柴成梁 常曉嬌 王楠希 伍松陵 孫長(zhǎng)坡

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表達(dá)及其降解毒素初步研究

柴成梁 常曉嬌 王楠希 伍松陵 孫長(zhǎng)坡

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是由鐮刀菌屬產(chǎn)生的次生代謝物,是極易污染糧食作物的真菌毒素之一。ZEN具有強(qiáng)烈的雌激素樣效應(yīng)及致癌性，給人類和動(dòng)物的健康造成巨大威脅。本研究在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì)，獲得了一些ZHD101降解酶的同源基因，其中，1個(gè)來源于真菌——楊盤二孢菌(Marssoninabrunnea)的蛋白序列與ZHD101具有32%的同源性，基因大小為861 bp。通過化學(xué)合成方法得到該全長(zhǎng)基因，通過構(gòu)建E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)，蛋白經(jīng)親和色譜純化后對(duì)ZEN分子進(jìn)行降解活性驗(yàn)證，HPLC結(jié)果表明，該蛋白在6 h內(nèi)對(duì)10 μg ZEN分子的降解率為98%，酶活為200U/mL，從而獲得了1個(gè)新的ZEN降解酶基因。

玉米赤霉烯酮 ZEN降解酶基因 克隆 蛋白表達(dá)純化

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)主要是由鐮刀菌屬(Fusariumspecies)產(chǎn)生的次生代謝物，是世界上污染范圍最廣的一種鐮刀菌毒素[1]，易受ZEN污染的糧食作物包括玉米、大麥、小麥、高粱和黑麥等[2]。ZEN的化學(xué)名稱為6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β-雷鎖酸內(nèi)酯，其結(jié)構(gòu)與雌性激素雌二醇(estradiol)的結(jié)構(gòu)相似，ZEN能夠與動(dòng)物細(xì)胞膜上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，引起ER的構(gòu)象改變，ZEN/ER復(fù)合物被進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與雌激素效應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂[3-4]。ZEN被攝入到哺乳動(dòng)物體內(nèi)，可引起哺乳動(dòng)物陰道炎、假發(fā)情及發(fā)情周期延長(zhǎng)、流產(chǎn)、不育以及畸形等的“高雌性激素癥”(hyperestrogenism)[5-6]。ZEN通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，可導(dǎo)致性早熟，甚至引起乳腺癌、食管癌等發(fā)病率增加[7-8]，對(duì)人類健康造成巨大威脅。

微生物降解法消除ZEN污染是利用微生物在代謝過程中產(chǎn)生的酶與ZEN作用，破壞ZEN分子的毒性基團(tuán)，使其被降解或轉(zhuǎn)化為無毒產(chǎn)物的過程。生物降解法降解ZEN特異性強(qiáng)、ZEN分子被轉(zhuǎn)化效率高、不會(huì)引起環(huán)境污染，因此可科學(xué)有效地消除糧食作物中的ZEN污染，具有極好的應(yīng)用前景[9]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于ZEN的生物降解研究已取得了一定的進(jìn)展，篩選到了包括細(xì)菌、真菌在內(nèi)的多株具有降解或轉(zhuǎn)化ZEN活性的微生物[10]。首次將ZEN降解為無毒產(chǎn)物的研究者是El-Sharkawy和Abul-Hajj，他們發(fā)現(xiàn)1株絲狀真菌——粉紅粘帚霉Gliocladiumroseum，可將ZEN分子的內(nèi)酯鍵打開，得到的降解產(chǎn)物無雌性激素活性[11]。日本研究者Takahashi等[12]發(fā)現(xiàn)的粉紅粘帚霉ClonostachysroseaIFO7063，可破壞ZEN分子的內(nèi)酯環(huán)，得到的降解產(chǎn)物無雌性激素活性，并通過進(jìn)一步研究，得到了起降解作用的水解酶，克隆出了編碼水解酶的基因ZHD101。目前，ZHD101蛋白的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析出，明確了ZHD101與ZEN分子的結(jié)合方式，為ZHD101在消減糧食中的ZEN污染提供了重要基礎(chǔ)[13]。國(guó)內(nèi)研究者程波財(cái)?shù)萚14]發(fā)現(xiàn)的ZEN降解酶基因ZEN-jjm，以及劉海燕等[15]發(fā)現(xiàn)的zlhx-6均對(duì)ZEN具有較好的降解效果。

