沙敏，何翠琴，錢華，樊曉艷，王變，汪佳

(泰州市人民醫(yī)院， a. 中心實驗室，b. 婦產(chǎn)科，c. 新生兒重癥監(jiān)護室，d. 感染科，e. 生殖醫(yī)學(xué)科，江蘇泰州 225300)

·液體活檢與臨床實驗研究·

宮頸癌患者血清miR-130a的表達(dá)及意義*

沙敏a，何翠琴b，錢華b，樊曉艷c，王變d，汪佳e

(泰州市人民醫(yī)院， a. 中心實驗室，b. 婦產(chǎn)科，c. 新生兒重癥監(jiān)護室，d. 感染科，e. 生殖醫(yī)學(xué)科，江蘇泰州 225300)

目的 分析宮頸癌患者血清miR-130a的表達(dá)水平及臨床意義。方法 用熒光定量PCR檢測60例宮頸癌患者和60例體檢健康者血清miR-130a的表達(dá)水平，分析血清miR-130a水平與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果 與體檢健康者(0.029±0.024)相比，宮頸癌患者血清miR-130a表達(dá)水平(0.087±0.038)明顯升高(P<0.01)。miR-130a的高水平與腫瘤分化(P<0.01)以及腫瘤分期(P=0.01)密切相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-130a診斷宮頸癌的曲線下面積(AUCROC)為0.878(95%CI:0.809～0.947)，敏感性為86.7%，特異性為90.8%。與早期宮頸癌患者(0.074±0.034)相比，晚期宮頸癌患者血清miR-130a表達(dá)水平(0.105±0.038)明顯升高(P<0.05)；與術(shù)前(0.082±0.014)相比，宮頸癌術(shù)后血清miR-130a表達(dá)水平(0.033±0.022)明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 血清miR-130a有助于宮頸癌診斷和預(yù)后監(jiān)測，并可作為宮頸癌進展的輔助判斷指標(biāo)。

宮頸癌；血清；miR-130a；預(yù)測指標(biāo)

越來越多的研究證實，miRNA可作為宮頸癌早期診斷、術(shù)后監(jiān)測及預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)異常升高，并可通過激活NF-κB等信號通路促進宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[4]。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中Dicer(miR-130a靶分子)的表達(dá)水平與宮頸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，其進一步的生存分析顯示miR-130a高水平患者的無疾病生存(DFS)明顯低于低水平患者[5]。本研究通過檢測宮頸癌患者與體檢健康者血清miR-130a表達(dá)水平的差異，旨在分析血清miR-130a作為宮頸癌診斷和預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2014年9月至2016年8月本院初診的宮頸癌患者60例，年齡32～68歲,中位年齡50歲。均參照文獻(xiàn)[6]，經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷，患者術(shù)前均未進行放化療治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初次治療的患者；(2)無現(xiàn)在或既往的其他原發(fā)惡性腫瘤病史，臨床記錄完整；(3)有明確病理組織學(xué)診斷，均為宮頸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)無卵巢癌、嚴(yán)重肝腎疾病、盆腔炎及其他嚴(yán)重腦部器質(zhì)性病變；(2)排除生殖道結(jié)核、盆腔子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜炎、有其他嚴(yán)重精神疾病者、消化道腫瘤及有酒精藥物濫用史者；(3)不伴有心、肝、腦、腎、肺等器官及血液系統(tǒng)疾病。病理類型：鱗癌43例，腺癌17例；組織學(xué)分型：高分化和中分化28例，低分化32例；FIGO分期I～Ⅱ期35例， Ⅲ～Ⅳ期25例。隨機選取15例術(shù)后1個月宮頸癌患者進行隨訪。收集同期體檢健康女性60例作為健康人對照組，年齡30～65歲,中位年齡49歲。另收集同期就診的38例慢性宮頸炎患者作為相關(guān)疾病對照，年齡30～67歲，中位年齡49.5歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要儀器及試劑 miRNeasy Mini Kit(德國Qiagen公司)；MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國TaqMan公司)；HPV檢測試劑盒(美國Digene公司)；微量高速離心機(德國Eppendorf公司)；實時熒光 PCR儀(7500型,美國ABI公司)。

1.3 HPV檢測 采用第二代雜交捕獲技術(shù),按照HPV檢測試劑盒說明書操作檢測樣本中HPV-DNA含量及結(jié)果判讀。

1.4 血清miRNA的提取 Ⅰ～Ⅱ期宮頸癌患者于術(shù)前3～5 d抽取患者空腹靜脈血3 mL，術(shù)后 5～7 d再次采集; Ⅲ～Ⅳ期宮頸癌患者于確診時采集空腹靜脈血3 mL; 健康人對照組于體檢時采集空腹靜脈血3 mL,1 500 r/min離心15 min，吸取血清，置-80 ℃保存。所有標(biāo)本避免溶血和反復(fù)凍融。取180 μL血清，按miRNeasy Mini Kit試劑盒說明書操作提取miRNA，樣本用30 μL DEPC處理的ddH2O

溶解，置-80 ℃保存。取2 μL總RNA，用NanoDrop 1000微量核酸測定儀測定RNA的吸光度(A260/280 nm)值，取A260/280 nm值在1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實驗。

1.5 引物設(shè)計及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) miR-130a特異性逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACATGCCCT′-3′；U6特異性逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGATT-3′。均由上海吉凱基因化學(xué)公司設(shè)計并合成。按照TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。樣本置-20 ℃保存。

