邱帥，吳光洪，陳徐平，郭娟，魏建芬，沈柏春，胡紹慶

（1.杭州市園林綠化股份有限公司，杭州310020；2.浙江理工大學(xué)建筑工程學(xué)院，杭州310018）

基于相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記的桂花栽培品種演化分析

邱帥1，吳光洪1，陳徐平1，郭娟1，魏建芬1，沈柏春1，胡紹慶2*

（1.杭州市園林綠化股份有限公司，杭州310020；2.浙江理工大學(xué)建筑工程學(xué)院，杭州310018）

為了進(jìn)一步揭示桂花栽培品種的演化歷程，為桂花育種工作提供借鑒，采用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)，對(duì)45份桂花材料進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，以木犀屬中最為原始的牛矢果（Osmanthus matsumuranus）為外部群體，構(gòu)建桂花栽培品種系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，計(jì)算不同演化水平兩性花品種的比例，分析桂花性別系統(tǒng)進(jìn)化情況。結(jié)果顯示：10對(duì)高多態(tài)性引物共檢測(cè)到137個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物13.7個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性信息含量為0.202 8～0.302 7；Nei遺傳多樣性指數(shù)為0.220 3～0.350 2；Shannon多樣性信息指數(shù)為0.348 3～0.519 3。45份桂花材料分為7個(gè)亞群和1個(gè)混合群體，亞群間遺傳分化明顯，基因交流較少。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)表明，桂花栽培品種演化歷程大致分為10個(gè)階段，大部分銀桂品種和四季桂品種最先形成，雄性丹桂品種最晚形成，其他品種處于演化的中間階段。兩性花品種比例隨著演化水平的增高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，證明桂花的雄全異株性別系統(tǒng)是雌雄同花演化為雌雄異株的中間狀態(tài)。此外，桂花花色連續(xù)變異可能受到多個(gè)CCDs家族同源基因突變的影響，而遺傳漂變導(dǎo)致新等位基因丟失，這可能是野生桂花罕見(jiàn)橙紅色個(gè)體的原因。

桂花；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性；群體結(jié)構(gòu)；演化

SummarySweet osmanthus(Osmanthus fragrans)is one of the top ten famous native horticultural plants in China. According to different flowering seasons,flower colors and inflorescence types,the cultivars are divided into four groups: O.fragrans Asiaticus Group,O.fragrans Albus Group,O.fragrans Luteus Group and O.fragrans Aurantiacus Group. Despite long-term cultivation of Osmanthus,little information was recorded on the formation of so many cultivars.O. fragrans Asiaticus Group was considered as the most primitive cultivars,and the ones with light color flowers formed earlier,then followed by deep color flowers.The cluster results based on various types of molecular markers were quite different from traditional classification system,indicating diversity of phenotypic traits might account for a tiny part of the whole genetic diversity of sweet osmanthus.However,at present,few studies can give evidence to further understand the evolution process of sweet osmanthus cultivars.

In this study,to further understand the evolution theory,a rooted phylogenetic tree for the cultivars of sweetosmanthus was constructed based on population structure analysis through sequence-related amplified polymorphism (SRAP)technology.Forty-five cultivars were used as plant materials;O.heterophyllus,O.fordii,O.cooperi“Yujie”and O. cooperi“Xuegui”were used as controls,and O.matsumuranus was used as an outgroup.Ten pairs of SRAP primers with high polymorphism were applied to amplify DNA of all samples,and the fragments were examined by capillary electrophoresis.POPGENE 1.32 software was applied to analyze genetic diversity and genetic differentiation.Structure 2.34 software was used to analyze population structure and divide cultivars into subgroups.Nei’s genetic distance among subgroups was calculated by NTSYSpc,then applied to construct a rooted phylogenetic tree by MEGA 6.The rate of hermaphrodite flower cultivars on each level of the phylogenetic tree was calculated to understand the sexual system evolution.Moreover,the genetic mechanism of flower color variation for sweet osmanthus was further speculated based on the result.

