陳鑫珠， 張建國

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系/廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心， 廣東 廣州 510642； 2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 福建 福州 350013)

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，青貯飼料已成為反芻動物日糧中不可缺少的常規(guī)飼料。常規(guī)的青貯主要是以新鮮的牧草、飼料作物等作為原料，利用其表面附著的乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)厭氧發(fā)酵來保存飼料營養(yǎng)的一項技術(shù)。青貯是一個非常復(fù)雜的微生物活動和生物化學(xué)變化過程，受許多因素的影響，但起主導(dǎo)作用，并決定青貯成敗的關(guān)鍵微生物是乳酸菌。牧草表面附著大量的微生物，乳酸菌僅占極少的一部分。張慧杰[1]報道，未收割的飼草表面主要附著有產(chǎn)氣單胞菌屬(Aeromonas)、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)、纖維桿菌屬(Cellulomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和黃單胞菌屬(Xanthomonas)的革蘭氏陰性菌等。Cai等[2]從黑麥草(LoliummultiflorumL)和苜蓿(MedicagosativaL.)中分離到植物乳桿菌(L.plantarum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、乳酸片球菌(P.acidilactici)、糞腸球菌(E.faecalis)、類腸系魏斯特菌(W.paramesenteroides)、假腸膜明串珠菌(L.pseudomesenteroides)6個株菌，將其分別添加到青貯料中，發(fā)現(xiàn)與糞腸球菌、類腸系魏斯特菌和假腸膜明串珠菌相比，乳酸片球菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌能夠更有效地提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)。保安安[3]研究了青藏高原不同地區(qū)垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb.)青貯飼料中乳酸菌多樣性及優(yōu)勢菌種的發(fā)酵特性，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同氣候條件下，乳酸菌的種類和數(shù)量存在明顯差異。牧草從刈割到青貯填裝過程中，由于刈割、切短等物理性創(chuàng)傷造成汁液的大量流出，為微生物的生長提供良好條件[4]。McDonald等[5]也曾報道，完整健康的植株存在著很少量的乳酸菌，在植株收獲時受到機械損傷，或者在鮮嫩植株或果實腌制過程中，由于受損傷的植物體組織滲出汁液提供營養(yǎng)，乳酸菌的種類和數(shù)量才會有較大的變化；另外，花、果實和植株的受傷部位菌數(shù)也較多。目前已有研究報道青貯發(fā)酵過程中乳酸菌的動態(tài)變化，但從牧草刈割到青貯填裝階段乳酸菌數(shù)量和種類已發(fā)生變化，而相關(guān)的研究報道較少。因此，本研究以甜玉米(ZeamaysL.)和熱研四號王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum‘Reyan No.4’)為材料，記錄從刈割到放置24 h階段乳酸菌的變化情況，為今后青貯添加劑的利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

甜玉米(ZeamaysL.)和熱研四號王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum‘Reyan No.4)種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城寧西試驗基地，采集時距地面10 cm無菌割取，裝入封口袋，4℃冰盒中冷藏，帶回實驗室立即分析。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗設(shè)計4個階段研究材料從刈割到青貯填裝前乳酸菌的動態(tài)變化，分別為刈割、切短、放置8 h和放置24 h，具體如表1所示。

表1 試驗設(shè)計Table 1 Design of experiments

1.3 分析方法

原料分析樣本放置105℃烘箱殺青30 min后，置65℃烘箱干燥48 h測得干物質(zhì)(dry matter，DM)含量[6]；緩沖能(buffer capacity，BC)的測定采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法[7]；粗蛋白(crude protein，CP)含量采用凱氏定氮法測定[6]；可溶性碳水化合物(water soluble-carbohydrate，WSC)含量采用Anthrone比色法定量[8]，同時取10 mL浸提液，在浸提液中加入少量陽離子交換樹脂，在14 000 r·min-1下離心5 min后，0.22 μm微孔濾膜過濾，利用高效液相色譜儀測定棉子糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和果糖，色譜條件：色譜柱(SUGAR P0810，日本)，流動相為超純水，流速0.8 mL·min-1，柱溫75℃，檢測器為RID-10A紫外檢測器。

