熊 烈，錢(qián)淑嵐，朱成云，李 駿，鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310032)

假單胞菌基因敲除方法研究進(jìn)展

熊 烈，錢(qián)淑嵐，朱成云，李 駿，鐘衛(wèi)鴻*

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310032)

基因敲除是近年來(lái)十分熱門(mén)的基因工程技術(shù)，假單胞菌(Pseudomonas)作為一種常見(jiàn)細(xì)菌，應(yīng)用十分廣泛，因此，對(duì)假單胞菌進(jìn)行基因敲除改造有著十分重要的意義?？偨Y(jié)了假單胞菌基因敲除技術(shù)成功案例，并對(duì)2種基因敲除系統(tǒng)進(jìn)行了比較，包括同源重組關(guān)鍵步驟的轉(zhuǎn)化方式、基因敲除方法的選擇、同源臂長(zhǎng)度的選擇等。

假單胞菌；基因敲除；同源重組

基因敲除又稱基因打靶，是指外源打靶基因與基因組目標(biāo)基因通過(guò)基因工程手段，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生DNA同源重組，使外源基因定點(diǎn)整合到基因組目標(biāo)基因中[1]?；谠摷夹g(shù)，可實(shí)現(xiàn)諸如插入突變、缺失突變等多種形式的突變。

假單胞菌(Pseudomonas)是一類重要的微生物，分布十分廣泛，在土壤、水體以及生物體中都可見(jiàn)。假單胞菌為革蘭氏陰性菌；細(xì)胞呈單個(gè)，多為直或彎的桿菌，大小為(0.5～1.0)μm×(1.4～4.0)μm，單鞭毛或多鞭毛；大多數(shù)假單胞菌的最適生長(zhǎng)溫度在30 ℃左右，生長(zhǎng)pH值在7.0～8.5之間[2]。由于假單胞菌在環(huán)境修復(fù)、生物防治、生物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用[3]，因此對(duì)假單胞菌進(jìn)行基因工程改造，尤其是基因敲除意義重大。為此，作者總結(jié)了假單胞菌基因敲除技術(shù)成功案例，并對(duì)2種基因敲除系統(tǒng)進(jìn)行了比較，包括同源重組關(guān)鍵步驟的轉(zhuǎn)化方式、基因敲除方法的選擇、同源臂長(zhǎng)度的選擇等，以期為假單胞菌基因敲除的深入研究提供參考。

1 非自身同源重組的基因敲除系統(tǒng)

Red同源重組又稱ET重組，最初應(yīng)用于大腸桿菌中，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌染色體基因的定點(diǎn)敲除。Murphy[4]在1998年首次利用λ噬菌體Red同源重組系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了基因修飾。

在細(xì)菌內(nèi)，自然發(fā)生的同源重組效率極低，大約在10-6左右，而一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)的轉(zhuǎn)化效率大概在104～105·(μgDNA)-1左右[5]。Red同源重組不依賴于宿主菌本身的重組系統(tǒng)，而是將λ噬菌體中編碼Exo、Beta、Gam3種蛋白質(zhì)的基因克隆至載體中，再將攜帶同源臂與篩選標(biāo)記的打靶片段導(dǎo)入宿主菌，利用載體在宿主菌中表達(dá)相應(yīng)蛋白，實(shí)現(xiàn)同源重組。其中，exo基因編碼的Exo蛋白具有λ核酸外切酶活性，與雙鏈DNA末端相結(jié)合，從5′端向3′端降解DNA單鏈，產(chǎn)生3′突出末端[6]；bet基因編碼的Beta蛋白與在Exo蛋白作用下產(chǎn)生突出末端的DNA分子結(jié)合，保護(hù)其不被降解且介導(dǎo)互補(bǔ)鏈的退火，同時(shí)兼有重組酶活性催化同源重組[7-8]；gam基因編碼的Gam蛋白的分子量在16 000Da左右，可以與宿主RecBCD核酸外切酶結(jié)合，并抑制其活性，以防止外源DNA進(jìn)入細(xì)菌后被宿主降解[9-10]。因此，Red同源重組可大大提高細(xì)菌同源重組效率。

1.1 依賴打靶片段的Red同源重組系統(tǒng)