Results showed that the 10 pairs of SRAP primers produced 137 polymorphic bands among all the samples with an average of 13.7 bands per primer.Polymorphism information content ranged from 0.202 8 to 0.302 7,with an average of 0.250 7.Nei’s genetic diversity index ranged from 0.220 3 to 0.350 2,with an average of 0.283 5.The Shannon’s genetic diversity index ranged from 0.348 3 to 0.519 3,with an average of 0.436 4.There was significant population structure among sweet osmanthus cultivars,and 36 cultivars could be divided into seven subgroups with simple genetic background. Nine cultivars had complicated genetic background,which were identified as a mixed group.Gene differentiation coefficient(Gst)was 51.32%among subgroups,much higher than that of four cultivar groups.Moreover,less gene flow was observed among subgroups than that of four cultivar groups.These results indicated that the cultivars in the same subgroup had much closer genetic relationship than those in the same cultivar group.Using subgroups as the unit of evolution,a rooted phylogenetic tree was constructed.The sweet osmanthus cultivation had experienced about 10 stages(A-J level): subgroup 3 composed of major cultivars in O.fragrans Asiaticus Group and O.fragrans Albus Group formed first,and subgroup 5 composed of the male cultivars in O.fragrans Aurantiacus Group formed the latest,and the cultivars in O. fragrans Luteus Group formed in each stage after D level.With the evolution process,the rate of hermaphrodite flower cultivars dramatically reduced,proving that androdioecy sexual system of sweet osmanthus originated from monoecism. Moreover,the flower color of sweet osmanthus may be controlled by multiple homologous genes in the CCDs family,and the mutations resulted in flower color changing continuously from white to orange red.Loss of new alleles due to genetic drift led to rare individuals with orange red flower in wild population.

In conclusion,a new efficient method is offered to further understand the process for formation of sweet osmanthus cultivars and provide a significant reference for genetic mechanism study on evolution of flower colors.

人類(lèi)早在農(nóng)耕時(shí)代就已經(jīng)開(kāi)始了植物馴化，但對(duì)常見(jiàn)栽培植物的起源仍然未知；直到達(dá)爾文進(jìn)化論的創(chuàng)立和孟德?tīng)栠z傳定律的提出，人們才對(duì)植物栽培品種的形成有了科學(xué)的認(rèn)識(shí)，并通過(guò)育種，使植物栽培品種的形成速度遠(yuǎn)超過(guò)去[1]。另一方面，栽培品種育種工作也為進(jìn)化論和遺傳學(xué)的發(fā)展提供了大量數(shù)據(jù)支持。研究表明，栽培植物演化模式包括突變、重組、選擇、隔離和漂變，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子標(biāo)記等現(xiàn)代生物技術(shù)從這5個(gè)方面輔助植物育種工作，加快了育種進(jìn)度。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)植物培育過(guò)程進(jìn)行資料分析是研究栽培植物演化最有效的途徑[1]。17—18世紀(jì)，歐洲從亞洲和美洲引進(jìn)大量野生種，開(kāi)展了一系列選育工作，培育出一大批栽培植物，并且詳細(xì)記錄了百合（Lilium brownie）[2]、郁金香（Tulipa gesneriana）[3]、報(bào)春花（Primula malacoides）[1]和四季海棠（Begonia semperflorens）[1]等觀(guān)賞植物的培育過(guò)程，為栽培植物演化研究提供了重要資料。因此，研究栽培植物品種的演化對(duì)進(jìn)化論、遺傳學(xué)的發(fā)展以及栽培植物的培育工作都有重要意義。

桂花（Osmanthus fragrans）系木犀科（Oleaceae）木犀屬（Osmanthus）木犀組（Sect.Osmanthus）植物，為中國(guó)十大名花之一[4]，其品種類(lèi)型豐富，近緣物種類(lèi)群清楚，是研究栽培植物起源和進(jìn)化的極好材料。但在長(zhǎng)期栽培歷史中，桂花人工培育資料嚴(yán)重缺失，只能從古人的詩(shī)詞歌賦和花的性狀推測(cè)四季桂品種群最為原始，秋桂品種按照花色由淺至深逐漸分化，丹桂來(lái)源于芽變[4]。但由于古人對(duì)桂花的描寫(xiě)往往經(jīng)過(guò)藝術(shù)加工，其表型與基因型之間可能會(huì)有差異[5]，因此栽培品種演化仍然存在許多疑點(diǎn)，無(wú)法科學(xué)指導(dǎo)育種工作，這也是桂花栽培品種數(shù)遠(yuǎn)少于其他觀(guān)賞植物的原因之一。

