楊丹 包燚 陳麗梅 崔秀明

[摘要]在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）技術(shù)，從三七主根中分離到三七病程相關(guān)蛋白10 （pathogensis related protein 10，PR10）基因，命名為PnPR102，測序結(jié)果表明該序列長465 bp，編碼154個氨基酸。氨基酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，PnPR102與人參的PR102蛋白同源性最高，具有典型的病程相關(guān)蛋白Bet v I 保守結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建了重組載體pET32a（+）PnPR102，在宿主菌Escherichia coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，優(yōu)化誘導(dǎo)條件，PnPR102融合蛋白在E coli BL21中以可溶性和包涵體蛋白2種形式大量表達(dá)。純化上清中的重組蛋白，運(yùn)用紙片法分析純化重組蛋白的體外抑菌活性，其對三七根腐病病菌腐皮鐮刀菌Fusarium solani和壞損柱孢菌Cylindrocarpon destructans具有一定的抑制作用，猜測該基因可能參與了三七抗根腐病的防御反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]三七； 根腐??； 病程相關(guān)蛋白； 原核表達(dá)

Molecular cloning， bacterial expression analysis and functional

characterization of pathogenesisrelated PR102 gene in Panax notoginseng

YANG Dan1， BAO Yi1， CHEN Limei1， CUI Xiuming1，2， LI Kunzhi1*

（1Faculty of Life Science and Technology， Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China；

2 Key Laboratory of sustainable utilization of Panax notoginseng Resources of Yunnan Province， Kunming 650500， China）

[Abstract]Base on the transcriptome analysis and RTPCR techniques，a pathogenesisrelated protein 10 gene was isolated from Panax notoginseng root and named as PnPR102 Bioinformatics and phylogenetic trees analysis revealed that open reading frame （ORF） of PnPR102 was 465 bp in length，encoding 154 amino acids，containing one typical conserved domain of pathogenesis related protein Bet v I family， and showed high similarity with that from P ginseng The recombinant expressed plasmid pET32a（+）PnPR102 was expressed in Escherichia coli BL21 The expression conditions were optimized and it could be expressed well in soluble and inclusion body protein Purified PnPR102 recombinant protein from the supernatant of cells was used to analysis the pathogen resistance activity by paper method The purified recombinant protein could inhibit typical root rot disease pathogen （Fusarium solani and Cylindrocarpon destructans）growth evidently， we conjecture that PnPR102 may participated in defense response of P notoginseng resistance to root rot disease pathogen

[Key words]Panax notoginseng； root rot disease； pathogenesisrelated protein； prokaryotic expression

受到致病菌的侵染后，植物中的一系列基因響應(yīng)而上調(diào)表達(dá)，其中的一些基因與防御反應(yīng)相關(guān)，包括病程相關(guān)蛋白（PR）和抑菌基因，其通過增強(qiáng)其蛋白活性來提高抗病能力。PR蛋白被認(rèn)為可被病原菌和非生物脅迫誘導(dǎo)[12]。根據(jù)PR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，目前PR蛋白在單子葉植物和雙子葉植物中被發(fā)現(xiàn)并已確認(rèn)了17個家族[3]。PR10是種子植物中廣泛分布的一種PR蛋白，它與樹木花粉過敏原和食物過敏源十分相似，屬于Bet v Ⅰlike 超家族[4]，這類基因編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在15～19 kDa，等電點(diǎn)偏酸性，無信號肽、屬胞內(nèi)蛋白（intracellular pathogenesisrelated proteins，IPR）。PR10除了與植物的生物及非生物脅迫密切相關(guān)，還在植物的生長發(fā)育，次級代謝等過程中起著重要作用[58]。證據(jù)表明，PR10直接參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)，具有體外抗菌活性或核酶活性[6，9]。endprint