依賴打靶片段的Red同源重組系統(tǒng)：將來(lái)源于λ噬菌體中的exo、bet、gam基因克隆至載體質(zhì)粒上，并使其受誘導(dǎo)性啟動(dòng)子調(diào)控，常用的啟動(dòng)子有阿拉伯糖啟動(dòng)子與間甲基苯甲酸啟動(dòng)子等；再通過(guò)PCR得到攜帶有一定長(zhǎng)度靶基因的上下游同源臂的標(biāo)記基因片段；將標(biāo)記基因片段轉(zhuǎn)化入經(jīng)誘導(dǎo)的宿主菌中；最后通過(guò)相應(yīng)的篩選可得到突變菌株。如圖1所示。

圖1 依賴打靶片段的Red同源重組系統(tǒng)示意圖

該方法的重組效率與同源臂長(zhǎng)度密切相關(guān)，在E.coli中使用該方法只需幾十bp的同源臂即可完成敲除，而對(duì)于假單胞菌要用數(shù)百bp至1 000 bp的同源臂來(lái)提高同源重組的效率，但也有使用較短同源臂成功敲除的案例。余華等[11]將exo、bet、gam基因與阿拉伯糖啟動(dòng)子相連，并克隆至質(zhì)粒pUCP中，分別利用含有80 bp和400 bp同源臂的打靶片段在Pseudomonasaeruginosa中成功實(shí)現(xiàn)了基因敲除，使用較短同源臂時(shí)重組子正確概率在80%左右，而使用較長(zhǎng)同源臂時(shí)正確概率幾乎達(dá)到100%。楊運(yùn)文等[12]將exo、bet、gam基因與間甲基苯甲酸啟動(dòng)子連接，并克隆至質(zhì)粒pJB866中，利用含有500 bp同源臂的打靶片段在Pseudomonasputida中成功實(shí)現(xiàn)了基因敲除，重組效率達(dá)到5×10-5，重組子正確概率達(dá)到60%以上。

1.2 依賴雙質(zhì)粒的Red同源重組系統(tǒng)

在基因敲除過(guò)程中，標(biāo)記基因往往選擇的是抗生素抗性基因，使得在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中會(huì)遇到許多問(wèn)題，如水平轉(zhuǎn)移至其它細(xì)菌中會(huì)造成耐藥性、對(duì)環(huán)境存在一定威脅等。因此，需要將標(biāo)記基因從基因組中敲除。

依賴雙質(zhì)粒的Red同源重組系統(tǒng)：在依賴外源打靶片段的Red同源重組的基礎(chǔ)上，將loxP位點(diǎn)插入標(biāo)記基因與同源臂之間，然后由exo、bet、gam基因的表達(dá)蛋白共同介導(dǎo)第一次同源重組，重組后的菌株再導(dǎo)入可誘導(dǎo)表達(dá)Cre酶的質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)后可由Cre介導(dǎo)第二次同源重組，敲除標(biāo)記基因與1個(gè)loxP位點(diǎn)。如圖2所示。

由于該方法操作較依賴打靶片段的Red同源重組系統(tǒng)復(fù)雜，故使用該方法的報(bào)道案例較少。Luo等[13]構(gòu)建了含有間甲基苯甲酸啟動(dòng)子誘導(dǎo)的exo、bet、gam基因的質(zhì)粒pLS2352以及含有鼠李糖誘導(dǎo)的cre重組酶基因的質(zhì)粒pLS1678；用500 bp左右的同源臂對(duì)PseudomonasputidaKT2440的多個(gè)基因完成了敲除，并且實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記基因的敲除，重組子正確概率幾乎達(dá)到100%。但是該方法會(huì)在基因組中留下1個(gè)loxP位點(diǎn)，若想在突變株的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行基因敲除，則可能會(huì)受到一定影響。

圖2 Cre介導(dǎo)的第二次同源重組示意圖

2 依賴自身同源重組的基因敲除系統(tǒng)

依賴自身同源重組的基因敲除系統(tǒng)，通常使用在假單胞菌中不可復(fù)制的質(zhì)粒攜帶靶基因上下游同源臂序列或靶基因內(nèi)的一段序列進(jìn)行同源重組，利用其在假單胞菌中自殺的特性，只有當(dāng)質(zhì)粒整合到基因組中時(shí)才能獲得質(zhì)粒上的篩選標(biāo)記，從而得到重組子[14-15]。

2.1 一輪同源重組的插入突變

一輪同源重組基因敲除的原理：在假單胞菌的自殺載體中攜帶有一段截短的目標(biāo)基因序列，導(dǎo)入目標(biāo)菌株后，由于該載體在目標(biāo)菌株中自殺的特性，若未發(fā)生同源重組將質(zhì)粒整合入基因組，其篩選標(biāo)記無(wú)法表達(dá)，整合入基因組后篩選標(biāo)記得以表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)插入突變。如圖3所示。

