岳海梅，莊華，潘朝暉，鞏文峰

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100；3.西藏高原生態(tài)研究所，西藏林芝860000）

藏東南地區(qū)毛殼屬真菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

岳海梅1*，莊華2，潘朝暉3，鞏文峰11

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100；3.西藏高原生態(tài)研究所，西藏林芝860000）

為分析藏東南地區(qū)毛殼屬（Chaetomium Kunze）真菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育情況，從藏東南5個(gè)市、縣采集土壤、植物殘?bào)w和動(dòng)物糞便等標(biāo)本共355份，采用組織分離法和稀釋分離法得到36株毛殼菌，平均分離幾率為10.14%。將分離得到的菌株進(jìn)行多樣性指數(shù)特征分析，并按形態(tài)特征初步分類；運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)菌株的rDNA-ITS和β-tubulin基因序列進(jìn)行擴(kuò)增與序列測(cè)定；利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建rDNA-ITS和β-tubulin基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果顯示：林芝縣的毛殼屬真菌多樣性指數(shù)最高，為1.178 5，物種均勻度指數(shù)也最高，為0.605 6；昌都市的毛殼屬真菌豐富度指數(shù)最高，達(dá)到0.861 4。不同地區(qū)毛殼屬真菌的優(yōu)勢(shì)種也存在差異：工布江達(dá)縣的優(yōu)勢(shì)種為球毛殼（C. globosum）；墨脫縣和昌都市的優(yōu)勢(shì)種為糞生毛殼（C.funicola）；察隅縣的優(yōu)勢(shì)種為旋絲毛殼（C.bostrychodes）；林芝縣的優(yōu)勢(shì)種為反卷毛殼（C.convolutum）。根據(jù)形態(tài)特征可將36株菌歸屬為8個(gè)種。分析擴(kuò)增后的rDNA-ITS和β-tubulin基因序列發(fā)現(xiàn)，β-tubulin基因的變異位點(diǎn)、單倍型總數(shù)、單倍型多樣度、核苷酸多樣性指數(shù)和核苷酸平均差異數(shù)與rDNA-ITS序列的這些參數(shù)存在顯著差異，體現(xiàn)出更大的堿基變異性。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明，供試的36個(gè)菌株被分為7個(gè)組，rDNA-ITS和β-tubulin這2個(gè)基因片段不僅可用來區(qū)分毛殼菌屬中形態(tài)差異較大的種，如印度毛殼（C.indicum）、大果毛殼（C.megalocarpum）、球毛殼（C.globosum）、糞生毛殼（C.funicola），還可區(qū)分形態(tài)特征非常相似的印度毛殼（C.indicum）和直立毛殼（C.erectum），同時(shí)也可以對(duì)一些形態(tài)上難以鑒定的種進(jìn)行初步鑒定，但不能較好地區(qū)分反卷毛殼（C.convolutum）、旋絲毛殼（C.bostrychodes）和黑毛殼（C.nigricolor），需要結(jié)合更多的基因片段進(jìn)行區(qū)分。綜上所述，本文對(duì)藏東南地區(qū)毛殼屬真菌多樣性與系統(tǒng)發(fā)育情況進(jìn)行了研究，為豐富西藏毛殼屬真菌資源和開發(fā)毛殼菌代謝產(chǎn)物奠定了理論基礎(chǔ)。

藏東南；毛殼菌；多樣性；系統(tǒng)發(fā)育分析

SummaryChaetomium Kunze is mainly distributed in cellulose-containing substrates in the nature,including soil,plant residue,excrement of birds,omnivorous animals and rodents.Persistent organic compounds can be degraded by cellulase produced by Chaetomium Kunze,which also has antagonistic effects on certain microorganisms in the soil.However,littlehas been known about Chaetomium in Tibet.Therefore,a systematic research on resource distribution of Chaetomium in Tibet is necessary and urgent.

In this study,355 samples of soil,plant residue and animal manure were collected from five regions of southeastern Tibet,in which plant residue and animal manure were separated by tissue separation,and soil samples were separated by dilution separation method.SPSS 13.5 software was used to analyze the diversity index of Chaetomium spp.from different regions,and 36 strains were preliminarily classified according to Arx system.The nucleotide sequence polymorphisms of rDNA-ITS and β-tubulin gene were analyzed by DnaSP version 5.0.The rDNA-ITS and β-tubulin gene sequences were used to analyze the diversity of Chaetomium species in southeastern Tibet.