1.6 熒光定量PCR檢測血清miRNA-130a的表達(dá) miR-130a上游引物序列： 5′-GGGGCAGTGCAATGTTAAAA -3′；下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物序列： 5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′； 下游引物序列： 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 均由上海吉凱基因化學(xué)公司設(shè)計并合成。按照TaqMan MicroRNA Assay試劑盒說明書操作檢測miR-130a的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10×PCR buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 mmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq酶 0.4 μL，模板cDNA 1 μL，無RNA酶ddH2O 14 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃變性5 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。在60 ℃下采集熒光信號，并用7500 software V2.0.6軟件進行熔解曲線分析。每份樣品設(shè)3個復(fù)管，Ct值取2次PCR反應(yīng)的平均值。血清miR-130a的表達(dá)水平用2-ΔCt法計算。

2 結(jié)果

2.1 各組宮頸癌患者血清miR-130a的表達(dá)水平 熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，宮頸癌患者血清中miR-130a的表達(dá)水平(0.087±0.038)明顯高于體檢健康者(0.029±0.024)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.74，P<0.01)。進一步對15例隨訪宮頸癌患者術(shù)后1個月血清miR-130a水平進行檢測，結(jié)果顯示，術(shù)前血清miR-130a表達(dá)水平為(0.082±0.014)，術(shù)后為(0.033±0.022)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.408，P<0.01)。此外， 25例Ⅲ～Ⅳ期宮頸癌患者血清miR-130a表達(dá)水平(0.105±0.038)明顯高于35例Ⅰ～Ⅱ期宮頸癌患者(0.074±0.034)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.24，P=0.002)。低分化宮頸癌患者血清miR-130a表達(dá)水平(0.107±0.034)高于高中分化宮頸癌患者(0.066±0.032)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.785，P<0.01)。血清miR-130a的表達(dá)水平在宮頸癌鱗癌患者(0.087±0.037)與腺癌患者(0.087±0.042)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.065，P=0.948)。

2.2 血清miR-130a表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-8]，以宮頸癌患者血清miR-130a表達(dá)水平高于體檢健康者3.02倍作為界值，分為低表達(dá)(<3.02倍)和高表達(dá)(≥3.02倍)。宮頸癌患者血清miR-130a表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤直徑及HPV感染無關(guān)(P>0.05)，但與腫瘤分化程度(P<0.01)和FIGO分期(P=0.01)密切相關(guān)。見表1。

表1 miR-130a與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 血清miR-130a表達(dá)水平在宮頸癌診斷中的價值 以60例宮頸癌患者作為疾病組，60例體檢健康者和38例慢性宮頸炎患者作為對照組，分析血清miR-130a診斷宮頸癌的效能，結(jié)果表明，ROC曲線下面積(AUCROC)為0.878，95%可信區(qū)間(CI)為(0.809～0.947)。當(dāng)cut-off值為0.05時，其敏感性為86.7%，特異性為90.8%。見圖1。

圖1 血清miR-130a診斷宮頸癌的ROC曲線

3 討論

研究表明，在肺癌、肝癌和卵巢癌等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)miR-130a的表達(dá)水平升高，并進一步證實了其可促進腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，可作為腫瘤早期診治的新指標(biāo)[9]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-130a在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平異常升高，并可通過激活NF-κB等信號通路促進癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[4]。血清miR-130a在宮頸癌診斷方面的報道較少，且因其發(fā)揮致癌基因的作用，故本研究選擇血清miR-130a用于宮頸癌診斷研究。

本研究采用熒光定量PCR檢測宮頸癌患者和體檢健康者血清miR-130a表達(dá)水平，結(jié)果表明miR-130a在宮頸癌患者血清中呈高表達(dá)，與其他文獻(xiàn)報道的miR-130a在宮頸癌組織中表達(dá)水平升高較為一致[4-5]。分析宮頸癌患者血清miR-130a表達(dá)升高的原因，可能是癌細(xì)胞的死亡和溶解，或由癌細(xì)胞釋放出miR-130a至血液循環(huán)中所致。在臨床實踐中，外周血采集方便且具有創(chuàng)傷小、可重復(fù)等優(yōu)點，且miRNA穩(wěn)定性強，因此，血清miR-130a有望成為宮頸癌診斷的分子標(biāo)志物。

此外，本研究通過分析宮頸癌患者血清miR-130a表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果表明血清miR-130a表達(dá)在患者年齡和病理類型方面

差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在腫瘤分化程度和FIGO分期方面存在差異，表明miR-130a可能發(fā)揮促進宮頸癌發(fā)展的作用。隨著腫瘤的進展，miR-130a表達(dá)呈現(xiàn)進一步升高的趨勢，Ⅲ～Ⅳ期患者血清miR-130a的相對表達(dá)水平較Ⅰ～Ⅱ期患者明顯升高。此外，宮頸癌患者術(shù)后血清miR-130a表達(dá)水平較術(shù)前明顯降低，說明miR-130a可能用于宮頸癌術(shù)后判斷。血清miR-130a診斷宮頸癌的AUCROC為0.878，敏感性為86.7%，特異性為90.8%，提示血清miR-130a有望成為宮頸癌診斷的一種新型腫瘤標(biāo)志物。雖然本研究檢測的樣本例數(shù)沒有達(dá)到大樣本的要求，但可為今后的大樣本研究提供實驗依據(jù)。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.08

2016年泰州市人民醫(yī)院院級課題指令性項目(ZL201617)。

沙敏，1986年生，女，主管技師，碩士研究生，主要從事臨床腫瘤及相關(guān)檢驗項目研究。

汪佳，副主任醫(yī)師，E-mail:32735644@qq.com。

R711.74

A

2017-05-15)