1.4 乳酸菌的鑒定

乳酸菌的樣品分離與純化參考張慧杰[9]的方法進行，形態(tài)學(xué)和生理生化特性檢測參考凌代文和東秀珠[10]的方法進行。

需鑒定的菌株在4 mL的MRS培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)18 h，取菌液1.0 mL移入1.5 mL的離心管中，14 000 rpm·min-1離心3 min收集菌體，再用TE(10 mmol·L-1Tris-HCl, 0.1 mmol·L-1EDTA, pH 8.0)清洗兩次，參照Dongsheng Bacteria DNA Kit(東盛生物科技有限公司，廣州，中國)試劑盒提取乳酸菌的全長DNA。

乳酸菌菌株的16S rRNA 序列擴增參照張慧杰[9]方法進行，擴增后的PCR產(chǎn)物送華大生物科技有限公司(中國，廣州)測序，獲得16S rDNA序列信息后與GeneBank基因庫中16S rDNA序列進行比較。將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列在MEGA5軟件中進行序列同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其在發(fā)育樹中的位置，從而對乳酸菌進行種屬歸類。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel對數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用Duncan中的one-way方法進行單因素方差分析。測序所得的序列遞交到GeneBank，用Blast來找尋預(yù)期有最大同源性的序列。測序菌株的序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的16S rDNA同源性值大于98%，一般可判定他們屬于同一種。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同階段甜玉米和熱研四號王草特性變化

甜玉米秸稈從未切短到放置24 h 其DM、CP和WSC含量，pH值、LAB、細菌和霉菌的數(shù)量有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的變化。未切短材料CP和WSC含量顯著(P<0.05)高于其他3個階段，pH值顯著(P<0.05)低于其他3個階段；放置24 h后，DM顯著(P<0.05)升高，LAB、細菌和霉菌的數(shù)量顯著(P<0.05)增加；放置8 h到24 h階段DM含量和細菌數(shù)量升高最顯著(P<0.05)，CP、WSC含量，未切短到切短階段pH值變化最顯著(P<0.05)，切短到放置24 h階段霉菌的數(shù)量增加最顯著(P<0.05)(表2)。

表2 不同階段甜玉米特性變化Table 2 The changes of characteristics of Zea mays L. at different stages

注：同行不同小寫字母表示差異顯著；**P<0.01，*P<0.05，下同

Note: Different lowercase letters in the same row indicate significant difference; ** and * indicate significant difference at the 0.01 and 0.05 level, respectively. The same as below

熱研四號王草從未切短到放置24 h 其DM、WSC、半乳糖和果糖含量，pH值、緩沖能、LAB和霉菌的數(shù)量有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的變化。未切短材料WSC含量顯著(P<0.05)高于其他3個階段，LAB和霉菌的數(shù)量顯著(P<0.05)低于其他3個階段；放置24 h后DM、半乳糖和果糖含量、pH值、緩沖能顯著(P<0.05)高于其他3個階段；放置8 h到24 h階段DM、半乳糖和果糖含量、pH、緩沖能顯著升高(P<0.05)，未切短到切短WSC含量、LAB和霉菌的數(shù)量變化顯著(P<0.05)(表3)。

表3 不同階段王草特性變化Table 3 The changes of characteristics of Pennisetum purpureum×P.americanum‘Reyan No.4’at different stages

2.2 乳酸菌多樣性

甜玉米和熱研四號王草從未切短到放置24 h 4個階段，每個階段分離15株菌株，共分離120株菌株，經(jīng)革蘭氏染色、生理生化特性分析、16S rDNA分析確定80株為乳酸菌。4個階段乳酸菌種類沒有明顯變化，均分離到植物乳桿菌、乳酸乳球菌和融合魏斯氏菌；甜玉米3種菌從未切短到放置24 h所占比例變化不大(20.00%～22.22%，22.22%～30.00%，30.00%～55.56%)，熱研四號王草中乳酸乳球菌、融合魏斯氏菌和檸檬明串珠菌比例有增加的趨勢(16.67%～40.00%，8.33%～30.00%， 8.33%～20.00%)；熱研四號王草4個階段都分離到 檸檬明串珠菌和糞腸球菌，而甜玉米在新鮮材料中未分離到檸檬明串珠菌；在放置24 h階段中分離到10%的假腸膜明串珠菌，熱研四號王草在新鮮材料中分離到16.67%的短乳桿菌 (表4，5)。