系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)能夠反映共同祖先的種或品種的演化關(guān)系，是研究選育資料稀缺的植物栽培品種演化歷程的有效手段[5]。目前已使用核基因組（nDNA）、葉綠體基因組（cpDNA）和線(xiàn)粒體基因組（mtDNA）中單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因構(gòu)建了中國(guó)簇毛黃耆亞屬（Pogonophace）[6]、大黃（Rheum officinale Baill.）[7]、木通科（Lardizabalaceae）[8]、鳶尾屬（Iris）[9]、七筋菇屬（Clintonia）[10]等多個(gè)植物科、屬、種系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，但單一或少量基因不夠全面。研究表明，分子標(biāo)記能夠揭示DNA序列差異，通過(guò)對(duì)整個(gè)基因組隨機(jī)或選擇性?huà)呙?，全面反映物種、品種和群體間的遺傳差異，不受環(huán)境影響。目前，將多種分子標(biāo)記結(jié)果與DNA序列研究結(jié)果進(jìn)行綜合分析已經(jīng)成為植物演化研究趨勢(shì)[5]。近年來(lái)，ISSR、RAPD、AFLP、SRAP、SSR和SCoT等多種分子標(biāo)記被應(yīng)用于桂花品種分類(lèi)和遺傳多樣性研究，構(gòu)建了多張桂花品種聚類(lèi)分析圖譜[11-16]，但由于沒(méi)有選擇合適的外部群體，只能反映不同栽培品種的親緣關(guān)系，無(wú)法確定演化方向。圓錐花序組在現(xiàn)代木犀屬4組中最為原始，是包括桂花在內(nèi)的木犀組植物的共同祖先；牛矢果（O.matsumuranus）作為圓錐花序組中僅有的6個(gè)種之一[17]，是構(gòu)建桂花栽培品種系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的理想外部群體。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）是一種新型分子標(biāo)記，該標(biāo)記根據(jù)外顯子富含GC而啟動(dòng)子、內(nèi)含子富含AT設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，具有高效、操作簡(jiǎn)單、無(wú)需基因組信息、引物通用、成本低、有較高共顯性和在基因組內(nèi)均勻分布等顯著優(yōu)點(diǎn)，是演化分析的理想標(biāo)記[18]。SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)，存在操作復(fù)雜、低通量、影響因素較多、分辨率較低、試劑毒害大和需要人工判斷帶型數(shù)據(jù)等諸多缺點(diǎn)，而毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillary electrophoresis，CE）能夠克服以上缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)無(wú)毒害、高通量、自動(dòng)化、高分辨率、穩(wěn)定的DNA快速檢測(cè)[19]。李婷婷等[20]將SRAP分子標(biāo)記技術(shù)與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，獲得不同種源櫸樹(shù)（Zelkova schneideriana）大量穩(wěn)定可靠的標(biāo)記數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)70個(gè)櫸樹(shù)優(yōu)良單株進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建了DNA指紋圖譜，表明CE-SRAP在植物進(jìn)化和品種鑒定研究中具有巨大潛力。

在野生植物逐漸栽培化的過(guò)程中，作為人工選育的重要依據(jù)，觀(guān)賞性狀會(huì)強(qiáng)烈影響選擇環(huán)節(jié)，導(dǎo)致栽培品種中優(yōu)勢(shì)基因型增加?；ㄉ鳛楣鸹ǖ闹匾^(guān)賞性狀之一，其變化在一定程度上重演了桂花栽培品種的演變過(guò)程[21]，因此有必要將花色變異與DNA分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，以揭示其遺傳演化規(guī)律。此外，生物進(jìn)化中許多基本問(wèn)題都涉及交配過(guò)程，植物性別系統(tǒng)通過(guò)影響交配系統(tǒng)進(jìn)而決定種群基因型頻率、基因流和選擇等多個(gè)進(jìn)化因素[22]。桂花獨(dú)特的功能型雄全異株性別系統(tǒng)[23]是否會(huì)影響花色等觀(guān)賞性狀基因型頻率，從而決定栽培品種的演化歷程值得進(jìn)一步探討。

本研究通過(guò)SRAP分子標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)45份桂花材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，使用亞群作為演化單位，以木犀屬中最為原始的種牛矢果為外部群體，構(gòu)建桂花品種的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，分析桂花性別系統(tǒng)進(jìn)化，以期為桂花品種演化理論的研究提供新的方法。此外，根據(jù)現(xiàn)有研究推測(cè)桂花花色進(jìn)化模式，為進(jìn)一步揭示桂花花色進(jìn)化遺傳機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用45份桂花（Osmanthus fragrans Lour.）材料，以木犀屬華東木犀（O.cooperi）的2個(gè)品種“玉潔”和“雪桂”、柊樹(shù)（O.heterophyllus）和石山桂（O. fordii）作為對(duì)照，以木犀屬牛矢果（O.matsumuranus）作為外部群體（附表1，http://www.zjujournals.com/ agr/EN/article/showSupportInfo.do?id=10492）。所有材料均取自杭州市園林綠化股份有限公司青山湖基地桂花種質(zhì)資源圃。采集新鮮葉片，迅速裝入冰袋中，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1DNA提取