The results showed that a total of 36 strains were successfully isolated from the 355 samples,and the average isolation rate was 10.14%.The diversity index data indicated that both the diversity index and species evenness index of Chaetomium spp. in Nyingchi was the highest,with the value of 1.178 5 and 0.605 6 respectively.But the richness index of Chaetomium was the highest in Chamdo,with the value of 0.861 4.Differences of dominant populations of Chaetomium were observed among the five regions:the dominant population in Gongbogyamda County,Medog County and Chamdo City,Zayü County,and Nyingchi County was C.globosum,C.funicola,C.bostrychodes,and C.convolutum,respectively.According to the morphological characteristics,the 36 strains were assigned to eight species.Moreover,rDNA-ITS sequences and β-tubulin gene were applied to conduct the diversity analysis,and the result showed that the variation sites,haplotype numbers,haplotype diversity,nucleotide diversity index and nucleotide difference of β-tubulin gene were significantly different from rDNA-ITS sequences,while βtubulin gene showed greater base variability.The phylogenetic tree of rDNA-ITS and β-tubulin genes indicated that the 36 isolates were divided into seven groups.The two gene fragments can not only distinguish the species of Chaetomium with different morphologies(such as C.indicum,C.megalocarpum,C.globosum and C.funicola),but also those with very similar morphological characteristics(such as C.indicum and C.erectum)and some species hard to distinguish.However,several species such as C. convolutum,C.bostrychodes and C.nigricolor can’t be distinguished by rDNA-ITS and β-tubulin genes,which still need combining more gene fragments to differentiate.

In conclusion,the results confirm the rich resources of Chaetomium fungus in southeastern region of Tibet,providing data for abundant resources of Chaetomium in Tibet,and laying a foundation for the exploitation of the metabolites of Chaetomium.

毛殼屬真菌（Chaetomium Kunze，以下簡稱毛殼菌）隸屬于子囊菌門（Ascomycota）核菌綱（Pyrenomycetes）糞殼目（Sordariales）毛殼菌科（Chaetomiaceae），主要分布在自然界各種含纖維素的基質(zhì)上，包括雜食動(dòng)物及鳥類和鼠類的糞便、土壤、植株殘?bào)w等，能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶[1]，同時(shí)還可以降解纖維素和木質(zhì)素等大分子難降解有機(jī)物，具有拮抗土壤中某些微生物的作用。自從1817年KUNZE建立毛殼菌屬以來，人們對(duì)毛殼菌的認(rèn)識(shí)不斷深入，分類標(biāo)準(zhǔn)也日趨一致。毛殼菌屬由1881年第1部專著中報(bào)道的10個(gè)種，逐漸發(fā)展穩(wěn)定到真菌字典第9版記載的81個(gè)種[2]，2008年由KIRK確定為95個(gè)種。我國對(duì)毛殼菌的分類和研究始于1959年，陳慶濤[3]于1959—1965年發(fā)現(xiàn)了2個(gè)毛殼菌新種；隨后，戴芳瀾[4]在《中國真菌總匯》里記錄了該屬30個(gè)種（含異名）；孫廣宇等[5]對(duì)我國部分地區(qū)的毛殼菌進(jìn)行了分離和鑒定，報(bào)道了3個(gè)新種；譚悠久等[6]發(fā)現(xiàn)了我國1個(gè)新種；王雪薇[7]報(bào)道了我國毛殼菌31個(gè)種，其中包括2個(gè)新種，5個(gè)中國新記錄種；劉富江[8]從我國部分省（區(qū)）采樣，發(fā)現(xiàn)毛殼菌14個(gè)種，其中包括1個(gè)新記錄種。目前，我國發(fā)現(xiàn)并記載的毛殼菌共計(jì)31種。

