陳 瑩, 王 茜, 王子苑, 王小利

(貴州省草業(yè)研究所， 貴州 貴陽 550006)

貴州處于我國的西南部，是喀斯特地貌的核心部位，沉積了巨厚的碳酸鹽為主要的地層，出露面積占全省總面積的61.9%，素以“喀斯特博物館”著稱[1]。喀斯特石漠化生態(tài)系統(tǒng)的典型特征是生境的嚴酷性和脆弱性，嚴酷性集中表現(xiàn)為巖石裸露程度高、土層淺薄、保水能力差；生境的脆弱性表現(xiàn)在土地承載力低、穩(wěn)定性差、抗干擾能力弱且自然恢復(fù)慢[2]。隨著石漠化的加劇，植被種類、土壤肥力、土壤微生物等都發(fā)生了相應(yīng)的變化[3-5]，其中土壤微生物積極參與土壤物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程，是土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動力，如固氮作用、硝化作用、腐殖質(zhì)分解作用等，在土壤的形成、肥力演變、有毒物質(zhì)凈化方面起著重要作用[6]。土壤中的微生物是敏感群體，周圍環(huán)境發(fā)生變化就會對其產(chǎn)生相應(yīng)的影響[7]，細菌是微生物的主要類群，他個體小、數(shù)量多、繁殖快，在土壤的物質(zhì)循環(huán)中起著關(guān)鍵作用。因此土壤細菌的多樣性可以作為評價土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感指標和表征土壤質(zhì)量的生物學指標，對土壤的可持續(xù)利用具有重要意義[8-10]。

近年來，變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)是研究土壤微生物群落的有效工具，它直接分離土壤微生物的DNA片段，突破了傳統(tǒng)的微生物分離純化培養(yǎng)方法與顯微技術(shù)的局限性，已成為研究土壤微生物的重要手段之一[11-13]。Muyzer等最先采用PCR-DGGE研究微生物種群圖譜，發(fā)現(xiàn)這種方法能夠用于考察未知微生物群落的遺傳多樣性[14]。宋鐵英[15]認為通過DGGE法檢測稻田藍細菌的遺傳多樣性，可以避免因純化、培養(yǎng)以及人為經(jīng)驗判斷等因素造成的誤差，更能準確的判斷藍細菌的多樣性。因此，本研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)，對貴州不同程度石漠化灌叢草地土壤細菌的遺傳多樣性進行了分析，并探討了不同石漠化程度對土壤細菌遺傳多樣性的影響，有助于提高對灌叢草地生態(tài)系統(tǒng)功能演變的調(diào)控和預(yù)警能力，為灌叢草地資源的合理利用與保護管理以及退化草地生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)重建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

貴州省普定縣陳家寨村位于貴州中部偏西，E 105°49′7″，N 26°20′44″，石灰?guī)r山地面積大，石漠化程度多樣，占全縣總面積的35%左右，取樣地海拔1 300～1 400 m，植被以灌叢草地為主，草本植物耐旱的種類較多，包括鬼針草(Bidenspilosa)、酢漿草(Oxaliscorniculata)、千里光(SenecioscandensBuch)、白茅(Imperatacylindrica)等。灌木主要為刺梨(RosaroxburghiiTratt)、小果薔薇(RosacymosaTratt)、野拔子(ElsholtziarugulosaHemsl)、馬桑(CoriarianepalensisWall)、火棘(Pyracanthafortuneana)等，樣地土壤均為黑色石灰土。

圖1 潛在(A)、輕度(B)、中度(C)、重度(D)石漠化樣地Fig.1 Soil samples of potential rocky desertification(A), slight rocky desertification(B), medium rocky desertification(C) and severe rocky desertification(D)

1.2 土壤樣品采集

于2014年8月在普定縣陳家寨村進行取樣，根據(jù)巖石裸露程度，選擇潛在(A)、輕度 (B)、中度(C)和重度(D)4種石漠化典型樣地，以巖石縫玉米耕作地作為對照(E)，利用多點混合采樣法在深度為0～20 cm的土層進行取樣，取樣后放置于無菌保鮮袋中冷藏送回。

1.3 土壤微生物DNA提取

去除土樣里面的石子與植物殘體，過夜培養(yǎng)的細胞菌液中加入溶菌酶溶液，水浴后加入20 μL Proteinase K溶液，使細胞裂解，接著加入200 μL Buffer BD，200 μL 乙醇混勻，轉(zhuǎn)移至吸附柱中，靜置離心，棄廢液，加入500 μL PW Solution，離心棄廢液，加入500 μL Wash Solution，離心，倒掉濾液，最后取出吸附柱，放入一個新的1.5 mL離心管中，加入50 μL CE Buffer靜置3 min，12 000 rpm室溫離心2 min，收集 DNA溶液。

