劉惠芬+衣葵花+劉文光+李智峰+李云芝

摘要：對(duì)斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ（SpltNPVⅡ）基因組DNA中的同源重復(fù)區(qū)hr5的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行研究。結(jié)果表明，SpltNPVⅡ hr5大小為389 bp，含有3個(gè)64 bp不完全回文序列，回文序列的中心均含有1個(gè)PvuⅠ限制性酶切位點(diǎn)，并且存在1個(gè)與病毒基因組DNA復(fù)制相關(guān)的motif（CGATT）基序。瞬時(shí)表達(dá)分析表明，hr5在野生型病毒感染和未感染的細(xì)胞中均具有增強(qiáng)早期基因ie1啟動(dòng)子活性的功能；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，hr5在野生型病毒作為輔助病毒時(shí)，具有基因組DNA復(fù)制起始原點(diǎn)的功能。研究證明SpltNPVⅡhr5具有復(fù)制起始原點(diǎn)和增強(qiáng)子的雙功能作用。

關(guān)鍵詞：斜紋夜蛾；核型多角體病毒；同源重復(fù)區(qū)；增強(qiáng)子

中圖分類(lèi)號(hào)：S433.4：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）08-0099-05

Abstract The structure-function of homlogous region 5 （hr5） from Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus Ⅱ（SpltNPVⅡ）was studied in this paper. The results showed that the length of hr5 is 389 bp consisting of three 64-bp imperfect palindromes，and each palindrome contains a PvuⅠ site in the center and one motif （CGATT）which related to the replication of genomic DNA of virus. A transent expression assay demonstrated that the expression of SpltNPVⅡ-ie1 promoter-driven luciferase gene was enhanced by hr5 in both infected and uninfected Spli221 cells. Real-time PCR confirmed that the hr5 could function as ori of viral DNA replication in infected cells with wild type virus as the helper virus.The study results indicated that SpltNPVⅡhr5 is bifunctional， having both ori and enhancer activities.

Keywords Spodoptera litura； Nucleopolyhedrovirus； Homologous region （hr）； Enhancer

斜紋夜蛾（Spodotera litura）是一種雜食性的重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，全國(guó)各地均有分布。該蟲(chóng)廣泛危害水稻、玉米、棉花、花生、煙草等數(shù)十種糧食和經(jīng)濟(jì)作物，近年來(lái)對(duì)蔬菜、花卉、草坪等的危害特別嚴(yán)重[1]。目前，在各種化學(xué)合成殺蟲(chóng)劑嚴(yán)重污染環(huán)境、農(nóng)作物的高毒農(nóng)藥殘留問(wèn)題日顯嚴(yán)重及害蟲(chóng)對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的抗性日益增強(qiáng)的情況下，對(duì)斜紋夜蛾進(jìn)行生物防治就顯得尤為重要和迫切[2]。斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型（Spodotera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPVⅡ）分離株是一種繁殖率和毒力極強(qiáng)的病毒變異株，作為生物殺蟲(chóng)劑具有很高的研究?jī)r(jià)值和良好的應(yīng)用前景。

1984年，Blinov等[3]最早報(bào)道了大蠟螟核型多角體病毒（Galleria mellonella multiple nucleopolyhedrovirus，GmMNPV）的BamHⅠ-H片段帶有一個(gè)同源重復(fù)區(qū)（homologous repeat regions，hrs），即復(fù)制起始原點(diǎn)。之后，hrs作為基因組DNA復(fù)制起始原點(diǎn)（origin of replication，ori）在眾多桿狀病毒中得到證實(shí)。大量研究結(jié)果表明，hrs除作為DNA復(fù)制起始原點(diǎn)外，還具有較強(qiáng)的增強(qiáng)子功能[4-6]。家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）基因組中hr5不僅在宿主細(xì)胞中具有復(fù)制起始原點(diǎn)功能，在苜蓿尺蠖核型多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感染的非宿主Sf細(xì)胞中亦可得到復(fù)制，而且hr5在Sf細(xì)胞/AcMNPV系統(tǒng)中的復(fù)制功能要比在BmN細(xì)胞/BmNPV系統(tǒng)中高一些；另外，BmNPV hr3在Sf細(xì)胞/AcMNPV系統(tǒng)中的增強(qiáng)子功能也要高于BmN細(xì)胞/BmNPV系統(tǒng)[7]。Felipe等[8]的研究結(jié)果表明美國(guó)白蛾核型多角體病毒（Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus，HycuNPV）基因組中的hr6在5種鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞（BmN-4、Ld652Y、Sf9、SpIm、TN368）和雙翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞（S2）中，均能夠分別增強(qiáng)HycuNPV ie1（hycu-ie1）、黃杉毒蛾核型多角體病毒（Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus，OpMNPV） ie2（op-ie2）和果蠅熱休克蛋白70基因（Drosophila heat shock protein，hsp70）啟動(dòng)子的活性。上述研究結(jié)果表明，桿狀病毒hrs在宿主和非宿主細(xì)胞中均具有復(fù)制起始原點(diǎn)和增強(qiáng)基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的功能。然而，關(guān)于斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱhr5的結(jié)構(gòu)目前尚無(wú)報(bào)道，其功能尚不明確。endprint