三七Panax notoginseng （Burk） FHChen為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，多年來，其規(guī)?；N植受到以根腐病、白粉病等病害的嚴(yán)重限制，其中，根腐病常年發(fā)病率為5%～20%，嚴(yán)重的達(dá)70%以上，甚至絕收，且生長年限越長病害越嚴(yán)重[1013]，目前根腐病的控制手段主要以抗菌性農(nóng)藥的大量施用為主，根腐病的無害化防治已經(jīng)成為了三七栽培技術(shù)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。三七根腐病病原菌比較復(fù)雜，致病菌包括細(xì)菌中的假單胞桿菌（Pseudomonas sp，真菌中的壞損柱孢菌Cylindrocarpon destructans，C didynum、鐮刀菌Fusarium solani，F(xiàn) solani f sp radicicola，F(xiàn) oxysporum Schlecht，F(xiàn) scirpi Lamb等，通常以壞損柱孢菌、鐮刀菌或假單胞菌中某一類為主，數(shù)種病原菌復(fù)合侵染，加速根系腐爛[11，13]。

本研究通過克隆三七中的PR102基因的編碼序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過原核表達(dá)載體將三七PR102基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，進(jìn)行重組蛋白的大量表達(dá)和純化，通過研究三七PR102重組活性蛋白對三七關(guān)鍵根腐病致病菌的抑菌效果，為通過基因工程手段提高三七抗病性研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

11樣品二年生三七由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所提供，經(jīng)昆明理工大學(xué)崔秀明研究員鑒定。三七PR蛋白抑菌試驗(yàn)所用菌株腐皮鐮刀菌F. solani和壞損柱孢菌C. destructans，測試真菌由云南大學(xué)張克勤教授贈送，并報道了以上致病菌的分離、鑒定、致病性測定等研究結(jié)果。

12總RNA的提取、檢測及cDNA第一鏈合成三七總RNA提取采用TRIZOL法從三七葉片器官中提取總RNA，利用分光光度計(jì)和1%瓊脂糖電泳檢測所提取RNA的純度和完整性。以RNA為模板，oligo（dT）18為反轉(zhuǎn)錄引物，按照TaKaRa 公司的Prime ScriptTM RT Reagent 試劑盒說明書操作。

13PnPR102基因克隆與分析轉(zhuǎn)錄組測序篩選出表達(dá)差異顯著的病程相關(guān)蛋白PR102，從CDS文件中獲得PR102的拼接序列，將此片段用MEGA軟件和三七相近的物種人參的全長PR102序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該片段具有3′端和5′端。設(shè)計(jì)特異引物PR10F（5′GGATCCatgggtgtccaaaagaccgaaac3′，GGATCC為BamHI酶切位點(diǎn)）和PR10R（5′GAATTCctaatttgctaggaggtaagcttcaacagc3′，GAATTC為EcoRI酶切位點(diǎn)），采用大連寶生物公司提供的高保真PCR反應(yīng)酶擴(kuò)增該基因的開放閱讀框，回收DNA片段，連接pMD18T克隆載體，轉(zhuǎn)化，進(jìn)行檢測，測序。將測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，最終確定并獲得三七PR102基因的完整ORF。

通過wwwExPASyProtParamtoolhtm 在線分析該基因編碼氨基酸大小及其等電點(diǎn)，同時利用InterProScan軟件分析PnPR102蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，預(yù)測其可能的信號肽區(qū)域和跨膜區(qū)域，利用DNAMAN對三七及人參、胡蘿卜、芹菜等植物中PR10基因編碼蛋白的相似性及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。

14原核表達(dá)載體的構(gòu)建將測序檢測正確的pMD18TPnPR102載體質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切，回收PnPR102基因片段。將pET32a（+）質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，回收線性載體片段。將回收的PnPR102基因片段和回收后的線性質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，構(gòu)建pET32a（+）PnPR102原核表達(dá)載體。進(jìn)行PCR檢測，測序鑒定。

15重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化通過熱刺激法將測序正確的pET32a（+）PnPR102的重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞BL21中。摸索蛋白誘導(dǎo)條件，設(shè)計(jì)條件：IPTG濃度05，10，15 mmol·L-1，誘導(dǎo)時間2，4，6，8 h和誘導(dǎo)溫度37，28，20 ℃，進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后收集菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDSPAGE分析。

根據(jù)康為試劑可溶性蛋白純化試劑盒的說明書，對PnPR102的重組蛋白進(jìn)行純化，為優(yōu)化蛋白純化條件，設(shè)置了不同的洗脫液條件進(jìn)行洗脫，最終將純化后的蛋白進(jìn)行SDSPAGE檢測。