取0.5～1.0 g葉片于液氮中速凍后快速研磨至粉末，使用BIOTEKE植物基因組快速提取試劑盒（購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取DNA。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并使用NanoDropTM2000/2000c（購(gòu)自Thermo公司，美國(guó)）測(cè)定濃度，稀釋至20～50 ng/μL，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SRAP聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

采用10 μL反應(yīng)體系：20～50 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L正反引物各1 μL，2×Power Taq PCR MasterMix（百泰克試劑盒，北京）5 μL，雙蒸水2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性8 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸90 s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，59.3℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min；4℃保存。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）產(chǎn)物使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以篩選引物。10個(gè)正向引物和9個(gè)反向引物（表1）組成90對(duì)引物組合，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。使用篩選出的引物組合對(duì)50個(gè)供試材料進(jìn)行SRAPPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物參照李婷婷等[20]的方法，使用全自動(dòng)核酸蛋白分析系統(tǒng)Qsep100（購(gòu)自Bioptic公司，中國(guó)臺(tái)灣）進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，以DNA標(biāo)準(zhǔn)品（5 000 bp DNA Ladder）標(biāo)定擴(kuò)增條帶大小，使用QEditor軟件（Bioptic公司，中國(guó)臺(tái)灣）記錄峰值圖和毛細(xì)管模擬電泳圖，結(jié)合人工判斷，輸出標(biāo)記數(shù)據(jù)，并轉(zhuǎn)化為0或1。

表1SRAP引物序列Table 1Sequences of SRAP primers

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用POPGENE 1.32[24]分析桂花栽培品種的遺傳多樣性，計(jì)算觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon多樣性信息指數(shù)(I)、總?cè)后w基因多樣性指數(shù)（Ht）、種群內(nèi)基因多樣性指數(shù)（Hs）、種群間遺傳分化系數(shù)（Gst）和Nei遺傳距離。桂花群體結(jié)構(gòu)分析使用Structure 2.34[25]中的混合模型（admixture model）對(duì)45份桂花材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。使用NTSYSpc v2.10e計(jì)算亞群間的Nei遺傳距離，導(dǎo)入MEGA 6[26]，以牛矢果為外部群體，采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建桂花亞群有根系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，并分析桂花品種、花色和性別系統(tǒng)的演化歷程。

2 結(jié)果與分析

2.1SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果

從90對(duì)SRAP引物組合中篩選出10對(duì)擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰的引物組合，對(duì)50個(gè)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增。毛細(xì)管電泳檢測(cè)（附圖1，http://www. zjujournals.com/agr/EN/article/showSupportInfo.do?id= 10492）和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）表明：總共檢測(cè)到137個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物13.7個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性信息含量（polymorphism information content,PIC）為0.202 8～0.302 7，平均為0.250 7；Nei遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.220 3～0.350 2，平均為0.283 5；Shannon多樣性信息指數(shù)（I）為0.348 3～0.519 3，平均為0.436 4。

表2SRAP擴(kuò)增結(jié)果Table 2Results of SRAP amplification

2.2 桂花群體結(jié)構(gòu)分析

Structure 2.34軟件模擬結(jié)果（圖1A）表明：隨著不做數(shù)迭代的長(zhǎng)度從1萬(wàn)增加至10萬(wàn)，ln P(D)的離散程度先減少后增加；在7.5萬(wàn)時(shí)，離散程度最低，模擬的結(jié)果最穩(wěn)定可靠。設(shè)定估計(jì)的亞群數(shù)K值為1～10，計(jì)算相對(duì)應(yīng)的ln P(D)和Q值（第i品種的基因組變異源于第k群體的概率），每個(gè)K值運(yùn)行5次。結(jié)果表明，在K=7時(shí)，ln P(D)最大且為拐點(diǎn)（圖1B）。由此判斷，45份桂花材料具有明顯的群體結(jié)構(gòu)，可分為7個(gè)亞群體。