研究表明，微生物的生態(tài)分布與土壤和植被等環(huán)境因子密切相關(guān)[9]。藏東南地區(qū)處于我國雅魯藏布江中下游，總體海拔高度差超過7 000 m[10]，平均海拔3 100 m，地勢(shì)南低北高，印度洋暖流與北方寒流匯合，形成了特殊的熱帶、亞熱帶、溫帶和寒帶并存的特殊氣候。該地區(qū)地形復(fù)雜，氣候多樣，資源豐富，是研究植物區(qū)系和生物多樣性的理想?yún)^(qū)域。徐阿生等[11]和張惠等[12]分別對(duì)藏東南地區(qū)的大型真菌進(jìn)行了調(diào)查，何建清等[9]對(duì)藏東南地區(qū)的放線菌進(jìn)行了分離和鑒定。但是，目前對(duì)西藏毛殼菌的系統(tǒng)研究還較少，僅劉述春等[13]對(duì)來源于藏東南林芝地區(qū)的1株毛殼菌進(jìn)行了生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)了新聚酮類結(jié)構(gòu)活性化合物；GUO等[14]從藏東南林芝地區(qū)的土壤中分離到3株毛殼菌并發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新種。這些研究均表明，特殊生境是微生物新種和活性天然產(chǎn)物的重要來源。

自20世紀(jì)60年代以后，分子生物學(xué)方法被廣泛應(yīng)用于真菌分類和鑒定，其中保守的rDNA-ITS序列被推薦為真菌的通式性DNA條形碼[15]，但由于內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer,ITS）序列提供的遺傳信息有限，一些功能基因如CO1，EF-a和β-tubulin等序列在一些真菌種類鑒定中成為更好的分子標(biāo)記[16-18]。本文通過rDNA-ITS結(jié)合βtubulin基因序列對(duì)分離自藏東南地區(qū)的毛殼屬真菌菌株進(jìn)行初步鑒定，分析其多樣性和系統(tǒng)發(fā)育情況，以期為豐富西藏毛殼屬真菌資源、開發(fā)毛殼菌代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

從藏東南的昌都市、工布江達(dá)縣、墨脫縣、察隅縣、林芝縣等地共采集土壤、植物殘?bào)w和動(dòng)物糞便等基質(zhì)355份，用牛皮紙信封裝好帶回實(shí)驗(yàn)室，風(fēng)干1周后，進(jìn)行毛殼菌的分離。各采樣區(qū)的基本情況見表1。

1 材料與方法

表1 藏東南不同采樣區(qū)基本情況Table 1Profile of different sampling areas in southeastern Tibet

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬丁培養(yǎng)基[19]（分離培養(yǎng)基）：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。培養(yǎng)基配制好后，加入1%孟加拉紅溶液3.3 mL，分裝后用121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

玉米粉培養(yǎng)基（鑒定培養(yǎng)基）：玉米粉30 g，瓊脂15 g，水1 L。將玉米粉在70℃蒸餾水中加熱約1 h，用紗布過濾固體殘?jiān)螅瑢傊奂尤霝V液中，加熱溶化，最后用蒸餾水補(bǔ)足至1 L，分裝后用121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 主要設(shè)備和試劑

試劑：十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、超純水、冰醋酸、氯化鈉、二水乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉等，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增用的試劑均購自大連TaKaRa寶生物工程有限公司。

設(shè)備：Nikon體式解剖鏡（SMZ800-C-DS）、徠卡（Leica）系統(tǒng)顯微鏡（DM5000）、雙人單面水平凈化工作臺(tái)（SF-CJ-20）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162）、PCR儀、天能凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（Tanon-41000）、電子天平（JA10003N）、DY1002V電泳儀、MR22低溫高速離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理

分離幾率=分離到的菌株數(shù)/分離的樣本總數(shù)× 100%。

采用SPSS 13.5軟件進(jìn)行毛殼菌的數(shù)量統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

毛殼菌的多樣性特征指數(shù)即Shannon-Weiner多樣性指數(shù)（H）、Pielou均勻性指數(shù)（E）和豐富度指數(shù)（D）分別按以下公式計(jì)算。

式中：pi為物種i占采樣區(qū)菌株總數(shù)的比例；S為各采樣區(qū)內(nèi)毛殼菌的物種數(shù)量；N為各采樣區(qū)內(nèi)分離到的菌株總數(shù)。

1.2.2 菌株分離與純化[20]