16重組蛋白的抑菌試驗(yàn)采用已確定的三七根腐病典型病菌腐皮鐮刀菌F solani和人參銹腐病菌C destructans為測試菌，采用濾紙片法測定提取物對測試根腐病病原真菌的抑菌活性。用打孔器將定量濾紙打成圓形紙片，121 ℃高溫滅菌20 min，烘干備用。在培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中制備好滅菌的固體PDA培養(yǎng)基，使用接種針挑取少量三七根腐病病原真菌菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，初步形成圓形菌絲體。取不同濃度的PnPR102純化重組蛋白滴到滅菌紙片上，晾1 min，將紙片放到PDA培養(yǎng)基中的病原菌菌絲體上，用20 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液（pH 70）作為對照，每個測試菌3個重復(fù)。由于2種菌株的生長速率不同，對腐皮鐮刀菌F solani采用直徑為15 mm紙片，加入純化PnPR102重組蛋白溶液量為50 mL，對人參銹腐病菌C destructans采用直徑為4 mm紙片，加入純化PnPR102重組蛋白溶液量為10 mL。將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小，即對病原真菌的抑制作用。

2結(jié)果與分析

21PnPR102基因的克隆通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得三七PR102序列，進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該片段具有3′端和5′端。設(shè)計(jì)特異引物，采用大連寶生物公司提供的高保真PCR反應(yīng)酶擴(kuò)該基因的ORF，得到480 bp左右大小的條帶，與目的基因的大小相符?；厥誅NA片段，連接pMD18T克隆載體，轉(zhuǎn)化，進(jìn)行PCR檢測，送測序。將測序結(jié)果取出載體序列后進(jìn)行序列比對，最終確定三七PR102基因的開放閱讀框并獲得含酶切位點(diǎn)的cDNA片段。將該cDNA片段在GenBank中進(jìn)行了登記，命名為PnPR102，注冊號為KY129859。endprint

將PnPR102序列輸入NCBI中的ORF（open reading frame finder）（wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml） 和DNAMAN軟件分析序列，結(jié)果顯示PnPR102全長465 bp，編碼154個氨基酸（圖1）。同時，用ExPASY（ProtParam）軟件分析PnPR102編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為16 5828，理論pI 441，分子式 C743H1180N182O239S3。PnPR102的154個氨基酸中堿性氨基酸（R，H，K）13個，酸性氨基酸（D，E）22個，非極性氨基酸（A，V，L，I，F(xiàn)，W，M，P）有66個，非電離的極性氨基酸（G，S，T，C，Y，N，Q）有53個。其中，帶負(fù)電荷的氨基酸包括D和E，共計(jì)22個，帶正電荷的氨基酸包括R和K，共11個。

22PnPR102基因的生物信息學(xué)分析三七PnPR102序列經(jīng)Blastn比對后，檢測與之覆蓋率相對較高的幾種植物，并獲得與三七PnPR102蛋白相似其他植物PR蛋白質(zhì)序列。選擇與三七PnPR102蛋白親緣關(guān)系相對較近的人參、胡蘿卜、香芹菜、山芹菜、馬鈴薯、丹參、獼猴桃等植物的PR蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對，同源性分別為97%，62%，61%，57%，52%，51%，50%。以上基因編碼的氨基酸序列長度相似，在N端和C端有較高的保守性（圖2，3）。

利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，將三七PR102蛋白與人參、胡蘿卜、香芹菜、山芹菜、馬鈴薯、丹參、獼猴桃、芝麻、葡萄的蛋白構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。三七PnPR102蛋白與人參PR102蛋白（登錄號：ACY369431）聚為一類，表現(xiàn)較近的親緣關(guān)系。

