唐喆，王菲，童鑫，賈巖巖

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院，江蘇 南京 210004）

CMIA與HPLC監(jiān)測新生兒萬古霉素血藥濃度的比較研究

唐喆，王菲，童鑫，賈巖巖

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院，江蘇 南京 210004）

目的：比較化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法（CMIA）和高效液相色譜法（HPLC）測定新生兒血漿中萬古霉素濃度所得結(jié)果的區(qū)別與相關(guān)程度。方法：建立測定新生兒萬古霉素血藥濃度的HPLC，并進行方法學(xué)驗證。收集新生兒患者萬古霉素峰谷濃度血漿樣本，分別用CMIA與HPLC進行測定，比較兩種測定方法的異同。結(jié)果：CMIA和HPLC檢測的新生兒萬古霉素血藥濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），HPLC測定結(jié)果均值高于CMIA，Passing-Bablok回歸結(jié)果顯示兩種測定方法相關(guān)性較好，一致性欠佳。結(jié)論：CMIA和HPLC測定新生兒萬古霉素血漿藥物濃度所得結(jié)果有明顯差異，臨床進行血藥濃度監(jiān)測時應(yīng)予以注意，避免跨系統(tǒng)監(jiān)測。

化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法；高效液相色譜法；萬古霉素；新生兒；血藥濃度監(jiān)測

萬古霉素是一種糖肽類抗生素，臨床用于治療革蘭氏陽性菌特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）所致的嚴(yán)重感染。萬古霉素具有一定的腎毒性與耳毒性，臨床應(yīng)用時個體差異較大，用于新生兒時尤其應(yīng)謹(jǐn)慎使用，避免血藥濃度過高，防止不良反應(yīng)發(fā)生。但萬古霉素血藥濃度過低，易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌，導(dǎo)致治療失敗。因此，萬古霉素應(yīng)用于新生兒時必須進行血藥濃度監(jiān)測，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果及時調(diào)整萬古霉素劑量[1-2]。

監(jiān)測萬古霉素血藥濃度的主要技術(shù)方法有高效液相色譜法（HPLC）、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法（CMIA）、酶放大免疫法（EMIT）等。國外近期研究顯示，不同的檢測技術(shù)方法對新生兒萬古霉素血藥濃度的監(jiān)測有重大影響，直接影響臨床個體化給藥[3]?！度f古霉素臨床應(yīng)用中國專家共識（2011年版）》也并未提示不同血藥濃度檢測方法之間的差異[4]。因此不同方法所得測定結(jié)果的相關(guān)性、一致性亟待驗證。

目前，國內(nèi)比較HPLC與CMIA測定萬古霉素血藥濃度的研究較少，且有統(tǒng)計學(xué)方法選擇不當(dāng)?shù)那闆r[5]。本次研究收集使用萬古霉素治療的新生兒血樣119份，分別用HPLC與CMIA進行測定，評價兩種方法的相關(guān)性與一致性，為臨床提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（1525泵，2487紫外檢測器，2707自動進樣器，Empower 3色譜工作站）；Architect I1000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀；Mettler XS105DU分析天平；Eppendorf 5424R 高速冷凍離心機。

1.2 試藥

萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130360-201302，純度99.2%）；色譜純甲醇、乙腈；分析純磷酸二氫鉀、高氯酸、磷酸；注射用水（安徽雙鶴藥業(yè)，批號：1502106A）；萬古霉素試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)曲線盒與質(zhì)量控制試劑盒（Abbott公司）；空白成人血漿由南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗科提供。

1.3 樣本

樣本來源于2015年1月- 2016年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院使用萬古霉素治療的新生兒患者，于第4劑或第5劑給藥前采血測定谷濃度（C谷），于萬古霉素靜滴結(jié)束后0.5 h采血測定峰濃度（C峰）。每份采集到的血樣離心后分成兩份血漿樣品，4℃冰箱內(nèi)保存，分別用于HPLC和CMIA測定萬古霉素血藥濃度，取樣后24 h內(nèi)完成檢測。