1.4 細菌16S rDNA片段的PCR擴增

以樣品基因組DNA為模板，采用細菌通用引物GC-338F和518R擴增樣品16S rDNA高變區(qū)序列。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR擴增體系(50 μL)為：10×PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mM)3.2 μL；rTaq(5 U·μL-1)0.4 μL；GC-338F(20 mM)1 μL；518R(20 mM)1 μL；模板DNA 50 ng；補ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.5 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

取10 μL PCR的產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。采用變形梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學變性劑為100%尿素7 mol·L-1和40%(v/v)的丙烯酰胺)在1×TAE緩沖液中150 V 60℃下電泳5 h。變性梯度凝膠電泳(DGGE)完畢后,采用銀染法染色。

1.6 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶，以2 μL回收產(chǎn)物為模板，338F/518R為引物進行PCR擴增。將擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到Pmd18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，菌液由華大基因?qū)Σ迦氲募毦?6S rDNA片段進行序列測定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

細菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個體數(shù)以及均勻度的綜合指標。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個條帶的強度(灰度)，對各樣品中細菌多樣性指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)等指標進行分析，計算方法如下：

其中，pi為樣品中單一條帶的強度在該樣品所有條帶總強度中所占的比率，N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度，Ni為第i條帶的豐度；S是某樣品中所有條帶數(shù)目總和。在GenBank中使用Blast程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16S rDNA序列。采用MEGA5軟件，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(bootstrap)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌16S rDNA的PCR擴增

提取5份混合土樣的土壤總DNA，經(jīng)測定DNA片段在20 kb左右，OD260/OD280比值在1.82～1.95之間，說明所提DNA的純度較好，并以GC-338F和518R為引物擴增16S rDNA序列，得到約200 bp的DNA片段(圖2)用于DGGE分析。

圖2 細菌16S rDNA的PCR擴增Fig.2 Amplification of the 16S rDNA in bacteria

2.2 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳

如圖3所示， 5個土樣的圖譜在條帶上的數(shù)目與位置并不一致，與對照玉米耕作地(E)相比，隨著石漠化程度的加強，條帶數(shù)目減少，而潛在石漠化土樣(A)的條帶最多，說明土壤細菌群落對環(huán)境有一定的選擇性。

圖3 DGGE指紋圖譜及Quantityone 軟件做的模式圖Fig.3 The DGGE fingerprinting and the mode chart made by Quantityone software

2.3 各樣品之間的細菌群落結(jié)構(gòu)相似性

通過UPGMA算法對圖譜作出的系統(tǒng)樹狀圖如圖4所示，我們可以看出5種類型的樣地分為2大族群，玉米耕作地(E)單獨為1個族，而剩下的4個樣地為1個大族。其中潛在(A)與輕度(B)石漠化土壤細菌PCR-DGGE圖譜相似度較高，而中度(C)與重度(D)石漠化相似度較高，說明隨著石漠化程度的加強，土壤的細菌群落有一個逐漸演替的過程。

圖4 依據(jù)樣品間的相似系數(shù)構(gòu)建的聚類圖Fig.4 The cluster dendrogram of the samples

2.4 不同石漠化土樣中細菌多樣性的分析

5個不同石漠化樣地的細菌多樣性分析如表2所示，可見5個樣地的細菌香農(nóng)指數(shù)與豐富度指數(shù)存在一定差異，隨著石漠化程度增強，均呈現(xiàn)一定的下降趨勢，均勻度指數(shù)的差別不大。說明隨著石漠化程度的增強與土壤細菌群落的多樣性和豐富度成負相關(guān)。而玉米耕作地的土壤細菌香濃指數(shù)、均勻度指數(shù)與豐富度指數(shù)最低，這表明土壤耕作后土壤中細菌的復(fù)雜度與豐富度顯著下降。

表2 各樣品之間的細菌多樣性分析Table 2 Analysis of bacteria diversity of sample

2.5 主要電泳條帶的序列測定

選取5個樣品在DGGE凝膠中特異的10個條帶，回收后，以338F/518R為引物進行PCR擴增，獲得約200 bp的DNA片段。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，每個回收條帶選取3個克隆進行序列測定，共獲得了30個片段的核苷酸序列，所有序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列的同源性為84%～100%，且大部分與數(shù)據(jù)庫中已知序列同源性低于97%，屬于分類在“種”地位上新發(fā)現(xiàn)細菌。測試結(jié)果顯示30個克隆分屬于Anaerolineae(厭氧繩菌綱)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)4大類群，其中第1個條帶存在2種不同的細菌菌株信息，這說明同一個條帶可能含有不同的菌種，用MEGA4.0分析了序列有差異的13個片段，通過GenBank中Blast程序所獲近似序列進行菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖4所示，13個序列片段聚成了10個分支，分別屬于Geobacter(地桿菌屬)，Blastocatella，Chitinophaga，F(xiàn)erruginibacter，Thioalbus，Lysobacter(溶桿菌)，Terrimonas，Bizionia，Anaerolinea(厭氧繩菌屬)，Sphingomonas(鞘氨醇單胞菌屬)，說明這5種土樣中的細菌具有高度的遺傳多態(tài)性與復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)。