利用在線工具InterPro（http：//wwwebiacuk/interpro/search/sequencesearch）對PnPR102蛋白預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域（采用默認(rèn)參數(shù)），在PnPR10蛋白中發(fā)現(xiàn)其含有1個保守結(jié)構(gòu)域家族，Bet v I型過敏源（Bet v I type allergen，IPR024949），該家族中含有病程相關(guān)蛋白 Bet v I結(jié)構(gòu)PATHOGENESIS_BETVI，PS00451），位于89～120位，以及7個Major pollen allergen Bet v I 乳膠蛋白過敏原結(jié)構(gòu)（Major pollen allergen Bet V I，PR00634），分別位于3～23，26～36，5～59，66～85，85～98，109～125，143～153位；此外，還在PnPR10蛋白中發(fā)現(xiàn)START類結(jié)構(gòu)域（STARTlike domain，IPR023393），Bet v I乳膠蛋白結(jié)構(gòu)域（Bet v I/Major protein，IPR000916）；2個Betv I類似結(jié)構(gòu)域（SSF55961，cd07816）；2個未命名的結(jié)構(gòu)域（PTHR31213，PTHR31213：SF14）。Bet v I 型過敏原（Bet v I type allergen）的基因本體（GO）預(yù)測表明，該蛋白參與防御反應(yīng)（GO：0006952）和生物應(yīng)激反應(yīng)（GO：0009607）的生物學(xué)過程。

23PnPR102原核表達(dá)載體構(gòu)建、重組蛋白的表達(dá)與純化重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，根據(jù)誘導(dǎo)體系的優(yōu)化，得到最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG的終濃度為1 mmol·L-1，誘導(dǎo)時間為8 h，最佳誘導(dǎo)溫度條件為20 ℃。收集誘導(dǎo)蛋白進(jìn)行SDSPAGE檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預(yù)測的蛋白相對分子質(zhì)量35 kDa（載體上蛋白標(biāo)簽大小約為18 kDa，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為1705 kDa）左右得到1條非常明顯的蛋白條帶，而在對照菌株蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)這條帶，表明這個蛋白在大腸桿菌的感受態(tài)BL21中得到了成功的表達(dá)，而且表達(dá)量較高。在對菌體進(jìn)行超聲波破碎后，其上清和沉淀的SDSPAGE的結(jié)果表明目的蛋白在上清和沉淀中均自由表達(dá)，在上清中的蛋白含量遠(yuǎn)大于沉淀中的蛋白含量，說明誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白大部分以可溶性蛋白的形式表達(dá)。

根據(jù)試劑盒可溶性蛋白純化試劑盒的說明書，對PnPR102重組蛋白進(jìn)行純化，當(dāng)洗脫液含80%結(jié)合液及20%洗脫液時，純化蛋白濃度最高，但純度較低；而當(dāng)洗脫液含40%結(jié)合液及60%洗脫液時，蛋白純化純度較高，但濃度不高（圖5）。蛋白純化實(shí)驗(yàn)效果較好，測定了純化后蛋白液的濃度后，-80 ℃保存，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

24純化PnPR102重組蛋白抑菌試驗(yàn)采用三七根腐病典型病菌腐皮鐮刀菌F solani和人參銹腐病菌C destructans為測試菌，紙片法測試純化的PnPR102重組蛋白的抗真菌活性，2個菌株經(jīng)純化PnPR102重組蛋白處理24 h后，均可見清晰的抑菌環(huán)，而對照未出現(xiàn)抑菌圈（圖6）。在腐皮鐮刀菌F solani抑菌試驗(yàn)中，對于高濃度的PnPR102重組蛋白處理所形成的抑菌圈大小明顯大于低濃度重組蛋白處理。在人參銹腐病菌C destructans抑菌試驗(yàn)中，低濃度的PnPR102重組蛋白處理抑菌圈不顯著（數(shù)據(jù)未體現(xiàn)），在高濃度PnPR102重組蛋白處理下形成了明顯的抑菌圈。表明PnPR102重組純化蛋白對典型根腐病病菌腐皮鐮刀菌F solani和人參銹腐病菌C destructans有一定的抑制作用。

3討論

PR10是廣泛存在于高等植物中的一類非常重要的病程相關(guān)蛋白，其不僅參與植物對生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)，對植物的生長發(fā)育也有一定的功能。三七是我國，尤其是云南省重要的藥材主栽品種，價值較高，由于受到根腐病等常見病害的危害，長期依賴農(nóng)藥等化學(xué)藥品的控制，在一定程度上降低了三七的品質(zhì)。因此，積極挖掘和研究三七本身的抗病基因，可以為找出對病害抗性好品種提供研究參考。本研究通過克隆三七病程相關(guān)蛋白10基因（PR10），與已發(fā)現(xiàn)的三七PnPR101基因是不同的2個三七PR10基因[14]，因此命名為PnPR102，豐富了對三七PR10基因家族的研究。PnPR102基因包含一個典型的Bet v I型過敏源保守結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白參與防御反應(yīng)（GO：0006952）和生物應(yīng)激反應(yīng)（GO：0009607）的生物學(xué)過程。PnPR102序列與已知的其他植物如人參、胡蘿卜、香芹菜等的PR10序列具有一定的相似性，尤其與人參的PR102序列相似度達(dá)到98%。endprint