2 方法

2.1 HPLC

2.1.1 溶液的配制 精密稱取萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品50 mg于100 mL容量瓶中，加入注射用水稀釋至刻度，搖勻，得萬古霉素儲備液，4℃避光保存。將萬古霉素儲備液稀釋成濃度為12.5，25.0，50.0，125.0，250.0，500.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。精密稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加注射用水溶解至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2，0.45 μm微孔濾膜濾過，超聲脫氣后備用。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Waters SunFire C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（V/V，20∶80，pH＝3.2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：236 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.1.3 樣品前處理 取血清樣品300 μL于1.5 mL EP管中，加入225 μL沉淀劑（甲醇-乙腈-6%高氯酸:1∶1∶6，V/V/V）沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，13 500 r/min離心10 min，取上清經(jīng)0.45 μm針頭過濾器濾過后，轉(zhuǎn)入樣品瓶中待測。

2.1.4 方法學(xué)考察 ①線性關(guān)系考察。取“2.1.1”項下萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液75 μL，加入空白血清300 μL，配制成含萬古霉素2.5～100.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度血漿樣本，按“2.1.3”項下方法進行預(yù)處理，按“2.1.2”項下色譜條件進行測定。記錄萬古霉素的保留時間（tR），以樣品峰面積（Y）對濃度（C）進行線性回歸。②專屬性考察。使用萬古霉素進行治療的新生兒患者往往合并使用多種抗菌藥治療感染，可能會對萬古霉素血藥濃度測定造成潛在影響。配制含萬古霉素、頭孢他啶、阿莫西林、頭孢哌酮、哌拉西林、頭孢曲松、美羅培南、氟康唑的血漿樣本，預(yù)處理后進行測定，計算各抗菌藥色譜峰與萬古霉素色譜峰之間的分離度。③回收率、精密度、穩(wěn)定性考察。配制萬古霉素濃度為2.5，25.0，100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)濃度血樣各5份，每個質(zhì)量濃度連續(xù)測量3次，連續(xù)測定5 d，計算3個質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度和日間精密度。所測得藥物峰面積代入回歸方程計算，以計算測得量與加入量之比即方法回收率；所測得藥物峰面積除以同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得峰面積，以計算提取回收率。3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)濃度血樣于4℃冰箱內(nèi)保存，于0，4，8，12，24 h取樣測定，計算峰面積RSD值即穩(wěn)定性。

2.1.5 患者血漿測定 取待測血漿，按“2.1.3”項下所述方法處理分析，用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中萬古霉素的含量。

2.2 CMIA

取質(zhì)量濃度為0.0，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/mL的萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，以萬古霉素試劑盒檢測，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，運行后儀器進行自動測試與標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。精密度、回收率、線性、專屬性等性能指標(biāo)均按照ARCHITECT系統(tǒng)操作手冊執(zhí)行。每次檢測患者樣品時均按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范測定，儀器自行取樣、分析測定，每批血漿樣本測定時需進行質(zhì)控樣品的平行測定。

2.3 數(shù)據(jù)分析

對得到的C谷和C峰進行分別比較。采用Shapiro-Wilk檢驗樣本正態(tài)性。如符合正態(tài)分布，則用配對t檢驗比較兩組測定結(jié)果有無差異，反之則用Wilcoxon配對檢驗?；貧w分析采用Passing-Bablok。采用R軟件（R i386 3.2.5）進行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 HPLC方法學(xué)考察結(jié)果

在上述色譜條件下，萬古霉素tR為7.219 min，與其他內(nèi)源性物質(zhì)分離完全（見圖1），在濃度2.5～100.0 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y＝9606.8C－6962.4，r＝0.9996（n＝5）。

HPLC的定量限為2.5 μg/mL，檢測限為1.0 μg/mL。

據(jù)圖2可知，萬古霉素與阿莫西林、頭孢哌酮、頭孢他啶的分離度均大于1.5，而哌拉西林、頭孢曲松、美羅培南、氟康唑在該前處理和色譜條件下不出峰，可見上述藥物在臨床與萬古霉素合并使用時，不會對萬古霉素血藥濃度監(jiān)測產(chǎn)生影響。

由表1可見，萬古霉素的回收率和精密度符合生物樣本的測定要求。穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，萬古霉素血漿樣本24 h內(nèi)在4℃環(huán)境下保持穩(wěn)定。

