雷杰

摘 要：Veriflow?檢測(cè)系統(tǒng)是一種基于分子生物學(xué)的測(cè)定方法，可準(zhǔn)確檢測(cè)乳制品、肉制品、整雞淋洗液和即食食品中的沙門(mén)氏菌。該檢測(cè)方法將PCR檢測(cè)與快速、可視化的垂直流層析法相結(jié)合，不需要純化樣品、凝膠電泳或基于熒光素?cái)U(kuò)增目標(biāo)菌，后期沒(méi)有復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析過(guò)程。針對(duì)8個(gè)不同的食品和環(huán)境基質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果表明：對(duì)于含量極低的沙門(mén)氏菌（人工接種或自然存在），Veriflow沙門(mén)氏菌檢測(cè)（SS）都表現(xiàn)出很高的檢測(cè)靈敏度。通過(guò)對(duì)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Veriflow檢測(cè)結(jié)果與FDA微生物分析手冊(cè)BAM的方法和美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全與檢驗(yàn)局微生物實(shí)驗(yàn)室方法USDA/FSIS MLG的結(jié)果沒(méi)有顯著差異。包容性、排他性、性能穩(wěn)定性等研究結(jié)果均表明Veriflow SS是一款穩(wěn)定、可靠的產(chǎn)品，能高靈敏性、高選擇性、高包容性地檢測(cè)環(huán)境表面、乳制品、肉、整雞淋洗液和各類即食食品中的沙門(mén)氏菌。

關(guān)鍵詞：沙門(mén)氏菌屬 Veriflow 包容性 排他性 靈敏度

引言

致病菌帶給企業(yè)和消費(fèi)者的危害不言而喻，各國(guó)政府和企業(yè)都對(duì)食源性致病菌的快速診斷寄予厚望，這也使各種檢測(cè)方法層出不窮。美國(guó)Veriflow DNA簽名捕獲技術(shù)的致病菌、腐敗菌檢測(cè)系統(tǒng)，以其快速、準(zhǔn)確、可視化等特點(diǎn)在各種檢測(cè)方法中獨(dú)樹(shù)一幟，是一項(xiàng)具有創(chuàng)新性的分子檢測(cè)技術(shù)，即使在未經(jīng)凈化處理的樣品基質(zhì)中也能高靈敏、高精確的檢測(cè)目標(biāo)菌。

1 材料和方法

1.1 材料

a.標(biāo)準(zhǔn)菌株：性能穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性測(cè)試中陽(yáng)性樣本和陰性樣本的培養(yǎng)物，分別采用鼠傷寒沙門(mén)氏菌（ATCC 14028）和枸櫞酸桿菌（ATCC 8090）；包容性和排他性測(cè)試菌株分別采用104株不同血清型沙門(mén)氏菌菌株和35株非沙門(mén)氏菌。

b.樣品基質(zhì)：生牛肉（20%的脂肪）、牛奶（2%的脂肪）、整雞淋洗液、熱狗。

1.2 Veriflow沙門(mén)氏菌（SS）檢測(cè)原理和檢測(cè)流程

Veriflow SS是一種基于PCR和DNA簽名捕獲技術(shù)的檢測(cè)方法，將PCR與DNA簽名探針和垂直層析流系統(tǒng)相結(jié)合，能夠提供特異的、高靈敏度的靶標(biāo)分子簽名檢測(cè)和快速、易解的檢測(cè)結(jié)果。

本研究中，對(duì)各種基質(zhì)進(jìn)行采樣、增菌和PCR擴(kuò)增，獲得沙門(mén)氏菌屬的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接滴加到層析卡盒的樣本視窗里，再加入4滴緩沖液，僅需3分鐘即可產(chǎn)生反應(yīng)信號(hào)。拉動(dòng)檢測(cè)卡盒上的開(kāi)關(guān)，觀察檢測(cè)結(jié)果。出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線，表示層析卡盒工作正常。質(zhì)控線和檢測(cè)線都出現(xiàn)表示沙門(mén)氏菌屬陽(yáng)性，而只出現(xiàn)質(zhì)控線，則表示為陰性結(jié)果（如圖1所示）。

