馮 閣，姚依蘭，黃鳳華，舒 暢，張西鋒

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

納米氧化鋅細(xì)胞毒性的研究

馮 閣，姚依蘭，黃鳳華，舒 暢，張西鋒

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

研究ZnO NPs的細(xì)胞毒性。以ZnO NPs為研究對象，以小鼠睪丸的間質(zhì)細(xì)胞為模型，檢測納米氧化鋅的毒性作用。結(jié)果表明：ZnO NPs顯著抑制了細(xì)胞活力，增加細(xì)胞 LDH和ROS的釋放和產(chǎn)生，造成核DNA的泄露，并伴隨著組蛋白γ-H2AX和RAD51位點(diǎn)的生成，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。ZnO NPs對于LCs細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性。

納米氧化鋅；小鼠；間質(zhì)細(xì)胞；凋亡

1 引言

納米ZnO(ZnO NPs)是一種常見的被廣泛應(yīng)用于各類產(chǎn)品中的金屬氧化物。納米Zno由于粒子尺寸小，比表面大，具有表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)等，表現(xiàn)出許多優(yōu)于普通氧化鋅的特殊性能，如非遷移性、熒光性、壓電性、吸收和散射紫外線能力等，在橡膠、陶瓷、日用化工、涂料、磁性材料等方面具有廣泛的用途[1-3]?？梢灾圃鞖怏w傳感器、熒光體、紫外線遮蔽材料、變阻器、圖像記錄材料、壓敏材料、壓電材料、高效催化劑等，備受人們重視[4]。

ZnO NPs具有一定的生物學(xué)特性，已應(yīng)用于生物傳感器和醫(yī)藥行業(yè)。其在人體上的使用和環(huán)境中的暴露日益增長，納米ZnO極易流入環(huán)境中且難于被回收，因此存在著短期和長期毒性的潛在風(fēng)險。納米氧化鋅顆?？梢酝ㄟ^皮膚、呼吸道、消化系統(tǒng)不同的暴露途徑進(jìn)入生物機(jī)體，作用于不同的生物組織。納米氧化鋅在水中的溶解度較小，但納米顆粒因其結(jié)構(gòu)微小，很容易被吸收進(jìn)入機(jī)體后引發(fā)類似于超微顆粒引起的炎癥反應(yīng)。而且納米顆粒與微米尺度的顆粒相比，引起的炎癥反應(yīng)更加嚴(yán)重，還有導(dǎo)致腫瘤的危險。因此關(guān)于該物質(zhì)在體外和體內(nèi)的負(fù)面效應(yīng)評估得到了更多的關(guān)注[5-6]。

本研究以小鼠睪丸的間質(zhì)細(xì)胞(LCs)為模型，檢測納米氧化鋅的毒性作用，為生產(chǎn)安全有效的納米材料提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

納米ZnO(粒徑大約為70 nm)購自北京DK納米科技公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自Sigma公司，其它所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；MTT、LDH和ROS檢測試劑盒購自Beyotime公司，γ-H2AX和RAD51抗體的一抗和二抗購自abcam公司。

2.2 儀器與設(shè)備

熒光倒置顯微鏡及顯微圖像分析系統(tǒng) Nikon TE2000U；CO2培養(yǎng)箱 Thermo。

2.3 方法

氧化應(yīng)激標(biāo)記物的檢測方法參考試劑盒的說明書進(jìn)行。 細(xì)胞的培養(yǎng)、MTT檢測、LDH檢測、ROS檢測、核DNA泄漏和細(xì)胞的免疫熒光檢測參照文獻(xiàn)7和文獻(xiàn)8[7-8]。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)胞活力的 MTT和LDH釋放的檢測

以細(xì)胞活力和LDH的釋放作為細(xì)胞毒性的檢測。由圖1A所示，LCs細(xì)胞毒性對ZnNPs具有時間和劑量依賴性。在ZnO NPs處理細(xì)胞12 h和24 h后，細(xì)胞活力顯著地降低(P<0.1)。LDH的增長水平也對ZnNPs呈劑量依賴性(圖1B)。一些類型的納米顆粒能夠穿透細(xì)胞膜并積累在線粒體中對其的功能造成影響[9]。因此，可以用MTT實(shí)驗(yàn)來評估細(xì)胞的活力。LDH釋放分析是通過估計(jì)細(xì)胞膜的破裂來評估細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[10]。從圖1A來看，用ZnO NPs處理細(xì)胞12 h之后細(xì)胞活力顯著地降低(P<0.1)，而且隨著ZnO NPs含量的增加也造成培養(yǎng)基中LDH釋放的顯著增加。在ZnO NPs的含量超過10 μg/mL之后，觀察到細(xì)胞LDH的釋放會明顯增加。

3.2 ZnO NPs對LCs胞內(nèi)ROS水平的影響

通過DCFH-DA熒光探針來標(biāo)記來檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。結(jié)果如圖2 所示，胞內(nèi)的ROS水平被DCFH-DA熒光強(qiáng)度進(jìn)行了量化。隨著ZnO NPs的增加，實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度顯著地增加，ZnO NPs通過積累ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激。

圖2 LCs細(xì)胞暴露ZnO NPs后ROS的檢測

3.3 核DNA損傷的檢測

為檢測細(xì)胞對ZnO NPs毒性的應(yīng)答，采用傳統(tǒng)分析方法來檢測ZnO NPs對DNA的損傷。用不同濃度的ZnO NPs處理LCs細(xì)胞。結(jié)果如圖3所示，持續(xù)的處理細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞核DNA泄露且ZnO NPs導(dǎo)致的細(xì)胞核DNA泄露具有劑量依賴性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，導(dǎo)致DNA泄露的ZnO NPs最大處理濃度是20 μg/mL。用15 μg/mL和20 μg/mL的ZnO NPs處理LCs細(xì)胞24 h大約會分別造成27.4%和73.9%的DNA泄露(圖3)。使用15μg/mL的ZnO NPs處理細(xì)胞12 h后，DNA泄露也變得非常明顯(P<0.1)，DNA泄露的數(shù)量越龐大，導(dǎo)致更多的染色體斷裂或是染色體丟失。

