喬宏興，史洪濤，王永芬，姜亞樂，邊傳周

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.鄭州市益生菌發(fā)酵中藥重點實驗室，河南 鄭州 450046；3.河南省益生菌生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046； 4.河南省洛陽市孟津縣畜牧局，河南 洛陽 471100)

乳酸菌對苜蓿草粉發(fā)酵品質(zhì)的影響

喬宏興1,2,3，史洪濤1,2,3，王永芬1，姜亞樂4，邊傳周1,2,3

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.鄭州市益生菌發(fā)酵中藥重點實驗室，河南 鄭州 450046；3.河南省益生菌生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046； 4.河南省洛陽市孟津縣畜牧局，河南 洛陽 471100)

通過為期60 d的發(fā)酵，探討添加乳酸菌對苜蓿(Medicagosativa)草粉發(fā)酵品質(zhì)的影響。試驗設(shè)4個處理，分別為添加無菌水(對照)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium，EF)和植物乳桿菌+屎腸球菌(LP+EF)發(fā)酵苜蓿草粉，設(shè)5個時間點采樣進行相關(guān)項目測定。結(jié)果表明，與對照組相比，發(fā)酵60 d時各試驗組發(fā)酵苜蓿草粉的評分提高，總酸含量顯著升高(P<0.05)，pH顯著降低；LP、LP+EF和對照組的干物質(zhì)含量明顯低于EF組；各試驗組酸性洗滌纖維含量明顯低于對照組；有氧暴露7 d后，各試驗組的pH均顯著低于對照組、總酸含量均顯著高于對照組(P<0.05)，且只有對照組中檢測到酵母菌(Saccharomycetes)和霉菌(Mycete)。綜上可知，添加乳酸菌對苜蓿草粉的發(fā)酵品質(zhì)、穩(wěn)定性及營養(yǎng)組成具有良好的改善作用。

植物乳桿菌；屎腸球菌；苜蓿；發(fā)酵；發(fā)酵品質(zhì)；有氧穩(wěn)定性；成分分析

紫花苜蓿(Medicagosativa)營養(yǎng)豐富、適口性好，對多種動物的生長、繁殖性能以及腸道微生物菌群的改善具有促進作用，是一種優(yōu)質(zhì)的飼料原料[1]，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，故有“飼料皇后”和“牧草之王”的美稱[2-3]。利用現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)，在苜蓿發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量的菌體以及酶、有機酸、維生素和細菌素等有益代謝產(chǎn)物，使苜蓿的營養(yǎng)更全面并具備新的功能，如調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高飼料利用率和機體免疫力等，使其在動物生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用價值大幅提升[4-5]。目前，關(guān)于苜蓿的研究主要集中在提高青貯品質(zhì)方面，利用乳酸菌發(fā)酵苜蓿干草粉及對發(fā)酵品質(zhì)影響的研究較少。本研究利用乳酸菌對苜蓿草粉進行生物發(fā)酵，探討發(fā)酵產(chǎn)物中的營養(yǎng)成分、乳酸菌及其代謝產(chǎn)物的變化，為提高苜蓿草粉的品質(zhì)以及生物飼料添加劑的研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 MRS肉湯、MRS瓊脂和馬鈴薯培養(yǎng)基均購于北京澳博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 發(fā)酵菌種 發(fā)酵菌種為植物乳桿菌、屎腸球菌(由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院鄭州市益生菌發(fā)酵中藥重點實驗室提供)，菌種所含活菌數(shù)均為1×108cfu·mL-1。

1.1.3 發(fā)酵原料 新鮮的苜蓿(取自新密市苜蓿草生產(chǎn)基地)，現(xiàn)蕾期刈割，用鍘草機鍘成約2 cm的小段，適當(dāng)晾曬后置于60 ℃烘箱中烘24 h。將苜蓿干草(莖葉比約為2∶1)粉碎使其粒徑約為0.613 mm，密封保存?zhèn)溆?。苜蓿草粉的成分：干物質(zhì)(DM)含量94.32%，酸性洗滌纖維(ADF)含量33.46%，中性洗滌纖維(NDF)含量36.98%，總酸含量12.58 g·kg-1，含水量約8%。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)置4個處理，分別為添加無菌水(對照)、植物乳桿菌(LP)、屎腸球菌(EF)和植物乳桿菌+屎腸球菌(LP+EF) (混合比例為1︰1)發(fā)酵苜蓿草粉。準(zhǔn)確稱量330 g 苜蓿草粉、發(fā)酵菌種和無菌水，草粉、菌種、無菌水的質(zhì)量比為6∶1∶2，各處理混合均勻后，裝進發(fā)酵袋密封，每袋500 g，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)。分別在發(fā)酵3、7、15、30和60 d時采集樣品，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每個時間點各處理設(shè)3個重復(fù)，共采集60份樣品。