圖3 一輪同源重組基因敲除原理

雖然該方法只需發(fā)生一輪同源重組就可實(shí)現(xiàn)基因的插入突變，成功率較高，操作也較簡(jiǎn)單；但是該方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)無(wú)縫敲除，相比于Red同源重組系統(tǒng)所引入的外源片段也較長(zhǎng)，可能以破壞靶基因上下游基因閱讀框結(jié)構(gòu)的方式導(dǎo)致不必要的突變。因而，該方法通常用于以基因功能驗(yàn)證為目的的基因敲除[16]。

一輪同源重組常用的自殺質(zhì)粒有pK18mob、pCVD442、pEX18Tc等。其中，pK18mob是利用在假單胞菌中無(wú)法識(shí)別的復(fù)制子來(lái)實(shí)現(xiàn)自殺的；pCVD442實(shí)現(xiàn)自殺的原理是其復(fù)制子依賴于π蛋白，而一般的菌株中不表達(dá)π蛋白。Tang等[17]將361 bp的序列酶切連接至自殺質(zhì)粒pK18mob中，利用一輪同源重組對(duì)PseudomonasputidaS16成功實(shí)現(xiàn)了hpo基因的敲除。張加勤等[18]利用自殺質(zhì)粒pEX18Tc，將缺失部分序列的靶基因及上下游同源臂連接入載體質(zhì)粒，對(duì)PseudomonasaeruginosaPAO1的clpP基因進(jìn)行了敲除。

2.2 兩輪同源重組的無(wú)縫敲除

兩輪同源重組與一輪同源重組類似，也是利用自身同源重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因敲除，其原理是：將目標(biāo)基因上下游片段連接后克隆至自殺載體中，導(dǎo)入目標(biāo)菌株后分別通過(guò)正篩選標(biāo)記和反篩選標(biāo)記得到發(fā)生2次同源重組且基因敲除的菌株。如圖4所示。

圖4 兩輪同源重組基因敲除原理

兩輪同源重組常用載體質(zhì)粒有pK18mobsacB、pEX18Tc等。相較于一輪同源重組，兩輪同源重組需要發(fā)生2次同源重組且有一定恢復(fù)成野生型的概率，操作繁瑣，成功率較低；但是可以實(shí)現(xiàn)無(wú)縫敲除，不會(huì)對(duì)目標(biāo)基因上下游基因造成影響[15]。Wang等[19]利用自殺質(zhì)粒pEX18Tc攜帶700 bp左右的上下游同源臂對(duì)PseudomonasmendocinaNK-01成功進(jìn)行了基因敲除。Liu等[20]利用質(zhì)粒pK18mobsacB攜帶800 bp左右的上下游同源臂對(duì)PseudomonaschlororaphisGP72的lon基因成功進(jìn)行了敲除。

3 2種基因敲除系統(tǒng)的比較(表1)

表1 2種基因敲除系統(tǒng)的比較

Tab.1 Comparison of two gene knockout systems

從表1可看出，操作最簡(jiǎn)單的是一輪同源重組系統(tǒng)，但是該方法會(huì)將大量片段整合入基因組；操作最復(fù)雜的是依賴雙質(zhì)粒的Red同源重組系統(tǒng)，但是該方法會(huì)將loxP位點(diǎn)遺留在基因組中。

3.1 同源重組關(guān)鍵步驟的轉(zhuǎn)化方式

在利用同源重組系統(tǒng)進(jìn)行假單胞菌基因敲除的過(guò)程中，由于假單胞菌的特殊性，大多數(shù)假單胞菌可分泌胞外多糖從而保護(hù)細(xì)胞免受外界有害物質(zhì)的作用[21]，而這種多糖可能會(huì)阻礙Ca2+與細(xì)胞膜的作用，導(dǎo)致熱激效率下降。有學(xué)者針對(duì)多種假單胞菌的Ca2+感受態(tài)與熱激進(jìn)行過(guò)優(yōu)化，在最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)化效率也只能達(dá)到105·(μg DNA)-1左右[5]，這對(duì)于常規(guī)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是足夠了的，但對(duì)于依賴同源重組而實(shí)現(xiàn)的基因敲除是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