以K=7繪制群體結(jié)構(gòu)圖（圖2）。45份桂花材料中有36個(gè)（占80%）在某個(gè)亞群體中的Q值大于或等于0.5，說(shuō)明這些桂花品種遺傳組分相對(duì)單一。36份桂花材料可分為7個(gè)亞群：亞群1包含“綠梗籽銀桂”、“籽銀桂”、“寬葉籽銀桂”、“潢川金桂”和“天香臺(tái)閣”；亞群2包含“金球桂”、“波葉金桂”、“火煉金丹”和“火煉金丹”（跳枝）；亞群3包含“青尖”、“小葉蘇桂”、“玉簾銀絲”、“串銀球”、“大葉銀桂”、“米花籽銀桂”、“杭州黃”、“早籽黃”、“大花金桂”、“四季桂”、“圓葉四季桂”、“大葉佛頂珠”、“橙黃四季桂”、“日香桂”和“淡妝”，其中除“大花金桂”外，其他都為四季桂和銀桂品種；亞群4包含“金秋早”、“堰虹桂”、“四季桂黃”和“墨寶香”；亞群5包含“狀元紅”、“朱砂丹桂”、“醉肌紅”和“橙紅丹桂”；亞群6包含“速生丹桂”和“蓮籽丹桂”；亞群7包含“彩葉桂”和“天女散花”。“早銀桂”、“廬州黃”、“叢中笑”、“硬葉丹桂”、“玉玲瓏”、“矮黃”、“雄黃桂”、“白潔”和“晚銀桂”9個(gè)品種在任意亞群體的Q值均小于0.5，表明這些桂花品種遺傳背景復(fù)雜，劃分為一個(gè)混合群體，即亞群8。

圖1Structure軟件參數(shù)估算Fig.1Parameter estimate for Structure software

圖245 份桂花材料群體結(jié)構(gòu)圖Fig.2Population structure of 45 sweet osmanthus materials

2.3 桂花品種遺傳分化分析

以137個(gè)SRAP多態(tài)性位點(diǎn)分析桂花4個(gè)品種群和8個(gè)亞群的遺傳多樣性和遺傳分化。結(jié)果（表3）表明：45份桂花材料總體觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon多樣性信息指數(shù)（I）和多態(tài)性位點(diǎn)百分比（polymorphic loci percentage,PPL）分別為1.890 5、1.443 0、0.264 3、0.404 2和89.05%；4個(gè)桂花品種群的Na與Ne分別為1.627 7～1.788 3和1.349 8～1.429 0，H與I分別為0.205 9～0.252 2和0.311 6～0.382 0，PPL為62.77%～78.83%；桂花8個(gè)亞群的Na、Ne、H、I和PPL分別為1.058 4～1.729 9、1.041 3～ 1.403 6、0.024 2～0.239 5、0.035 3～0.362 8和5.84%～72.99%?；旌先后w的遺傳多樣性明顯高于其他亞群，這也表明混合群體中的桂花品種遺傳背景相對(duì)復(fù)雜。

4個(gè)桂花品種群總?cè)后w基因多樣性指數(shù)（Ht）為0.262 9，品種群內(nèi)基因多樣性指數(shù)（Hs）為0.233 6，種群間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為11.14%，基因流（Nm）為3.989 7，存在較廣泛的基因交流。8個(gè)桂花亞群的Ht、Hs、Gst和Nm分別為0.275 4、0.134 1、51.32%和0.474 4。亞群間的遺傳變異大于亞群內(nèi)的變異，亞群間有較為明顯的分化，且基因交流極少，而各亞群內(nèi)的品種遺傳背景較為單一。

表3 桂花亞群和栽培品種群的SRAP標(biāo)記遺傳多樣性分析Table 3Genetic diversity analysis of subgroups and cultivar groups of sweet osmanthus based on SRAP markers

2.4 桂花品種系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

桂花亞群的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖3）表明，在桂花品種的進(jìn)化歷程中，大致經(jīng)歷了10個(gè)階段：在水平A處，木犀屬演化成圓錐花序組（牛矢果作為外部群體）和木犀組（華東木犀、柊樹(shù)、石山桂和桂花）；在B水平處，木犀組演化成桂花；在C水平處，桂花最先形成亞群3和Ⅰ2大群體，Ⅰ類(lèi)在D水平處形成Ⅱ和Ⅲ類(lèi)；在水平E處，Ⅱ類(lèi)分化為Ⅳ和四季桂品種“矮黃”；在水平F處，Ⅳ類(lèi)演化成Ⅴ和Ⅵ2類(lèi)；在G水平處，Ⅴ類(lèi)演化成Ⅶ和亞群4；在水平H處，Ⅲ類(lèi)演化成Ⅹ和銀桂品種“廬州黃”，Ⅶ類(lèi)形成Ⅷ和Ⅸ2類(lèi)；在水平I處，形成桂花亞群6、“晚銀桂”以及5個(gè)小類(lèi)；在J水平處，5個(gè)小類(lèi)分別演化成4個(gè)亞群和10個(gè)桂花品種。