表4 不同階段甜玉米乳酸菌種類與數(shù)量的變化Table 4 The species composition and variation of LAB on sweet corn at different stages

注：表格中百分比數(shù)表示此乳酸菌菌株占此階段分離得到總?cè)樗峋陻?shù)的百分比

Note: Data in the table mean the percentage of LAB strains to the total LAB strains

表5 不同階段王草材料乳酸菌種類與數(shù)量的變化Table 5 The species composition and variation of LAB on king grass at different stages

3 討論

飼草青貯的效果取決于主導(dǎo)發(fā)酵過程的優(yōu)勢乳酸菌的種類和數(shù)量，研究飼草中優(yōu)勢乳酸菌種類、數(shù)量和特性對于預(yù)測青貯質(zhì)量、開發(fā)乳酸菌青貯添加劑和調(diào)控青貯發(fā)酵有極其重要的意義[15]。在無外源乳酸菌添加條件下，青貯主要是依靠原料本身附著的乳酸菌進行發(fā)酵，因此，飼草原料中含有的乳酸菌種類、數(shù)量和活性會影響青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[16]。司丙文等[17]研究山竹巖黃芪(HedysarumfruticosumPall.)青貯中優(yōu)質(zhì)乳酸菌的分離和鑒定，分離獲得3株同型發(fā)酵乳酸菌，分別為蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtii)，乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp.Lactis)，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。崔棹茗等[16]在青藏高原青稞秸稈中分離出了3種同型發(fā)酵乳酸菌菌株，分別為植物乳桿菌(Lactabacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。本試驗發(fā)現(xiàn)4個階段乳酸菌數(shù)量均有增加，桿菌(Lactobacillusplantarum)比例變化不明顯，但球菌(Leuconostoccitreum、Weissellaconfusa和Enterococcusfaecalis)的比例明顯增加。這與Cai等[18]報道的發(fā)酵前牧草中的乳酸菌主要為球菌，乳酸桿菌的數(shù)量極少的結(jié)果相似。

Ercolani[19]報道，對于同種植物，種植在距離相近的不同地區(qū)和時間以及不同的生長季節(jié)，附生細菌的數(shù)量、規(guī)模也會不同。這些種群規(guī)模的差異在很大程度上是由葉際的生理特性和營養(yǎng)條件的波動造成的。劉長建[2]表明植物受傷部位汁液流出，為表面微生物提供營養(yǎng)，會產(chǎn)生大量微生物的聚集。本研究發(fā)現(xiàn)4個階段乳酸菌的種類與數(shù)量均有變化，有的菌種數(shù)量劇增，而有的菌種在某個階段出現(xiàn)或消失；從未切短到切短過程中，乳酸菌的種類和數(shù)量變化最大。不同牧草變化情況也不同，甜玉米切短后分離到檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)，放置24 h后分離到假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)；熱研四號王草切短后短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)消失。說明切短后植物受到損傷，大量營養(yǎng)物質(zhì)流出，能夠為乳酸菌的生長繁殖提供足夠的養(yǎng)分，從而造成某些種類乳酸菌的大量繁殖。由于植物組織受傷處提供更多的養(yǎng)分，乳酸菌在短時間內(nèi)能夠快速大量的生長繁殖，這種數(shù)量上的增加在切短或劃破時會更加顯著[3]。

4 結(jié)論

綜上所述，乳酸菌的種類和數(shù)量變化最大的階段是在植物從未切短到切短階段；其中桿菌(植物乳桿菌Lactobacillusplantarum)比例變化不明顯，但球菌(檸檬明串珠菌Leuconostoccitreum、融合魏斯氏菌Weissellaconfusa和糞腸球菌Enterococcusfaecalis)的比例明顯增加。放置時間延長，乳酸菌種類和數(shù)量也會有較大變化，不同的植物表現(xiàn)不同，甜玉米切短后分離得到檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)，放置24 h后分離得到假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)；熱研四號王草切短后短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)消失。