發(fā)酵完成后(60 d)分別取各處理200 g樣品，各處理組分別裝入3個已滅菌的500 mL燒瓶中，敞口放置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，分別于暴露的第3天和第7天測定樣品中微生物和有機酸的含量，每個處理3個重復(fù)。

1.3 項目測定

1.3.1 苜蓿發(fā)酵后的感官評定 發(fā)酵60 d后打開發(fā)酵袋，對各處理樣品進行感官評定，參照德國農(nóng)業(yè)協(xié)會(Deutche Landwirtschafts Geseutschaft,DLG)對青貯品質(zhì)感官評分標(biāo)準(zhǔn)進行評定，分別從氣味、質(zhì)地和色澤3個方面進行等級評定[6]。氣味分5級，對應(yīng)為0～14分；質(zhì)地分4級，對應(yīng)為0～4分；色澤分3級，對應(yīng)為0～2分。然后綜合3項得分給出評分結(jié)果：Ⅰ,優(yōu)良(16～20分);Ⅱ，尚好(15～15分);Ⅲ，中等(5～9分);Ⅳ，腐敗(0～4分)4個等級(表1)。

1.3.2 活菌數(shù)的測定 乳酸菌檢測按照GB 4789.35-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)檢測[7]，霉菌和酵母菌檢測按照GB 4789.15-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)所提供的方法進行測定[8]。

1.3.3 pH的測定 準(zhǔn)確稱取25 g發(fā)酵樣品，加入225 mL生理鹽水，浸泡30 min，用攪拌機勻質(zhì)30 s，先后用4層紗布和定量濾紙過濾，用酸度計測定濾液pH[9]。

1.3.4 發(fā)酵樣品成分測定 水分測定參考GB/T 6435-2014 飼料中水分的測定方法標(biāo)準(zhǔn)[10]；Crude protein(CP)測定參考GB/T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法標(biāo)準(zhǔn)[11]；Neutral detergent fiber(NDF)參考GB/T 20806-2006 飼料中中性洗滌纖維的測定方法進行測定[12]；Acid detergent fiber(ADF)按照NY/T 1459-2007 飼料中酸性洗滌纖維的測定方法進行測定[13]；總酸按照GB/T 12456-2008 食品中對應(yīng)總酸的測定方法進行測定[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，試驗結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值表示，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 苜蓿發(fā)酵后的感官評定

各處理在色澤方面均為黃綠色，2分；質(zhì)地方面也無明顯差異，未出現(xiàn)霉變、粘手現(xiàn)象，4分；氣味方面，對照組樣品具有丁酸臭味，酸香氣味較淡，8分，其它處理組酸香氣味較濃評分為14分。綜合評分結(jié)果，除對照組感官評分為2級尚好以外，其它處理組苜蓿草粉發(fā)酵后的感官評分均為1級優(yōu)良。

2.2 苜蓿草粉發(fā)酵過程中微生物、pH和總酸含量的動態(tài)變化

各處理組發(fā)酵樣品在各取樣時間點均無霉菌、酵母菌生長，而對照組在3、7、15 d時均檢測到酵母菌(表3)。發(fā)酵3 d時，對照組乳酸菌數(shù)量(0.20×108cfu·g-1)顯著低于其它各處理組(P<0.05)，植物乳桿菌處理的數(shù)量最多，為15.37×108cfu·g-1；發(fā)酵7 d時，對照組乳酸菌數(shù)量為6.13×108cfu·g-1，仍顯著低于同時間點的其它處理組；發(fā)酵30和60 d時，對照和各處理組均未檢測到乳酸菌。

對照組和其它處理組的pH均隨發(fā)酵時間的延長而明顯變小(表3)。且各處理時間點處理組的pH均顯著低于對照組(P<0.05)。15 d以后各處理組的pH基本穩(wěn)定，各處理組間差異不顯著(P>0.05)。

表1 青貯苜蓿感官評定綜合評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The composite sensory assessment scores of Medicago sativa stalk silage samples

表2 苜蓿草粉發(fā)酵60 d后的感官評定結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of fermented alfalfa meal samples

注：CK，無菌水(對照組)；LP，植物乳桿菌組；EF，屎腸球菌組；LP+EF，植物乳桿菌+屎腸球菌。下同。

Note: CK, sterile water (control group); LP, plant-derivedLactobacillus; EF, excrement-derivedEnterococcus; LP + EF, plant-derivedLactobacillusand excrement-derivedEnterococcus; similarly for the following tables.

表3 發(fā)酵產(chǎn)物中微生物及總酸的含量測定結(jié)果Table 3 Results of microbe counts and total acid production

注：同列不同小寫字母表示同一時間不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters for the same time within the same column indicate significant differences among the experimental groups at the 0.05 level; similarly for the following tables.