樹枝、樹葉、動(dòng)物糞便等基質(zhì)采用組織分離法分離：將實(shí)驗(yàn)材料切取成4～5 mm的小塊，用60%乙醇將組織小塊浸泡6～8 min，無菌水連續(xù)漂洗3次，將表面消毒過的組織小塊轉(zhuǎn)接至馬丁培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿放置4～5塊，28℃恒溫培養(yǎng)，3～4 d后觀察是否有子囊果產(chǎn)生，并在Nikon體式解剖鏡下挑取單個(gè)子囊果接種于玉米粉培養(yǎng)基上，對(duì)菌株進(jìn)行純化和觀察。

采用稀釋分離法分離土壤樣品：稱取充分混勻的土樣約1.0 g置于250 mL無菌三角瓶中，加入60%乙醇2 mL使土樣完全淹沒，處理6～8 min，加入120 mL左右無菌水，使三角瓶中的乙醇濃度稀釋至1%左右，吸取0.8～1.0 mL稀釋液均勻涂布于馬丁培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，3～4 d后觀察是否有子囊果產(chǎn)生，并在Nikon體式解剖鏡下挑取單個(gè)子囊果接種于玉米粉培養(yǎng)基上，對(duì)菌株進(jìn)行純化和觀察。

1.2.3 毛殼菌的初步歸類

以VON ARX等[21]報(bào)道的系統(tǒng)為主要基礎(chǔ)和依據(jù)對(duì)毛殼菌進(jìn)行初步歸類。將待鑒定的菌株接種于玉米粉培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)，記錄菌落特征、子囊果成熟時(shí)間。定期觀察，待子囊果成熟時(shí)，在Nikon體式解剖鏡下挑取單個(gè)子囊果，制作臨時(shí)玻片，用DM5000徠卡系統(tǒng)顯微鏡觀察子囊果、附屬絲和子囊的形態(tài)，以及子囊孢子的顏色、形態(tài)、萌發(fā)孔等特征，將特征一致的菌株歸為一類。

1.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和序列測(cè)定

DNA的提取主要參考NAKADA等[22]的方法并加以改進(jìn)。rDNA-ITS序列的PCR引物對(duì)序列[23]如下。ITS1-F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。β-tubulin基因的PCR引物對(duì)序列[24]如下。Bt2a：5'-GGTAAC CAAATCGGTGCTGCTTTC-3'，Bt2b：5'-ACCCTCAG TGTAGTGACCCTTGGC-3'。以上引物均由上海美吉生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR緩沖液2.5 μL，DNA模板10 ng，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL。擴(kuò)增ITS的PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，53℃退火40 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增β-tubulin基因序列的PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的純化和序列測(cè)定由上海美吉生物科技有限公司完成。

1.2.5 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離到的36個(gè)菌株的rDNA-ITS和β-tubulin基因序列測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中申請(qǐng)接受號(hào)（表2），利用Blast進(jìn)行同源序列查找，選擇15個(gè)相關(guān)種的序列（表2）。采用Clustal X 1.8軟件對(duì)所測(cè)定的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)后，用Bioedit軟件將序列兩端切割平齊，保存為fastal格式，用SequenceMatrix進(jìn)行菌株rDNA-ITS和β-tubulin基因序列拼接，并保存為nexus，擴(kuò)展名為.nex。利用DnaSP v5.0軟件對(duì)序列進(jìn)行DNA多態(tài)性分析，分別統(tǒng)計(jì)序列間每對(duì)堿基的平均差異、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目、單倍型數(shù)目基因型多樣性和核苷酸差異的平均值。用MEGA 5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（選擇Sordaria macrospora為外部群）。

表2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用的菌株Table 2Strains used for constructing phylogenetic tree

表2 （續(xù)）Continuation of Table 2

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果及多樣性分析

從表3中可看出：從采集自藏東南5個(gè)市、縣土壤、植物殘?bào)w、動(dòng)物糞便的355份標(biāo)本中分離到36株毛殼菌，分離幾率為10.14%。其中：工布江達(dá)縣的分離幾率最高，為33.33%；昌都市的標(biāo)本分離幾率最低，僅為3.42%。林芝縣的毛殼屬真菌多樣性指數(shù)最高，為1.178 5，物種均勻度指數(shù)也最高，為0.605 6；工布江達(dá)縣的多樣性指數(shù)最低，僅為0.260 1；昌都市的毛殼屬真菌豐富度指數(shù)最高，達(dá)到0.861 4；察隅縣的豐富度指數(shù)最低，僅為0.430 7；藏東南各地區(qū)的物種數(shù)量存在較大差異，其中林芝縣物種數(shù)量最多。