亞群3（sub 3）是最早分化出的一個(gè)亞群，為桂花中最原始的一類(lèi)，57.1%的銀桂品種和50%的四季桂品種聚在該亞群。這表明大部分四季桂和銀桂是桂花中較為原始的品種，且親緣關(guān)系較近。部分四季桂與銀桂品種處于較晚的分支。具兩性花丹桂品種與具單性雄花丹桂品種處于2個(gè)獨(dú)立分支，且前者早于后者形成。金桂品種幾乎均勻分布于D水平后的各分支上。丹桂品種“火煉金丹”與金桂品種“金球桂”、“波葉金桂”極其相似，并且“金球桂”能夠芽變成丹桂顏色，而“火煉金丹”可以芽變成金桂顏色，這3個(gè)品種以及“火煉金丹”芽變枝構(gòu)成亞群2（sub 2），與“雄黃桂”處于同一分支。

圖3 桂花亞群的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3Phylogenetic tree of sweet osmanthus

2.5 桂花性別系統(tǒng)進(jìn)化分析

兩性花品種比例隨著桂花演化進(jìn)程逐漸下降，且較早聚在一起（表4）：45個(gè)桂花品種兩性花總體比例為29%，在水平C處，兩性花比例為27%，從水平D到水平F，Ⅰ類(lèi)逐漸分化出Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ，其兩性花比例依次下降為21%、18%、0%；在較早的水平D和F處，Ⅰ類(lèi)中大部分兩性花品種聚集成Ⅲ類(lèi)和Ⅵ類(lèi)。此現(xiàn)象表明桂花的雄全異株性別系統(tǒng)起源于雌雄同株，是雌雄同花演化為雌雄異株的中間狀態(tài)。

表4 桂花性別系統(tǒng)演化Table 4Sexual system evolution of Osmanthus fragrans

3 討論

3.1 桂花栽培品種的演化單位

植物的進(jìn)化以群體為單位，其本質(zhì)為群體結(jié)構(gòu)的變化，即群體基因頻率和基因型頻率的變化[27]，因此，選擇合適的劃分依據(jù)確定研究群體是桂花品種演化研究的關(guān)鍵。中性學(xué)說(shuō)認(rèn)為DNA或蛋白的中性突變?cè)谶M(jìn)化中起主導(dǎo)作用，是遺傳多樣性的來(lái)源，中性突變不引起植物的性狀變異，即無(wú)選擇意義[28]。而多種分子標(biāo)記的桂花品種聚類(lèi)分析結(jié)果都與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)存在較多差異[11-16]，表明少數(shù)表型性狀的差異只占整個(gè)基因遺傳多樣性的一小部分，以此為依據(jù)劃分的4大桂花栽培品群可能并不適合作為品種演化的研究單位。群體結(jié)構(gòu)分析表明，桂花栽培品種具有明顯的群體結(jié)構(gòu)，36個(gè)桂花材料可分為7個(gè)亞群，而4個(gè)栽培品群遺傳背景復(fù)雜，都出現(xiàn)了多個(gè)亞群遺傳混雜的現(xiàn)象。亞群間的遺傳分化系數(shù)遠(yuǎn)高于品種群間，亞群間的基因流明顯小于品種群間。在本研究中，“火煉金丹”芽變枝與“火煉金丹”同屬于亞群2，而“彩葉桂”與四季桂品種“天女散花”同屬于亞群7，而按照傳統(tǒng)分類(lèi)則屬于不同品種群，這進(jìn)一步證明群體結(jié)構(gòu)能較為全面地反映品種間的親緣關(guān)系，劃分的亞群比4大品種群更適合作為演化單位。以亞群為單位構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)較為完整地還原了桂花品種的演化歷程，本研究結(jié)果表明大部分四季桂品種和銀桂品種最先形成，雄性丹桂品種最后形成，其他品種處于中間階段，證明淡色花為原始性狀，深色花為進(jìn)化性狀。此外，演化進(jìn)程和性別比例的變化證明兩性花為原始性狀，單性花為進(jìn)化性狀。兩性花丹桂品種遠(yuǎn)早于單性花丹桂品種形成，表明兩種性別的丹桂品種可能具有不同起源。

3.2 桂花繁育系統(tǒng)