在各處理時間點，對照組的總酸含量均顯著低于其它處理組的(P<0.05)，發(fā)酵15 d以后各處理組間的總酸含量基本穩(wěn)定，各處理組間差異不顯著(P>0.05)。表明，接種乳酸菌發(fā)酵苜蓿草，發(fā)酵物的pH能快速降到4.2以下并有較高的有機酸積累，同時對酵母和霉菌有很好的抑制作用，有利于提高苜蓿草粉的發(fā)酵品質(zhì)。

2.3 發(fā)酵苜蓿的成分分析

隨著發(fā)酵時間的延長，各組DM含量呈升高趨勢，NDF和ADF含量呈降低趨勢，CP含量較為平穩(wěn)(表4)。發(fā)酵7和15 d時，LP+EF組DM含量顯著高于其它各處理組(P<0.05)；發(fā)酵60 d時，與原料組相比，對照組、LP、EF、LP+EF組DM含量分別提高了1.67%、3.51%、4.74%和3.40%(P<0.05)。

7和15 d各時間點各處理組CP含量差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵60 d時，原料組CP含量(19.93%)顯著低于各處理組CP含量(P<0.05)，各試驗組之間CP含量差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵7和15 d時，各處組NDF含量差異顯著(P<0.05)；發(fā)酵60 d時，原料組ADF含量(34.46%)顯著高于其它各處理組(P<0.05)。

2.4 發(fā)酵苜蓿在有氧暴露過程中微生物、pH和總酸含量的動態(tài)變化

將發(fā)酵60 d的苜蓿暴露3和7 d時，對照組和處理組中均未檢測到乳酸菌(表5)，只在對照組中檢測到酵母菌和霉菌。發(fā)酵3 d時，對照組中酵母菌和霉菌數(shù)量分別為1.56×104和4.32×104cfu·g-1；發(fā)酵7 d時，對照組中酵母菌和霉菌數(shù)量分別為2.05×104、10.5×105cfu·g-1。

暴露3和7 d時，對照組pH分別為4.93、5.32，均顯著高于其它處理組(P<0.05)；總酸含量方面，暴露3和7 d時，對照組總酸含量分別為14.05、11.52 g·kg-1，均明顯低于其它處理組(P<0.05)(表5)。

表5 暴露發(fā)酵苜蓿草粉中微生物及有機酸的含量測定結(jié)果Table 5 Results of microbe counts and total acid production in alfalfa meal samples fermented under exposure to air

3 討論

3.1 乳酸菌對苜蓿發(fā)酵品質(zhì)的影響

乳酸菌是一類常用的發(fā)酵添加劑，在牧草青貯、飼料原料和中藥發(fā)酵等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。大量研究表明[15-16]，添加乳酸菌能夠提高青貯飼料中乳酸含量、降低pH，減少干物質(zhì)和蛋白質(zhì)等的損失，同時乳酸菌在生長繁殖過程中能產(chǎn)生多種酶、維生素和乳酸菌素等有益代謝產(chǎn)物，從而獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料。本研究利用乳酸菌發(fā)酵苜蓿干草粉，各處理組評分結(jié)果均為1級，對照組為2級，表明添加乳酸菌能提高苜蓿干草粉的發(fā)酵品質(zhì)。原因可能是接種的乳酸菌在短時間內(nèi)大量生長繁殖形成優(yōu)勢菌群，產(chǎn)生的乳酸使底物pH迅速下降，能夠抑制丁酸菌、大腸桿菌和酵母菌等有害菌的生長，不良發(fā)酵危害減小。對照組在試驗結(jié)束時，pH尚未達到常規(guī)青貯品質(zhì)評定中低于4.2的標(biāo)準(zhǔn)，其它處理組在發(fā)酵7 d時，pH均在4.2左右；總酸含量在發(fā)酵15 d時趨于穩(wěn)定，對照組總酸含量顯著低于其它處理組。

3.2 乳酸菌發(fā)酵對苜蓿營養(yǎng)成分的影響

優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵飼料不僅要求其較高的發(fā)酵品質(zhì)，同時發(fā)酵后也要具備較高的營養(yǎng)價值，以滿足畜禽的營養(yǎng)需求。苜蓿干草因其較高的蛋白含量和消化吸收率，使其成為高產(chǎn)奶牛的優(yōu)質(zhì)飼料，但在青貯或干草發(fā)酵過程中，其自身蛋白酶能使蛋白分解為游離氨基酸和氨態(tài)氮等非蛋白氮，造成嚴重的蛋白損失并降低總氮利用率[17]。NDF和ADF含量是反映纖維品質(zhì)好壞的最有效的指標(biāo)，ADF含量與動物的消化率呈負相關(guān)，因此通過檢測發(fā)酵前后NDF和ADF的含量，對發(fā)酵苜蓿草營養(yǎng)價值的評定具有重要的參考價值[18]。本研究通過接種乳酸菌發(fā)酵苜蓿，發(fā)酵完成后LP、EF、LP+EF組與對照組相比，CP、NDF含量差異不顯著，ADF明顯低于對照組，但各處理之間ADF含量差異不顯著。與原料相比，除NDF含量差異不顯著外，各組其它指標(biāo)均明顯優(yōu)于原料。原因可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸導(dǎo)致pH降低，蛋白酶的活性及有害微生物的不良發(fā)酵作用受到抑制，使發(fā)酵品質(zhì)得到提高。