依賴exo、bet、gam基因的同源重組效率在10-5左右，而依賴細(xì)菌自身的同源重組效率只有10-6左右，這對(duì)轉(zhuǎn)化效率提出了更高的要求，故一般在進(jìn)行同源重組這一關(guān)鍵步驟時(shí)，研究者們大多使用電轉(zhuǎn)化(electroporation)方式或是接合轉(zhuǎn)移(conjugation)方式來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。近兩年來(lái)，國(guó)內(nèi)外數(shù)十篇關(guān)于假單胞菌基因敲除的報(bào)道中，在同源重組這一關(guān)鍵步驟中使用的轉(zhuǎn)化方法如圖5所示。

圖5 同源重組關(guān)鍵步驟轉(zhuǎn)化方式的報(bào)道數(shù)量

從圖5可以看出，在同源重組關(guān)鍵步驟中，接合轉(zhuǎn)移方式被更多的研究者所采用，供體菌大多使用E.coliS17-1λ-pir與E.coliWM3064，占所有供體菌的40%左右，且這2株菌都可以表達(dá)π蛋白，相比于E.coliS17-1λ-pir，E.coliWM3064是一株2,6-二氨基庚二酸(2,6-DAP)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，在篩選時(shí)更為有利。相比于電轉(zhuǎn)化，接合轉(zhuǎn)移不需要制備特定的感受態(tài)，也不需要特殊的儀器，更容易擴(kuò)大菌體量，這也許是更多研究者采用接合轉(zhuǎn)移方式的原因所在。

3.2 基因敲除方法的選擇

若將假單胞菌基因敲除方法分為非自身同源重組的基因敲除和依賴自身同源重組的基因敲除，那么，對(duì)國(guó)內(nèi)外數(shù)十篇關(guān)于假單胞菌基因敲除方法的分類如圖6所示。

圖6 基因敲除方法的報(bào)道數(shù)量

從圖6可以看出，常規(guī)的非自身同源重組基因敲除方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于依賴自身同源重組基因敲除方法。雖然從理論上看，非自身同源重組基因敲除的重組效率與重組子正確概率都較高，但使用該方法的研究者并不多，這可能是由于非自身同源重組基因敲除需要制作至少2次感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)載體質(zhì)粒的構(gòu)建也更復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)流程更長(zhǎng)；更重要的可能是，由于假單胞菌與E.coli菌種之間的特異性和假單胞菌屬內(nèi)不同種之間的特異性，使得exo、bet、gam基因的表達(dá)及蛋白功能等都會(huì)受到一定的影響，從而進(jìn)一步降低同源重組的效率。

3.3 同源臂長(zhǎng)度的選擇

在基因敲除過(guò)程中，同源重組效率不僅取決于轉(zhuǎn)化效率，其同源臂長(zhǎng)度也起著十分關(guān)鍵的作用。在國(guó)內(nèi)外數(shù)十篇關(guān)于假單胞菌基因敲除的報(bào)道中，其同源臂長(zhǎng)度的分類如圖7所示。

從圖7可以看出，研究者更多地選擇較長(zhǎng)同源臂，這也從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)了同源臂長(zhǎng)度在基因敲除過(guò)程中起到了十分關(guān)鍵的作用。在所有統(tǒng)計(jì)的論文中，同源臂最長(zhǎng)的達(dá)到約4 000 bp[22]，最短的僅160 bp[11]。

圖7 同源臂長(zhǎng)度的報(bào)道數(shù)量

4 結(jié)語(yǔ)

在生物技術(shù)日益發(fā)展的今天，基因敲除技術(shù)也逐漸變得簡(jiǎn)單易行，而假單胞菌作為一種分布廣泛的細(xì)菌，在環(huán)境修復(fù)、生物防治、生物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域有著十分重要的作用[3]。通過(guò)大量的假單胞菌基因敲除技術(shù)成功案例的比較，建議使用依賴自身同源重組基因敲除方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇一輪同源重組或兩輪同源重組進(jìn)行基因敲除，同源臂長(zhǎng)度選擇1 000～2 000 bp為宜，并采用接合轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

[1] 吳乃虎.基因工程原理[M].北京:科學(xué)出版社,1998:314.

[2] 布坎南R E,吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,1984:287.

[3] 楊復(fù)光,魏云林.假單胞菌研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].生物技術(shù)通報(bào),2011(1):37-39.

[4] MURPHY K C.Use of bacteriophage lambda recombination functions to promote gene replacement inEscherichiacoli[J].Journal of Bacteriology,1998,180(8):2063-2071.

[5] 趙峰,張穎,李慧,等.3種假單胞菌CaCl2法感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化條件[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2013,24(3):788-794.