基因突變?yōu)樯镞M(jìn)化提供了原始物質(zhì)基礎(chǔ)，而重組則提供了進(jìn)一步的變異，說(shuō)明重組無(wú)論在進(jìn)化還是育種過(guò)程中都具有重要作用[1]。植物繁育系統(tǒng)本質(zhì)上就是控制重組事件的所有有性特征，其中性別系統(tǒng)和交配系統(tǒng)對(duì)后代遺傳成分影響極大，一直是繁育系統(tǒng)的研究重點(diǎn)[29]。雄全異株是一種獨(dú)特且稀少的性別系統(tǒng)，處于雌雄同花和雌雄異株的過(guò)渡狀態(tài)，其起源一直存在爭(zhēng)議[30]。目前，大部分觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為雄全異株起源于雌雄異株[31]。郝日明等[23]根據(jù)野生桂花性別比例證明桂花性別系統(tǒng)為功能型雄全異株；徐沂春[15]從桂花具有不同狀態(tài)退化雌蕊的現(xiàn)象推測(cè)桂花的雄全異株起源于雌雄同株。在本研究中兩性花品種比例隨著桂花栽培品種演化進(jìn)程逐漸下降，在一定程度上證明了徐沂春[15]的推測(cè)，但不排除人工選擇對(duì)兩性花比例的影響。張洪偉[32]和李稚[33]的研究都表明，桂花為自交和異交相混合的兼性交配系統(tǒng)，風(fēng)媒和蟲(chóng)媒都可以進(jìn)行傳粉，但訪(fǎng)花昆蟲(chóng)種類(lèi)較少，訪(fǎng)花頻率不高。一般認(rèn)為自交來(lái)源于異交，且不可逆[34]，但隨著單性雄性比例增加，桂花異交比例不可避免地增加，暗示桂花的異交可能來(lái)源于自交。徐沂春[15]研究發(fā)現(xiàn)，野生桂花群體間遺傳分化較低且存在頻繁的基因交流，也表明野生桂花異交可能占據(jù)主導(dǎo)；這與黃蓉花屬（Dalechampia）[35]相似。但隨著野生桂花資源的流失，近交概率逐漸增加，導(dǎo)致桂花遺傳多樣性顯著減少，群體間遺傳愈加分化，而人工選擇更加阻斷了基因交流，加速了遺傳分化。本研究栽培品種亞群間分化系數(shù)達(dá)到51.32%，表現(xiàn)出明顯的分化。但桂花的繁育系統(tǒng)進(jìn)化以及對(duì)野生群體和栽培品種演化的影響仍然存在許多未知，需要進(jìn)一步研究。

3.3 桂花花色進(jìn)化的遺傳機(jī)制推測(cè)

花色作為植物最重要的觀(guān)賞性狀之一，其進(jìn)化遺傳機(jī)制一直是遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)，花色改良也是觀(guān)賞植物育種的重要目標(biāo)。豐富多彩的花色主要由花瓣中的色素種類(lèi)和含量決定，此外，光照、溫度等環(huán)境因素和液泡pH、色素共著色和金屬離子含量等內(nèi)環(huán)境也對(duì)花色具有重要影響[36-38]。研究表明，植物花朵中含有的色素主要有類(lèi)黃酮（flavonoid）、類(lèi)胡蘿卜素（carotenoid）及生物堿（alkaloid）[36]。

一般認(rèn)為，桂花花色演化順序?yàn)榘咨?黃色-橙紅色[39]，這與本研究構(gòu)建的桂花品種系統(tǒng)發(fā)生基本一致，但對(duì)于桂花花色進(jìn)化的遺傳機(jī)制仍然未知。已有的研究從生理和基因?qū)用骊U述了桂花花色決定機(jī)制，即類(lèi)胡蘿卜素在花瓣中的種類(lèi)和含量差異是導(dǎo)致桂花花色不同的主要原因：白色花瓣中幾乎不含有類(lèi)胡蘿卜素，黃色花瓣中主要積累β-胡蘿卜素，橙紅色花瓣中大量積累α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素，而CCD4基因差異表達(dá)導(dǎo)致了不同品種花瓣中類(lèi)胡蘿卜素含量的差異[40-41]。研究表明，類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases, CCDs）能夠降解類(lèi)胡蘿卜素[42]，且桂花CCD4基因也可以裂解β-胡蘿卜素等類(lèi)胡蘿卜素[43]。菊花白色花瓣的CmCCD4a轉(zhuǎn)錄水平顯著高于黃色花瓣，通過(guò)RNA干擾使該基因的表達(dá)沉默后，花瓣變?yōu)辄S色[44]。因此可以推測(cè)，CCD4基因的突變可能是桂花芽變?yōu)槌燃t花色的原因之一。

