD/U/mgprotCAT/U/mgprotMDA/nmol/mgprot假手術(shù)組288.32±12.4627.57±1.322.43±0.32模型組160.54±14.27**18.21±1.45**8.91±0.58**陽性對照組263.23±12.59##24.25±1.34##3.22±0.36##理氣活血滴丸低劑量組190.98±10.2819.58±2.017.83±0.76理氣活血滴丸中劑量組247.48±13.53##21.89±1.94#4.75±0.59##理氣活血滴丸高劑量組258.12±13.18##22.32±1.53##3.43±0.40##

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05。

4 討論

本研究選用單一性別雄性大鼠建立MIRI動物模型，一方面雄性大鼠對利用結(jié)扎左冠狀動脈前降支方法制作的MIRI動物模型耐受性較強，另一方面可排除性別差異導(dǎo)致的試驗結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差偏大，此外選用單一性別利于控制試驗，排除交配、發(fā)育等因素的干擾。

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機制比較復(fù)雜，在再灌注期最初數(shù)分鐘內(nèi)可形成一過性活性氧(ROS)升高，引起心肌細(xì)胞氧化損傷，是心肌細(xì)胞凋亡或死亡的主要原因[8-9]。哺乳動物細(xì)胞內(nèi)有抗氧化防御的酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等，若這些酶清除不了過多的ROS，這樣就對心肌細(xì)胞產(chǎn)生了損傷作用。線粒體呼吸鏈?zhǔn)荝OS的主要來源，心肌缺血后再灌注期線粒體產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致線粒體膜可通透性轉(zhuǎn)運孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)開放[10-11]。mPTP的開放導(dǎo)致線粒體水腫脹破，釋放細(xì)胞色素C等凋亡蛋白。細(xì)胞色素C是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的重要載體，細(xì)胞色素C的缺失，一方面影響細(xì)胞能量代謝，另一方面激活Caspase家族，進(jìn)而誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡[12]。因此，防止細(xì)胞內(nèi)ROS過度增長或增強線粒體mPTP的穩(wěn)定性，是保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的一種重要策略。SOD和CAT是機體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化相關(guān)酶類，其活性的高低直接反應(yīng)機體的抗氧化能力[13]。另外，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA是衡量體內(nèi)抗氧化情況的重要檢測指標(biāo)之一[14]。實驗結(jié)果顯示理氣活血滴丸能顯著升高再灌注期大鼠心肌細(xì)胞SOD和CAT活性，降低MDA含量，說明理氣活血滴丸可清除再灌注期過多的活性氧，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，防護(hù)再灌注期心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

研究也發(fā)現(xiàn)理氣活血滴丸預(yù)處理能有效降低MIRI大鼠心電圖ST段的抬高。在組織形態(tài)學(xué)方面，理氣活血滴丸能顯著減小MIRI大鼠心肌梗死范圍，改善再灌注期心肌細(xì)胞的損傷，且呈劑量依賴性。因此，理氣活血滴丸對MIRI大鼠心肌組織的保護(hù)作用與其抗氧化性有關(guān)，另外我們以往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)理氣活血滴丸對MIRI大鼠的保護(hù)作用也與其抑制炎性損傷有關(guān)[6]，推測理氣活血滴丸對MIRI大鼠心肌組織具有多靶點保護(hù)作用。

綜上，理氣活血滴丸對MIRI大鼠心肌組織具有明顯的保護(hù)作用，并提示該保護(hù)機制與其抑制炎性損傷和抗氧化性有關(guān)，但其具體作用的分子機制有待進(jìn)一步研究。

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Influence of Liqihuoxue Dropping pills of Myocardial Morphology and Antioxidation in Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

LI Yaofeng1PENG Fang1CHEN Xiangyun1ZHU Can1YANG Changfu1TIAN Ziping2XIONG Shifang2ZHANG Yongping1*

1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550025,China;2.Guizhou Yibai Pharmaceutical Co.Ltd.,Guiyang 550008,China

Objective To observe the protective effect of Liqihuoxue Dropping pills on myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) in rats. Methods SD rats randomized into the sham group, the MIRI model group, the positive control group and the Liqihuoxue Dropping pills low, medium and high dose groups. Rats in the positive control group were given Simvastatin, rats in sham operation group and model group were given the same amount of saline. Rats were administrated for ten days, and the rats were molded MIRI by closing the left anterior descending coronary artery after the last administration. ST segment changes of rats were recorded. The myocardial infarction range was detected by TTC staining. SOD, CAT activity and MDA content in cardiac tissue were determined by biochemistry method. Results Results showed that the Liqihuoxue Dropping pills could decrease the elevation of ST segment of electrocardiogram in rats with myocardial ischemia reperfusion injury, reduced myocardial infarct size, elevated SOD and CAT activity and decreased MDA content in cardiac tissue, which showed dose-dependent manner. Conclusion It has a protective effect of Liqi Huoxue Dripping pills on myocardial tissue in rats with myocardial ischemia reperfusion injury.

Liqihuoxue Dropping pills; Rat; Myocardial Ischemia-reperfusion Injury; Antioxidation

貴州省科技計劃項目(黔科合基礎(chǔ)[2016]1401)；貴州省教育廳青年科技人才成長項目(黔教合KY字[2016]186)；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(QZYY-2016-015)。

李堯鋒(1987-)，男，講師，博士，研究方向為中藥心血管藥理研究。E-mail：lyfengcxy2010@163.com

張永萍(1964-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥、民族藥新制劑與新劑型開發(fā)。E-mail：zgygpg@sohu.com

R285

A

1007-8517(2017)15-0054-04

2017-05-24 編輯：梁志慶)