表3 不同地區(qū)的毛殼屬真菌物種多樣性指數(shù)特征Table 3Characteristics of species diversity index of Chaetomium from different regions

2.2 形態(tài)特征初步歸類

從表4可以看出，從藏東南各地區(qū)分離到的36個(gè)菌株可歸屬為8個(gè)種，分別為球毛殼（C. globosum），糞生毛殼（C.funicola），旋絲毛殼（C. bostrychodes），反卷毛殼（C.convolutum），印度毛殼（C.indicum），近緣毛殼（C.subaffine），黑毛殼（C. nigricolor）和大果毛殼（C.megalocarpum）。其中近緣毛殼、黑毛殼和大果毛殼僅分離到1株，為少見種。不同地區(qū)毛殼屬真菌的優(yōu)勢(shì)種存在差異：工布江達(dá)縣的優(yōu)勢(shì)種為球毛殼（C. globosum）；墨脫縣和昌都市的優(yōu)勢(shì)種為糞生毛殼（C.funicola）；察隅縣的優(yōu)勢(shì)種為旋絲毛殼（C. bostrychodes）；林芝縣的優(yōu)勢(shì)種為反卷毛殼（C. convolutum）。

表4 不同地區(qū)毛殼屬真菌形態(tài)特征歸類結(jié)果Table 4Classification results of morphological characteristics of Chaetomium from different regions

2.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

2.3.1 堿基變異分析

對(duì)36株毛殼菌的rDNA-ITS和β-tubulin基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（表5）顯示：rDNA-ITS擴(kuò)增后兩端切割平齊獲得的長度為528 bp，β-tubulin基因擴(kuò)增后兩端切割平齊獲得的長度為379 bp，拼接序列總長度為907 bp；36株毛殼菌共有223個(gè)變異位點(diǎn)，18種單倍型，單倍型多樣度為0.890，核苷酸多樣性指數(shù)為0.099 05，核苷酸平均差異數(shù)為89.835；βtubulin基因的變異位點(diǎn)、單倍型多樣度、單倍型總數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和核苷酸平均差異數(shù)與rDNA-ITS的差異顯著，體現(xiàn)出更大的堿基變異性。

表52 個(gè)基因在36株毛殼屬真菌中的核苷酸多樣性Table 5Nucleotide diversity of two genes in 36 strains of Chaetomium

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建rDNA-ITS和β-tubulin基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對(duì)所測(cè)定的序列及GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，構(gòu)建藏東南地區(qū)毛殼菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖1）顯示，供試的36個(gè)菌株被分為7個(gè)組，各分支的支持強(qiáng)度均達(dá)77%以上。其中：10個(gè)菌株與糞生毛殼（C.funicola）聚類在一個(gè)分支上，包括形態(tài)上不能準(zhǔn)確歸類的菌株39-6-1；3個(gè)菌株與印度毛殼（C. indicum）聚類在一個(gè)分支上；2個(gè)形態(tài)不定的菌株LZT0021、LZZ0045與C.erectum聚類在一個(gè)分支上；菌株LZZ0012與C.subaffine聚類在一個(gè)分支上；92-35與大果毛殼（C.megalocarpum）聚類在一起；6個(gè)菌株與球毛殼（C.globosum）聚類在一個(gè)分支上，包括形態(tài)上不能準(zhǔn)確歸類的菌株39-16-1；此外，形態(tài)上不能準(zhǔn)確歸類的菌株92-18-2、形態(tài)上鑒定為反卷毛殼（C.convolutum）的4個(gè)菌株、形態(tài)上鑒定為旋絲毛殼（C.bostrychodes）的7個(gè)菌株、形態(tài)上歸類為黑毛殼（C.nigricolor）的1個(gè)菌株，共計(jì)13個(gè)菌株聚在一起，彼此分不開。