本研究以SpltNPVⅡ?yàn)檠芯坎牧希捎脤?shí)時(shí)熒光定量PCR以及瞬時(shí)表達(dá)分析等方法，對(duì)SpltNPVⅡ同源重復(fù)區(qū)hr5在宿主細(xì)胞Spli221中的復(fù)制起始原點(diǎn)和/或增強(qiáng)子功能進(jìn)行研究，以期加深和豐富對(duì)桿狀病毒增殖機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)，為研制高效、寬宿主域殺蟲(chóng)病毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SpltNPV Ⅱ原始細(xì)胞純化毒株（BV）由日本岐阜縣生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究所Kamiya K博士饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。斜紋夜蛾TUAT-Spli221細(xì)胞由日本名古屋大學(xué)資源昆蟲(chóng)研究室Kobayashi M教授提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。

pUC-19質(zhì)粒載體、pGL3-Basic質(zhì)粒載體、受體菌E. coli TOP10由本實(shí)驗(yàn)室保存。各種限制性?xún)?nèi)切酶、配套buffer，T4 DNA連接酶及buffer，dNTPs和熒光素酶報(bào)告基因分析試劑盒均購(gòu)自Promega公司。Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。寡核苷酸引物的合成和DNA測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SpltNPVⅡ純化 在斜紋夜蛾幼蟲(chóng)4齡初期注射感染細(xì)胞純化毒株（BV），讓病毒在蟲(chóng)體內(nèi)繁殖擴(kuò)增。待蟲(chóng)體發(fā)病后收集感染病蟲(chóng)的尸體進(jìn)行研磨，用蒸餾水反復(fù)清洗，利用差速離心的方法純化多角體病毒。

1.2.2 SpltNPVⅡ基因組DNA的提取 按照文獻(xiàn)[9]提取SpltNPV Ⅱ基因組DNA。

1.2.3 SpltNPVⅡ基因組DNA hr5的序列分析 利用ClustalW、DNAMAN、Lasergene 7.1和MEGA 4等生物軟件對(duì)SpltNPVⅡ hr5序列進(jìn)行分析。

1.2.4 SpltNPVⅡ基因組DNA hr5功能質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)特異性引物（見(jiàn)表1），以SpltNPVⅡ基因組DNA為模板，擴(kuò)增ie1基因上游510 bp的啟動(dòng)子區(qū)，克隆至載體pUC-19中，測(cè)序正確后亞克隆至載體pGL3-Basic中得到質(zhì)粒pSp-ie1P/luc+。擴(kuò)增SpltNPVⅡ hr5序列，連接pEASY-T3載體，測(cè)序正確后亞克隆至載體pUC-19中，用于hr5復(fù)制起始原點(diǎn)功能的檢測(cè)。并將其亞克隆到pSp-ie1P/luc+質(zhì)粒中ie1基因啟動(dòng)子的下游，得到質(zhì)粒pSp-ie1P-hr5/luc+（圖1），用于檢測(cè)hr5是否有增強(qiáng)ie1基因強(qiáng)啟動(dòng)子的活性。

1.2.5 瞬時(shí)表達(dá)分析 將構(gòu)建的重組功能質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)染野生型病毒SpltNPVⅡ感染和未感染的Spli221細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下，5 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。加入適量磷酸緩沖液PBS，重懸細(xì)胞后，5 000 r/min離心5 min，棄上清，如此反復(fù)清洗細(xì)胞2～3次。加入細(xì)胞裂解液將細(xì)胞重懸，裂解5～10 min，使之充分裂解。在每個(gè)樣品管中裝入100 μL的熒光素酶反應(yīng)底物（luciferase assay reagent），加入20 μL細(xì)胞裂解混合液，振蕩混勻。將樣品放入熒光儀，按照設(shè)定程序開(kāi)始測(cè)量讀數(shù)[10]。設(shè)置三組重復(fù)試驗(yàn)。以只含ie1基因強(qiáng)啟動(dòng)子的pSp-ie1P/luc+質(zhì)粒作對(duì)照。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將構(gòu)建的重組功能質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染感染野生型輔助病毒SpltNPVⅡ的Spli221細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總DNA，經(jīng)DpnⅠ酶切后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出每微克DNA扣除對(duì)照質(zhì)粒（pUC-19）拷貝數(shù)后所含目的重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SpltNPVⅡ同源重復(fù)區(qū)hr5序列分析