[6] POTEETE A R.What makes the bacteriophage lambda Red system useful for genetic engineering:molecular mechanism and biological function[J].FEMS Microbiology Letters,2001,201(1):9-14.

[7] TAKAHASHI N,KOBAYASHI I.Evidence for the double-strand break repair model of bacteriophage lambda recombination[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1990,87(7):2790-2794.

[8] ELLIS H M,YU D G,DITIZIO T,et al.High efficiency mutagenesis,repair,and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2001,98(12):6742-6746.

[9] MURPHY K C.Lambda gam protein inhibits the helicase and chi-stimulated recombination activities ofEscherichiacoliRecBCD enzyme[J].Journal of Bacteriology,1991,173(18):5808-5821.

[10] WARMING S,COSTANTINO N,COURT D L,et al.Simple and highly efficient BAC recombineering using gaIK selection[J].Nucleic Acids Research,2005,33(4):e36.

[11] 余華,熊浚智,何曉梅,等.采用Red重組系統(tǒng)敲除銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2013,29(2):129-132.

[12] 楊運(yùn)文,蔣伏歡,宋杰,等.重組工程法敲除惡臭假單胞菌KT2440的染色體基因[J].南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,34(4):96-101.

[13] LUO X,YANG Y W,LING W,et al.PseudomonasputidaKT2440 markerless gene deletion using a combination ofλRed recombineering and Cre/loxPsite-specific recombination[J].FEMS Microbiology Letters,2016,363(4):fnw014.

[14] WINDGASSEN M,URBAN A,JAEGER K E.Rapid gene inactivation inPseudomonasaeruginosa[J].FEMS Microbiology Letters,2000,193(2):201-205.

[15] MERLIN C,MCATEER S,MASTERS M.Tools for characterization ofEscherichiacoligenes of unknown function[J].Journal of Bacteriology,2002,184(16):4573-4581.

[16] 韓海紅,汪俊卿,王騰飛,等.一種基于單交換原理的地衣芽孢桿菌基因敲除方法及應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志,2016,36(11):63-69.

[17] TANG H Z,YAO Y X,WANG L J.Genomic analysis ofPseudomonasputida:genes in a genome island are crucial for nicotine degradation[J].Scientific Reports,2012,2:377.

[18] 張加勤,饒慧華,徐巧麗,等.銅綠假單胞菌clpP基因缺陷株的構(gòu)建[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2015,31(7):627-630.

[19] WANG Y,ZHANG C,GONG T,et al.An upp-based markerless gene replacement method for genome reduction and metabolic pathway engineering inPseudomonasmendocinaNK-01 andPseudomonasputidaKT2440[J].Journal of Microbiology Methods,2015,113:27-33.

[20] LIU K Q,HU H B,WANG W,et al.Genetic engineering ofPseudomonaschlororaphisGP72 for the enhanced production of 2-hydroxyphenazine[J].Microbiology Cell Factories,2016,15:131.

[21] CUTHBERTSON L,MAINPRIZE I L,NAISMITH J H,et al.Pivotal roles of the outer membrane polysaccharide export and polysaccharide copolymerase protein families in export of extracellular polysaccharides in gram-negative bacteria[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2009,73(1):155-177.

[22] ZHAO J R,YU X,ZHU M,et al.Structural and molecular mechanism of CdpR involved in quorum-sensing and bacterial virulence inPseudomonasaeruginosa[J].PLoS Biology,2016,14(4):e1002449.

Research Progress of Gene Knockout inPseudomonas

XIONG Lie,QIAN Shu-lan,ZHU Cheng-yun,LI Jun,ZHONG Wei-hong*

(CollegeofBiologicalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032,China)

Geneknockoutisaverypopulargeneticengineeringtechnologyinrecentyears.Pseudomonasisacommonbacterium,whichisappliedverywidely.Therefore,geneknockoutinPseudomonasisverysignificant.WereviewthesuccessfulcaseofgeneknockoutinPseudomonas,andcomparetwokindsofgeneknockoutsystemsinthefollowingaspects:transformationmethodofkeystepinhomologousrecombination,choiceofgeneknockoutmethod,andchoiceofthelengthofhomologousarm,etc.

Pseudomonas;geneknockout;homologousrecombination

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31670115)

2017-03-23

熊烈(1992-)，男，浙江桐鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:357534323@qq.com；通訊作者：鐘衛(wèi)鴻，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:whzhong@zjut.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.08.002

Q819

A

1672-5425(2017)08-0005-05

熊烈，錢(qián)淑嵐，朱成云，等.假單胞菌基因敲除方法研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(8)：5-9.