3 討論

本文從藏東南地區(qū)采集動(dòng)物糞便、土壤和植物殘?bào)w標(biāo)本共355份，從中分離到毛殼菌36株，平均分離幾率僅為10.14%，說明毛殼菌在土壤中的分離幾率較低。這與國內(nèi)很多學(xué)者的研究結(jié)果一致：王雪薇[7]從1 738份基質(zhì)中僅分離到136株毛殼菌，分離幾率為7.82%；劉富江[8]從1 098份標(biāo)本中僅分離獲得63株毛殼菌，分離幾率僅為5.74%。林芝縣的毛殼菌多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均為最高，這與該地區(qū)植被豐富有很大關(guān)系。綜合分析藏東南各地區(qū)的物種類群，旋絲毛殼為察隅縣的優(yōu)勢(shì)種，球毛殼為工布江達(dá)縣的優(yōu)勢(shì)種，糞生毛殼為昌都市和墨脫縣的優(yōu)勢(shì)種，反卷毛殼為林芝縣的優(yōu)勢(shì)種，反映出不同生態(tài)區(qū)的植被和土壤狀況影響了微生物的生態(tài)分布與優(yōu)勢(shì)種的類型。

圖1 基于rDNA-ITS和β-tubulin基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1Phylogenetic tree constructed based on rDNA-ITS and β-tubulin sequences

從堿基變異結(jié)果來看，β-tubulin基因的堿基變異位點(diǎn)、單倍型總數(shù)、單倍型多樣度、核苷酸多樣性指數(shù)和核苷酸平均差異數(shù)等較rDNA-ITS存在顯著差異。β-tubulin基因既有保守的外顯子又有6個(gè)可變的內(nèi)含子，可作為真菌物種鑒定的標(biāo)志片段[25]。SAMSON等[26]對(duì)青霉屬的180株代表性菌株進(jìn)行序列分析，證實(shí)了β-tubulin基因是較理想的物種標(biāo)記片段；VARGA等[27]和GEISER等[28]的研究均表明βtubulin基因適合作為曲霉屬的DNA條形碼；但是TANG等[29]在對(duì)糞殼菌綱（Sordariomycetes）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-tubulin對(duì)該類群真菌的分辨率較低，需要結(jié)合其他基因片段才能提高物種的分辨率。本研究結(jié)合rDNA-ITS和β-tubulin基因序列進(jìn)行聯(lián)合分析，提高了物種鑒定的準(zhǔn)確性。

從系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，結(jié)合rDNA-ITS和β-tubulin基因不僅可以用來區(qū)分毛殼菌屬中形態(tài)差異較大的種，如印度毛殼、大果毛殼、球毛殼、糞生毛殼，還可以區(qū)分形態(tài)特征非常相似的印度毛殼和直立毛殼（C.erectum），同時(shí)對(duì)一些形態(tài)上難以鑒定的種也可以進(jìn)行初步鑒定，但還不能很好地區(qū)分反卷毛殼、旋絲毛殼和黑毛殼，需要結(jié)合更多的基因片段進(jìn)行區(qū)分。

目前，國內(nèi)外對(duì)西藏毛殼菌的研究僅為零星報(bào)道，缺乏較系統(tǒng)的研究。本文選擇西藏植被較為豐富的藏東南地區(qū)為標(biāo)本采集地，提高了菌株的分離幾率。藏東南復(fù)雜而獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境和較原始的土壤生態(tài)環(huán)境決定了其毛殼菌的獨(dú)特之處。本研究分離到的直立毛殼（C.erectum）在國內(nèi)尚無報(bào)道，大果毛殼也是比較少見的種[30]。由此可見，藏東南地區(qū)是西藏的重要菌種資源庫，本研究為豐富西藏毛殼菌資源庫和開發(fā)毛殼菌代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。

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southeastern Tibet;Chaetomium;diversity;phylogenetic analysis

Q 949.32

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.12.221

國家自然科學(xué)基金(31360006)；旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金課題(CSBAA2016006)。

*通信作者(Corresponding author)：岳海梅(http://orcid.org/0000-0001-9282-2295)，E-mail:yuehm1980@163.com

2016-12-22；接受日期(Accepted):2017-05-09