3.3 有氧暴露對發(fā)酵產(chǎn)物中微生物、pH和總酸含量動態(tài)變化的影響

相關(guān)研究表明，有氧暴露時pH的變化能直觀地反映出青貯飼料的腐敗速度和程度[19]，而未解離的短鏈脂肪酸進入微生物細胞并釋放H+，通過降低細胞內(nèi)部的pH抑制酵母和霉菌等真菌的生長[20]。對照組暴露7 d后，pH顯著升高至5.32，總酸含量降低了約20%；其它處理組pH在有氧暴露階段上升緩慢且均保持在4.2以下，總酸含量略有下降。在暴露3和7 d時，對照組中均檢測到酵母和霉菌的存在，并且數(shù)量呈上升趨勢，其它處理組在有氧暴露階段均未檢測到，這可能是因為較高有機酸的含量和低pH對酵母和霉菌的生長有抑制作用的緣故。本研究表明，在有氧暴露階段，與對照組相比，乳酸菌的處理組pH較低、總酸含量較高，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)物的有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

在苜蓿中添加植物乳桿菌、屎腸球菌以及二者的復(fù)合菌液，均能改善苜蓿草粉的品質(zhì)和營養(yǎng)成分組成，增加總酸含量，降低發(fā)酵產(chǎn)物pH，增強其氧穩(wěn)定性。綜上所述，單一和復(fù)合乳酸菌處理均有益于苜蓿草粉的開發(fā)和利用。

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(責(zé)任編輯 茍燕妮)

Effects of lactic acid bacteria on fermentation quality of alfalfa meal

Qiao Hong-xing1,2,3, Shi Hong-tao1,2,3, Wang Yong-fen1,Jiang Ya-le4, Bian Chuan-zhou1,2,3

(1.College of Bioengineering, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China；2.Key Laboratory of Probiotics Fermentation Traditional Chinese Medicine of Zhengzhou City, Zhengzhou 450046, China；3.Probiotics Bioconversion Engineering Technology Research Center of Henan Province, Zhengzhou 450046, China；4.Mengjin Animal Husbandry Bureau of Luoyang City, Luoyang 471100, China)

This study aimed to investigate the effects of lactic acid bacteria on the fermentation quality of alfalfa meal. There were four treatment groups, including a control group treated with sterile water and experimental groups treated with plant-derivedLactobacillusplantarumonly, excrement-derivedEnterococcusfaeciumonly, or both of them together. Alfalfa meal samples were obtained and analysed at several time points. Each group had three replicate samples at each time point. The results showed that, compared with the control group, each treatment group had a good sensory assessment score, and all treatment groups showed an increase in total acid content (P<0.05) and a decrease in the pH of the alfalfa silage after 60 d. The dry matter content was higher in the group treated only withE.faeciumthan in the other groups. There were no significant differences in acid detergent fibre content among the three experimental groups (P>0.05), but all the experimental groups had a lower acid detergent fibre content than the control group. After exposing the samples to air for 7 d, we found that the pH were significantly lower in the experimental groups than in the control group, whereas the opposite pattern was observed for total acid content. Yeast and mould were only observed in the control group. In conclusion, fermentation of alfalfa meal withL.plantarumorE.faeciumhad positive effects on its quality, stability, and chemical composition.

Lactobacillusplantarum;Enterococcusfaecium;Medicagosativa; fermentation; fermentation quality; aerobic stability; component analysis

Bian Chuan-zhou E-mail:chuanzhou-bian@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0477

2016-09-13 接受日期：2017-03-24

河南省自然科學(xué)基金項目(162300410128)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃項目(2014GGJS-124)；河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院科技創(chuàng)新團隊項目(HUAHE2005001)

喬宏興(1976-)，河南新鄉(xiāng)人，副教授，碩士，研究方向為益生菌發(fā)酵中藥。E-mail:zzmzqhx@163.com

邊傳周(1966-)，河南商丘人，教授，碩士，研究方向為益生菌發(fā)酵中藥。E-mail:chuanzhou-bian@126.com

S541+.1;S816.6;Q939.11+7

A

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后生物生產(chǎn)層