圖1 HPLC檢測萬古霉素血漿樣品色譜圖

圖2 含多種抗生素的萬古霉素血漿樣品色譜圖

表1 HPLC回收率、精密度、穩(wěn)定性結(jié)果

3.2 HPLC與CMIA的比較

本次研究從臨床采集萬古霉素谷濃度血漿樣品84例，峰濃度樣品35例。將每份樣品分別用HPLC與CMIA進行檢測。正態(tài)分布性結(jié)果顯示，兩種方法所得C谷、C峰，兩種方法測定差值均呈正態(tài)分布。應(yīng)用配對t檢驗比較兩種方法所得C谷和C峰，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

計算兩種方法所得測定值的相對偏差（RE）：

RE（%）＝（兩種方法測定差值/兩種方法測定均值）×100%

并以RE為縱坐標(biāo)，兩種方法測定均值為橫坐標(biāo)，分別繪制C谷和C峰的Bland-Altman偏差圖（圖3）。對于C谷，有5.95%的點在95%的一致性界限以外；對于C峰，有5.71%的點在95%的一致性界限以外。此外，HPLC所得測定值明顯高于CMIA，RE絕對值最大為35.65?？梢妰煞N方法測定值相差幅度較大，故認(rèn)為兩種方法測定值的一致性欠佳。

Passing-Bablok回歸結(jié)果見表2和圖4?；貧w方程的截距和斜率的95%置信區(qū)間提示兩種檢測方法之間的固定誤差和比例誤差大小。C谷和C峰所得回歸方程的斜率非常接近于1，表明兩種方法測定的結(jié)果之間比例誤差很小，且存在著良好的直線相關(guān)關(guān)系（Spearman系數(shù)＞0.95）。C谷和C峰所得回歸方程的截距明顯遠離原點，表明兩種檢測方法之間存在一定的固定誤差，這也與Bland-Altman偏差圖顯示的結(jié)果一致。

圖3 Bland-Altman偏差圖

圖4 Passing-Bablok回歸圖

表2 HPLC與CMIA的回歸和相關(guān)性分析

4 討論

本次研究納入萬古霉素血漿樣本數(shù)量較多，所得結(jié)果與以往研究有所差別。本次研究結(jié)果顯示，CMIA與HPLC測定值之間相關(guān)性良好，一致性欠佳，HPLC測定結(jié)果明顯高于CMIA。兩種檢測方法均會受到萬古霉素代謝產(chǎn)物、血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及臨床樣本條件的影響。CMIA的原理為：以樣本、萬古霉素抗體包被順磁微粒子后，與吖啶酯標(biāo)記的丙戊酸結(jié)合物混合，制成反應(yīng)混合物，萬古霉素抗體包被的微粒子與樣本中的吖啶酯標(biāo)記的萬古霉素結(jié)合物結(jié)合，沖洗，加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液到反應(yīng)混合物中，測量其發(fā)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。血漿樣本中的蛋白、鹽等內(nèi)源性物質(zhì)含量各有不同，對樣本中的萬古霉素和抗體結(jié)合的影響也各有不同，特別是對于萬古霉素濃度較低的樣本[6]。本次研究結(jié)果也顯示，C谷的相對偏差大于C峰。HPLC在方法研究時，難以取得新生兒空白血漿配制標(biāo)準(zhǔn)濃度血漿樣本，新生兒空白血漿的色譜圖與成人有明顯不同，造成方法開發(fā)時存在一定局限性。HPLC的前處理較為簡單，但使得檢測結(jié)果易受到血漿基質(zhì)效應(yīng)的影響，檢測背景偏高。這可能是造成HPLC的測定值高于CMIA的原因。

比較兩種分析方法時，除了關(guān)注兩種方法的測定值是否相關(guān)以外，更重要的是考察兩者的差異程度。研究方法主要有回歸法和圖解法。回歸法分析中，最小二乘法易受到數(shù)據(jù)的分布形態(tài)、線性關(guān)系、異常值等因素的影響，此外，最小二乘法假定測量方法不存在誤差?？紤]到這些局限性，在比較儀器分析方法結(jié)果時，宜采用Passing-Bablok回歸等[7-9]。在差值呈正態(tài)分布的前提下，可使用Bland-Altman偏差圖法直觀地反映兩種檢測方法之間的差異性[10-11]。