用DotPlot軟件分析表明斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型基因組DNA包含有7個(gè)同源重復(fù)區(qū)（hrs）。其中SpltNPVⅡhr5最小，為389 bp，位于基因組78 945～79 333 bp、ORF79～ORF80之間。hr5含3個(gè)64 bp不完全回文序列：TTTTAGTACATGATCTTTGCTTTCATCGAGACCTGTGGATGAAATCCAACATCAAGTATGAAAA（圖2），其序列的核苷酸一致性高達(dá)90%以上，回文序列的中心均含有1個(gè)PvuⅠ限制性酶切位點(diǎn)，并且存在1個(gè)與病毒基因組DNA復(fù)制相關(guān)的motif（CGATT）基序（圖3）。

2.2 功能質(zhì)粒的酶切鑒定

為了檢測(cè)SpltNPVⅡhr5是否具有復(fù)制起始原點(diǎn)以及激活并增強(qiáng)ie1基因強(qiáng)啟動(dòng)子活性的功能，以SpltNPVⅡDNA為模板，PCR擴(kuò)增ie1基因啟動(dòng)子和hr5序列，擴(kuò)增片段大小分別為550 bp和 450 bp，將其分別克隆至載體pUC-19和pGL3-Basic中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-ie1P和pSp-ie1P-hr5/luc+，經(jīng)酶切鑒定，電泳條帶與預(yù)期大小一致（圖4）。

2.3 SpltNPVⅡ同源重復(fù)區(qū)hr5增強(qiáng)子功能分析

采用構(gòu)建的功能質(zhì)粒（pSp-ie1P-hr5/luc+）轉(zhuǎn)染Spli221細(xì)胞，進(jìn)行病毒感染和未感染兩組瞬時(shí)表達(dá)分析試驗(yàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后測(cè)定細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性。檢測(cè)結(jié)果表明，含有hr5的功能質(zhì)粒在野生型病毒感染和未感染的細(xì)胞裂解液的光量子數(shù)分別為：1.2×105±3.7×104 CPM和7.6×104±8.1×103 CPM，均是對(duì)照質(zhì)粒pSp-ie1P/luc+轉(zhuǎn)染細(xì)胞的3倍多（表2）。結(jié)果顯示hr5在野生病毒感染和未感染的細(xì)胞中均具有增強(qiáng)早期基因ie1強(qiáng)啟動(dòng)子活性的功能。

2.4 SpltNPVⅡ同源重復(fù)區(qū)hr5復(fù)制功能分析

一般大腸桿菌菌株均是dam+，從這些菌株中制備的質(zhì)粒DNA序列G*ATC中的A是完全甲基化的，而在真核細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列G*ATC中的A則是不完全甲基化的。而DpnⅠ酶切位點(diǎn)G*ATC中的A必須是完全甲基化的。因此，可利用DpnⅠ酶的這種特性來(lái)區(qū)別是轉(zhuǎn)染細(xì)胞質(zhì)粒中的DNA，還是真核細(xì)胞中復(fù)制出來(lái)的DNA片段。利用DpnⅠ內(nèi)切酶的這個(gè)特性來(lái)檢測(cè)SpltNPVⅡ的同源重復(fù)區(qū)hr5在Spli221細(xì)胞中復(fù)制的功能，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明SpltNPVⅡhr5的復(fù)制效率（拷貝數(shù)）為1.52×105 copies/μg DNA，對(duì)照質(zhì)粒pUC-19的復(fù)制效率（拷貝數(shù)）僅為1 730±70 copies/μg DNA，初步證明hr5在野生型病毒SpltNPVⅡ作為輔助病毒時(shí)，具有基因組DNA復(fù)制起始原點(diǎn)功能。endprint

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型分離株基因組DNA中的同源重復(fù)區(qū)hr5序列分析表明，hr5含有3個(gè)64 bp不完全回文基序，在回文序列的中心均含有一個(gè)PvuⅠ限制性酶切位點(diǎn)。這一特性與AcMNPV的hrs類(lèi)似，AcMNPV基因組含有9個(gè)hrs，每個(gè)hr含有5個(gè)至8個(gè)以EcoRⅠ位點(diǎn)為核心的30 bp不完全回文序列[12]。Pearson等[13]率先證實(shí)AcMNPV的hr5是DNA復(fù)制起始原點(diǎn)，之后Leisy等[14]發(fā)現(xiàn)AcMNPV hr1a回文序列中心的四個(gè)核苷酸序列是hr作為復(fù)制起始原點(diǎn)必需的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，桿狀病毒的hr序列被證實(shí)具有增強(qiáng)子效應(yīng)，無(wú)論方向和位置對(duì)極早期和晚早期基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄均有很強(qiáng)的促進(jìn)作用[15，16]。本研究利用瞬時(shí)表達(dá)分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，證實(shí)了SpltNPVⅡhr5具有復(fù)制起始原點(diǎn)和增強(qiáng)子的雙功能作用。

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