圖4 16s rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed by 16S rDNA sequences

3 討論與結(jié)論

3.1 不同石漠化程度對土壤細菌群落的影響

土壤微生物在土壤的形成與發(fā)育、物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與能量的傳遞等過程中發(fā)揮著重要作用，并與土壤肥力及土壤的健康有著密切的關(guān)系，是評價土壤質(zhì)量的重要指標之一[16-18]。何尋陽[19]研究發(fā)現(xiàn)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的因素很多，但是最重要的因素是有機質(zhì)的復(fù)雜性與數(shù)量，它提供了大量的碳、氮資源，而植被的變化必然會導致土壤有機質(zhì)的改變，從而引起土壤微生物組成、活性與代謝功能發(fā)生改變。張平究[20]在研究植被恢復(fù)對喀斯特土壤生化特性的影響中發(fā)現(xiàn)，植被恢復(fù)顯著地提高了土壤養(yǎng)分、微生物活性、細菌種群豐富度及基因多樣性，植被恢復(fù)演替下土壤細菌群落結(jié)構(gòu)之間的多樣性遵循如下趨勢:裸露地<(稀)草地<灌叢。這說明隨著喀斯特環(huán)境植被恢復(fù)的變化，土壤微生物種類及其多樣性也會隨之改變。本研究結(jié)果顯示：與對照玉米耕作地(E)相比，隨著石漠化程度的加強，地上植被從灌木逐漸演替到草本植物，植被種類、數(shù)量顯著減少，而通過DGGE指紋圖譜進行分析，條帶數(shù)目隨石漠化程度加深而減少，潛在石漠化土樣(A)的條帶最多，5個樣地的細菌香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)與石漠化程度成負相關(guān)，而玉米耕作地土壤細菌香指數(shù)、均勻度指數(shù)與豐富度指數(shù)最低，這與張平究的研究結(jié)果類似，說明隨著石漠化程度的加劇，地面裸露程度增加，導致地面植被種類、蓋度隨之減少，進而影響到土壤一系列的生化反應(yīng)，導致土壤中參與生化反應(yīng)的細菌種類和數(shù)量發(fā)生了改變。另一方面，在石漠化地區(qū)的土地上進行農(nóng)業(yè)耕作，降低了土壤細菌群落多樣性，對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)帶來了負面的影響。

3.2 土壤細菌遺傳多樣性對不同石漠化的響應(yīng)

本研究選取5個樣品在DGGE凝膠中特異的10個片段進行克隆測序，每個片段選擇3個克隆進行序列測定，結(jié)果顯示，克隆片段在系統(tǒng)發(fā)育分析中聚成10個分支，說明土壤細菌在不同程度石漠化土壤中會形成不同的種類，隨著石漠化程度的加重，細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，并且改變了土壤細菌群落的遺傳多樣性，但值得注意的是，沒有檢測到的細菌類群不能歸納為沒有，因為本文只是選擇部分克隆用于分析和測序，這里細菌多樣性的比較與其說是反映土壤細菌群落多樣性，不如說是反映細菌群落的物種豐度[21]。本研究在構(gòu)建克隆文庫中，超過一半序列是屬于新的“種”分類上的細菌，對這些新細菌的進一步研究，將有助于揭示石漠化生態(tài)系統(tǒng)功能退化的微生物機理。

綜上所述，本試驗結(jié)果顯示石漠化程度越嚴重，土壤中的細菌群落復(fù)雜性與多樣性越低，在不同程度石漠化灌叢草地土壤中細菌會形成不同的群落結(jié)構(gòu)，并具高度的遺傳多樣性。另一方面，在石漠化土地上進行農(nóng)耕作業(yè)會明顯降低土壤中細菌的豐富度與多樣性，這會影響土壤的肥力，并對土壤的健康狀態(tài)帶來負面的影響，因此在制定石漠化恢復(fù)的措施時，要考慮到土壤微生物對生態(tài)系統(tǒng)的重要作用，采用多種植物混播的培育模式。