圖3 LCs暴露ZnO NPs后DNA的損傷檢測

3.4 ZnO NPs對細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響

高濃度的ZnO NPs處理LCs細(xì)胞會造成顯著地DNA損傷(圖4)。由圖A所示，我們觀察到LCs細(xì)胞中γH2AX的表達(dá)量隨著ZnO NPs濃度的增加而增加；圖B所示，LCs細(xì)胞中RAD51的表達(dá)量也隨著ZnO NPs濃度的增加而增加。

圖4 LCs暴露ZnO NPs后γ-H2AX和Rad51細(xì)胞熒光結(jié)果

4 結(jié)論

細(xì)胞活力測定和LDH的釋放結(jié)果相一致，這些表明LDH的釋放量對ZnO NPs 的暴露量呈劑量依賴性(圖1)。此研究的結(jié)果和先前的其他納米藥物對于LCs細(xì)胞毒性的研究結(jié)果一致[11]。即從細(xì)胞活力和LDH的釋放結(jié)果分析，證實(shí)ZnO NPs 有明顯的細(xì)胞毒性。

ROS作為活體在細(xì)胞代謝中普遍存在，是一種不斷產(chǎn)生的物質(zhì)，又因它的生成被視作促進(jìn)細(xì)胞凋亡的信號，故也被認(rèn)為是納米材料引發(fā)細(xì)胞毒性的中間介質(zhì)[12]。ROS的生成、氧化應(yīng)激和可調(diào)控細(xì)胞不同階段的細(xì)胞信號聯(lián)級放大的擾動，這些都被認(rèn)為是由金屬納米材料造成細(xì)胞損傷和誘發(fā)細(xì)胞凋亡的常規(guī)產(chǎn)物[13-14]。對結(jié)腸癌細(xì)胞暴露ZnO NPs的毒性研究表明，誘發(fā)氧化應(yīng)激是造成其細(xì)胞毒性的關(guān)鍵[15]。ZnO NPs以氧化應(yīng)激為媒介造成HepG2細(xì)胞的DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力的下降。ROS引發(fā)線粒體膜蛋白的下降，同時升高Bax/Bcl2的比例導(dǎo)致以線粒體調(diào)控通路為媒介的細(xì)胞凋亡[16]。同樣，ZnO NPs也會通過上調(diào)Bax，p53和caspase-3，下調(diào)抗凋亡基因Bcl2的表達(dá)來誘導(dǎo)HepG2、MCF-7癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡[17]。

之前有研究表明，來源于JB6C141-5a小鼠表皮的正常細(xì)胞在暴露ZnO NPs之后會經(jīng)由ROS引發(fā)導(dǎo)致自噬體的累計(jì)和線粒體的損傷從而造成細(xì)胞的死亡[18]。 ZnO NPs的細(xì)胞毒性可以用DNA損傷來研究，DNA鏈的斷裂用γH2AX 和 RAD51位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)來測量[19]。外源性因素導(dǎo)致產(chǎn)生的DNA斷裂會存在γH2AX位點(diǎn)的形成，這類組蛋白會在雙鏈DNA(DSB)斷裂位點(diǎn)被迅速磷酸化，但是在松弛的染色體和單鏈DNA中也會出現(xiàn)這樣的位點(diǎn)[20]。DSBs上的RAD51蛋白募集在同源重組中修復(fù)DSBs起到至關(guān)重要的作用[21]。研究表明ZnO NPs會引發(fā)大鼠早期神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、人類幼成淋巴細(xì)胞、大鼠腎上皮細(xì)胞和人類結(jié)腸癌細(xì)胞的DNA損傷[22-23]。

rH2AX 和RAD51是兩種重要的DNA損傷修復(fù)蛋白，它們可以立即保護(hù)DNA的合成和避免不利的內(nèi)源性和外源性的因素使新生DNA過度延伸[24-25]。ROS在細(xì)胞凋亡和DNA損傷調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵作用。如圖2所示，ROS的信號隨著ZnO NPs的增加逐漸增強(qiáng)，與核DNA泄露檢測的結(jié)果一致(圖3)。

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Research on cytotoxicity of ZnO NPs

FENGGe，YAOYi-lan，HUANGFeng-hua，SHUChang,ZHANGXi-feng

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

The aim of this study was to investigate the potential toxicity of zinc oxide (ZnO) NPs in vivo systems using male mouse Leydig cells(LCs). LCs were treated with ZnO NPs, the result shows that ZnO NPs effectively inhibits cell viability, the increase leakage of LDH and the fluorescence intensity about ROS was significantly higher in the ZnO-NP-treated group of cells than in the control group, ZnO NPs resulting in nuclear DNA leakage nuclear DNA leakage, accompanying histone γ-H2AX and RAD51 foci, lead to the celluar apoptosis finally. ZnO NPs has cytotoxicity, which provides the reference for the development of sustainable and safer nanomaterials.

ZnO NPs; mice; leydig cell;poptosis

2017-04-18.

馮閣(1995-)，女，碩士研究生，E.mail:834413034@qq.com.

張西鋒(1977-)，男，博士，副教授，E.mail:zhangxf9465@163.com.

國家自然科學(xué)基金(B020704).

2095-7386(2017)02-0026-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.02.005

TB 383；R 114

A