1.3 穩(wěn)定性驗(yàn)證研究

性能穩(wěn)定性（魯棒性）驗(yàn)證研究：目的是評(píng)估Veriflow SS PCR操作步驟中的微小改變（樣本煮沸時(shí)間、緩沖液滴加量或?qū)游隹ê蟹磻?yīng)時(shí)間）是否能影響其檢測(cè)性能（如表1）。

批次間穩(wěn)定性驗(yàn)證研究：選擇2013年9～10月間的3個(gè)批次Veriflow SS檢測(cè)系統(tǒng)，批號(hào)依次為ML 0025、ML 0028和ML 0029，在放置0、6和12個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（如表2所示）。每個(gè)批次對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，各用10個(gè)陽(yáng)性樣本和5個(gè)陰性樣本。

包容性和排他性研究：用Veriflow SS檢測(cè)104株沙門(mén)氏菌屬菌株和35株排他性菌株。

1.4 Veriflow SS與FDA推薦沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法對(duì)比

食品基質(zhì)檢測(cè)方法比較：不同的食品基質(zhì)接種不同血清型的沙門(mén)氏菌，食品基質(zhì)的每個(gè)樣品中均加入稀釋24h的肉湯培養(yǎng)物，充分混合，在4℃下平衡48～72h。通過(guò)3種檢測(cè)濃度下的陽(yáng)性樣品個(gè)數(shù)，來(lái)計(jì)算MPN。

整雞胴體檢測(cè)方法比較：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩批各20個(gè)樣本一直保存在4±2℃。每份樣本用400mL IS BPW進(jìn)行淋洗，從每份雞肉淋洗液中各取36mL和30mL，分別用于Veriflow SS和FDA推薦方法檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 性能穩(wěn)定性和批次穩(wěn)定性研究

性能穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：操作步驟的變動(dòng)不會(huì)影響Veriflow SS的測(cè)試性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合AOAC-RI PTM要求的分?jǐn)?shù)計(jì)算，且所有的陽(yáng)性樣本都經(jīng)FDA和USDA參考方法確認(rèn)。這些結(jié)果表明，某些測(cè)試參數(shù)的變化不會(huì)直接影響Veriflow SS的測(cè)定性能。

批次間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)清晰地表明：3個(gè)批次的Veriflow SS不同使用時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定性能都保持一致。同時(shí)，這些結(jié)果也說(shuō)明Veriflow SS在12個(gè)月的使用期限間，均能保持穩(wěn)定的測(cè)定性能。

2.2 包容性和排他性研究

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Veriflow SS能準(zhǔn)確的檢測(cè)104株不同的沙門(mén)氏菌屬。與包容性結(jié)果一致，排他性研究結(jié)果也證明Veriflow SS能準(zhǔn)確區(qū)分沙門(mén)氏菌屬和其他細(xì)菌。

2.3 食品基質(zhì)檢測(cè)方法結(jié)果比較

食品基質(zhì)檢測(cè)結(jié)果：3個(gè)不同接種水平的樣品，低濃度的檢測(cè)樣中，Veriflow SS檢測(cè)方法和FDA 參考方法陽(yáng)性檢出率無(wú)顯著差異，所有的只接種干擾菌的樣本，通過(guò)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，故兩種方法統(tǒng)計(jì)學(xué)上不存在顯著性差異。

整雞胴體檢測(cè)結(jié)果：基于POD統(tǒng)計(jì)分析，兩種方法不存在顯著性差異（陽(yáng)性樣品均采用參考方法確認(rèn)）。

3 討論和結(jié)論

上述檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明：與FDA和USDA參考方法相比，對(duì)于乳、肉、整雞和即食食品等8種基質(zhì)中104種沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，Veriflow SS與FDA和USDA參考方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，具有很好的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。與參考方法相比，Veriflow不需要復(fù)雜樣品制備，僅需18～24h就可以得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，大大短于參考方法3～4天的檢測(cè)時(shí)間。因此，本研究的結(jié)果表明：Veriflow沙門(mén)氏菌檢測(cè)系統(tǒng)是一種靈敏、可靠和簡(jiǎn)單易操作的快速致病菌檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] U.S. Food and Drug Administration （2001） Bacteriological Analytical Manual， Ch. 5， “Salmonella，” https：//www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm.endprint