本研究的核心目的在于研究PnPR102蛋白的抗根腐病病菌的效果，通過重組DNA技術(shù)，使目的基因在pET原核表達(dá)載體系統(tǒng)中借助Ecoli宿主表達(dá)菌大量誘導(dǎo)了PnPR102蛋白的表達(dá)，通過優(yōu)化表達(dá)條件，PnPR102蛋白可以在破碎細(xì)胞的上清和沉淀中有較為理想的表達(dá)量，為后續(xù)的研究提供了較好的條件。從細(xì)胞上清中純化回收得到了PnPR102重組蛋白，抑菌試驗(yàn)表明PnPR102重組蛋白對典型根腐病病菌腐皮鐮刀菌F solani和人參銹腐病菌C destructans有一定的抑制作用，這與其他物種中發(fā)現(xiàn)的PR10蛋白具有體外抗菌活性的結(jié)論是一致的[6，9]，猜測該基因可能參與了三七抗根腐病的防御反應(yīng)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Van Loon L C， Pierpoint W S， Boller T，et al. Recommendation for naming plant pathogenesisrelated proteins[J] Plant Mol Biol Rep， 1994，12：245.

[2]Van Loon L C，Van Strien E A The family of pathogenesisrelated proteins[J] Physiol Mol Plant Pathol，1999，55：85.

[3]Christensen A B， Cho B H， Naesby M，et al. The molecular characterization of two barley proteins establishes the novel PR17 family of pathogenesisrelated proteins[J]. Mole Plant Pathol， 2002，3：135.

[4]Radauer C， Lackner P， Breiteneder H The Bet v 1 fold： an ancient，versatile scaffold for binding of large，hydrophobic ligands[J]. BMC Evol Biol，2008，8（1）：286.

[5]Jwa N S，Agrawal G K，Rakwal R，et al. Molecular cloning and characterization of a novel jasmonate inducible pathogenesisrelated class 10 protein gene，JIOsPR10，from rice （Oryza sativa L） seedling leaves[J]. Biochem Bioph Res Co，2001，286： 973.

[6]Park C J， Kim K J， Shin R，et al. Pathogenesisrelated protein 10 isolated from hot pepper functions as a ribonuclease in an antiviral pathway[J]. Plant J，2004，37： 186.

[7]Liu J J，Ekramoddoullah A K M，Yu X Differential expression of multiple PR10 proteins in western white pine following wounding，fungal infection and cold hardening[J]. Physiologia Plantarum，2003，119： 544.

[8]Fujimoto Y，Nagata R，F(xiàn)ukasawa H，et al. Purification and cDNA cloning of cytokininspecific binding protein from mung bean （Vigna radiata） [J]. Eur J Biochem，1998，258： 794.

[9]Liu X J， Huang B B， Lin J，et al. A novel pathogenesisrelated protein （SsPR10） from Solanum surattense with ribonucleolytic and antimicrobial activity is stressand pathogeninducible[J]. J Plant Physiol， 2006，163： 546.

[10]董弗兆，劉祖武， 樂麗濤 云南三七[M] 昆明：云南科學(xué)技術(shù)出版社，1988.

[11]陳昱君，王勇，馮光泉 三七病蟲害防治[M] 昆明：云南科學(xué)技術(shù)出版社，2005： 15.

[12]楊建忠，崔秀明，陳昱君，等 連作地土壤處理對三七根腐病的控制效果[J]. 特產(chǎn)研究，2010，32（2）：37.

[13]繆作清，李世東，劉杏忠，等 三七根腐病病原研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006，39（7）： 1371.

[14]唐美瓊，閔丹丹，李剛，等 三七病程相關(guān)蛋白PR101基因克隆及功能初步分析[J]. 藥學(xué)學(xué)報，2015， 50 （2）： 227

[責(zé)任編輯呂冬梅]endprint