綜上所述，臨床均可應(yīng)用HPLC與CMIA監(jiān)測新生兒萬古霉素血藥濃度，兩種方法所得結(jié)果相關(guān)性較好，但差異明顯，使用二者的檢測結(jié)果以及在閱讀萬古霉素血藥濃度測定相關(guān)專業(yè)文獻時，需要考慮檢測方法的差異，臨床上也應(yīng)避免跨系統(tǒng)監(jiān)測。

[1] 陳新謙,金有豫,湯光.新編藥物學(xué)[M].17版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:86.

[2] 印曉星.治療藥物監(jiān)測[M].人民軍醫(yī)出版社,2011:125-126.

[3] Jacqz-Aigrain E, Zhao W, Sharland M, et al. Use of antibacterial agents in the neonate:50 years of experience with vancomycin administration[J].Semin Fetal Neonatal Med,2013,18(1):28-34.

[4] 翁心華,黃仲義,陳佰義,等.萬古霉素臨床應(yīng)用中國專家共識(2011版)[J].中國新藥與臨床雜志,2011,30(8):561-573.

[5] 孫秀漫,姜順軍,曾彩芳.HPLC法與CMIA法測定萬古霉素血藥濃度的比較[J].今日藥學(xué),2016,26(11):779-782.

[6] Oyaert M, Peersman N, Kiedder D, et al.Novel LC-MS/ MS method for plasma vancomycin: comparison with immunoassays and clinical impact[J].Clin Chim Acta, 2015, 441:63-70.

[7] Bilic-Zulle L.Comparison of methods: Passing and Bablok regression[J].Biochem Med(Zagreb) 2011, 21(1):49-52.

[8] Bablok W, Passing H. Application of statistical procedures in analytical instrument testing[J].J Automat Chem, 1985,7(2):74-79.

[9] 焦正,張明,仲瓏瑾,等.兩種單克隆抗體熒光免疫偏振法測定人全血中環(huán)孢素濃度的比較[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2006,26(7):789-791.

[10] Bland JM, Altman DG. Measuring agreement in method comparison studies[J]. Stat Methods Med Res,1999,8(2):135-160.

[11] 陳卉. Bland-Altman分析在臨床測量方法一致性評價中的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計,2007,24(3):308-309,315.

本文編輯：魯守琴

The Comparative Study of Comparing Chemiluminescent Micro-particle Immunoassay (CMIA) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for Determination of Serum Vancomycin Concentrations from Neonates

Tang Zhe, Wang Fei, Tong Xin, Jia Yan-yan
(Obstetrics and Gynecology Hospital Affliated to Nanjing Medical University, Jiangsu Nanjing 210004,China)

Objective：To compare the difference and correlation of Chemiluminescent Micro-particle Immunoassay (CMIA) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for determination of serum vancomycin concentrations from neonates. Methods：A HPLC method to determine vancomycin serum concentrations from neonates was established and verified. The plasma sample of vancomycin in peak valley concentration were collected and detected by CMIA and HPLC, respectively. At last, the similarities and differences of two methods were compared. Results：The significant difference was existed between this two methods (P＜0.05), and the average concentrations of HPLC was higher than CMIA. The Pass-Bablok regression indicated that the correlation of two methods was satisfactory while the consistency was limited. Conclusion：The signifcant difference is existed between two methods when vancomycin serum samples from neonates are analyzed by CMIA and HPLC. More attention should be paid to monitoring serum concentration in clinical, and cross-system monitoring should be avoided.

Chemiluminescent Micro-particle Immunoassay (CMIA); High Performance Liquid Chromatography (HPLC); Vancomycin; Neonates; Blood Concentration Monitoring

R969；R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.018

2017 - 05 - 08

南京藥學(xué)會－常州四藥醫(yī)院藥學(xué)科研基金（2015YX013）

唐喆，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：tjj870520@hotmail.com

王菲，女，副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：361998364@qq.com