本文對(duì)桂花花色是否也為單個(gè)基因控制的質(zhì)量性狀進(jìn)行了探討。假設(shè)桂花花色由CCD4單基因控制，CCD4原有等位基因?yàn)锳，基因突變產(chǎn)生的功能缺失型等位基因?yàn)閍，則純合體aa無(wú)法降解類(lèi)胡蘿卜素，花色為橙紅色，純合體AA能產(chǎn)生CCDs，降解類(lèi)胡蘿卜素，花色為白色，雜合體Aa能產(chǎn)生少量CCDs，花色表現(xiàn)為黃色。在理想群體中，應(yīng)該只出現(xiàn)白色、黃色和橙紅色3種花色的個(gè)體，且保持一定比例，但目前已發(fā)現(xiàn)的野生桂花群體中，花色都表現(xiàn)為淡黃白色，而栽培品種的花色則表現(xiàn)為由淺至深的連續(xù)變異。說(shuō)明桂花花色可能是由多基因決定的數(shù)量性狀，多基因位點(diǎn)的加性效應(yīng)累積導(dǎo)致桂花花色的連續(xù)變異。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)CCDs家族的9個(gè)同源基因分布于不同染色體上[45]，且CCD1基因功能的缺失會(huì)導(dǎo)致擬南芥種子中類(lèi)胡蘿卜素的積累[43]?？梢酝茰y(cè)，桂花基因組中可能含有CCDs家族的多個(gè)同源基因共同調(diào)控花色。

野生桂花和栽培品種中橙紅色花色個(gè)體比例差異極大是桂花花色進(jìn)化的另一個(gè)疑點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，桂花野生群體規(guī)模較小，彼此之間相互隔離[46]，突變產(chǎn)生的CCDs功能缺失型等位基因拷貝極少，單性雄性個(gè)體的比例遠(yuǎn)高于兩性株[23]，突變產(chǎn)生的新等位基因極有可能只通過(guò)花粉遺傳到下一代；因此，新等位基因的遺傳漂變可能是桂花野生群體中罕見(jiàn)橙紅色花色個(gè)體的原因。而橙紅色花色一直視為桂花中的珍品，長(zhǎng)期的人工選擇使具橙紅色花色的栽培品種較為常見(jiàn)?？紤]到桂花雜交的難度和較長(zhǎng)的時(shí)間周期，很難通過(guò)構(gòu)建遺傳連鎖圖進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）定位，而關(guān)聯(lián)分析無(wú)需構(gòu)建雜交群體，利用自然群體即可對(duì)桂花花色、花型和花香等觀(guān)賞性狀的遺傳機(jī)制進(jìn)行研究。因此，在未來(lái)的工作中，可利用關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

基于SRAP分子標(biāo)記的群體結(jié)構(gòu)較好地反映了桂花品種間的親緣關(guān)系，以此為單位構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)表明：桂花的進(jìn)化歷程大致分為10個(gè)階段（A～J水平），由銀桂品種和四季桂品種構(gòu)成的亞群3最先形成，由雄性丹桂品種構(gòu)成的亞群5最晚形成，金桂品種較為均勻地分布于D水平后的各分支上，為桂花品種的演化理論提供了有益的補(bǔ)充。在桂花演化歷程中，兩性花品種比例逐漸降低，證明兩性花是原始性狀，其雄全異株性別系統(tǒng)起源于雌雄同株，是雌雄同花演化為雌雄異株的中間狀態(tài)。此外，本研究推測(cè)桂花花色由CCDs家族的多個(gè)同源基因共同調(diào)控，由于較小的群體和功能型雄全異株的性別系統(tǒng)，遺傳漂變?cè)诨ㄉM(jìn)化過(guò)程中起主導(dǎo)作用，使得CCDs功能缺失型的突變等位基因喪失，造成野生桂花罕見(jiàn)橙紅色花色植株。這為桂花花色遺傳機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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Evolution analysis of sweet osmanthus(Osmanthus fragrans)cultivars based on sequence-related amplified polymorphism molecular marker.

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QIU Shuai1,WU Guanghong1,CHEN Xuping1,GUO Juan1,WEI Jianfen1,SHEN Baichun1,HU Shaoqing2*(1.Hangzhou Landscaping Incorporated,Hangzhou 310020,China;2.School of Civil Engineering and Architecture,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China)

sweet osmanthus(Osmanthus fragrans);sequence-related amplified polymorphism;population structure; evolution

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.08.241

浙江省花卉新品種選育重大科技專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2012C12909-3，2016C02056-12）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31170656）。

胡紹慶(http://orcid.org/0000-0001-6153-9294)，E-mail:1069060899@qq.com

（First author）：邱帥（http://orcid.org/0000-0002-0573-6864），E-mail:370140875@qq.com

2016-08-24；接受日期(Accepted):2016-10-17

Q 37

A