本試驗(yàn)用ZHD101為模板，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)，獲得了一些ZHD101降解酶的同源序列，其中，一個(gè)來源于真菌——楊盤二孢菌(Marssoninabrunnea)的蛋白序列與ZHD101具有32%的同源性，基因大小為861 bp。通過化學(xué)合成方法得到該全長(zhǎng)基因，通過構(gòu)建PET30a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)宿主，IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行蛋白表達(dá)，蛋白經(jīng)親和色譜純化后與ZEN分子孵育，進(jìn)行降解活性驗(yàn)證，用HPLC方法檢測(cè)ZEN分子是否被降解，本研究提供了一個(gè)發(fā)掘ZEN降解酶的新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 引物和載體

試驗(yàn)所用引物列于表1中，試驗(yàn)中連接所用載體為PET30a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存，采用限制性內(nèi)切酶NdeI/XhoI雙酶切，因此用于克隆目的基因的引物中也需要含有NdeI/XhoI、酶切位點(diǎn)或相應(yīng)的同尾酶酶切位點(diǎn)(XhoI的同尾酶是SalI)。引物序列中包含保護(hù)堿基、限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)及一段與目的基因匹配的基因序列。

表1 引物列表

1.1.2 試劑、工具酶及培養(yǎng)基

高保真DNA聚合酶和Taq：TAKARA公司；限制性內(nèi)切酶：TAKARA公司和NEB公司；T4 DNA連接酶：Promega公司；DNA marker和Protein marker：Genstar公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒堿裂解法小量提取試劑盒：中科瑞泰公司；dNTP和DNA熒光染料Goldview：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；甲醇、乙腈(色譜純)：北京DIKMA 公司；ZEN標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去離子水定容至1 L，于121 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂粉；10×PBS緩沖液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，加去離子水定容至1 L，用鹽酸調(diào)pH至7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試驗(yàn)儀器設(shè)備

PCR熱循環(huán)擴(kuò)增儀、電泳槽、恒壓/恒流電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)：Bio-rad公司；超聲波破碎儀：美國(guó)Sonics公司；恒溫?fù)u床：瑞士Infors公司；高速離心機(jī)(低溫)：Thermo公司；高速離心機(jī)(室溫)：Eppendorf公司；親和層析介質(zhì)Ni-NTA：GE公司；e2695高效液相色譜儀、熒光檢測(cè)器(2475)、xbridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：美國(guó)Waters公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因合成及體外擴(kuò)增

根據(jù)Genebank中mbZHD的基因序列，委托蘇州金唯智生物科技有限公司對(duì)mbZHD基因進(jìn)行全合成，合成后基因克隆到pUC57 載體上。為表達(dá)分析，需將mbZHD基因克隆到PET30a載體上。應(yīng)用DNASTAR.Lasergene.v7.1進(jìn)行基因序列分析，設(shè)計(jì)一對(duì)引物如表1所示，引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)進(jìn)行mbZHD的基因的體外擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系見表2。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序?yàn)?1)95 ℃變性5 min；(2)94 ℃變性30 s；(3)54 ℃退火30 s；(4)72 ℃延伸(延伸時(shí)間根據(jù)基因片斷長(zhǎng)度計(jì)算)；(5)步驟(2)(4)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；(6)72 ℃延伸10 min；(7)20 ℃ 10 min。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物條帶從瓊脂糖膠上切下，按照中科瑞泰公司DNA回收試劑盒上的步驟進(jìn)行回收。將回收后的PCR產(chǎn)物在37 ℃進(jìn)行NdeI/SalI雙酶切。將回收的酶切產(chǎn)物在4 ℃連接入PET30a載體。將連接產(chǎn)物加入100 μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s后，加入400 μL無抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)50 min(復(fù)蘇)，然后將菌液涂到卡那霉素(Kanamycin，Kan)抗性的LB平板上，37 ℃放置過夜，次日挑取生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行陽性克隆鑒定。

1.2.3 陽性克隆的獲得

挑取平板上的單菌落于1 mL Kan抗性LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，3 h后進(jìn)行PCR陽性克隆篩選。PCR鑒定為陽性后，測(cè)序，準(zhǔn)確無誤后確定該克隆為陽性克隆，按照中科瑞泰質(zhì)粒小提試劑盒上的步驟進(jìn)行質(zhì)粒抽提，保存于-20 ℃。

1.2.4 mbZHD重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的mbZHD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在Kan抗性的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，次日挑取單菌落到10 mL LB培養(yǎng)基中在37 ℃培養(yǎng)搖床中200 r/min培養(yǎng)至較為混濁時(shí)，轉(zhuǎn)接到1 L LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)菌生長(zhǎng)到OD值為1左右時(shí)，將搖床溫度降至15 ℃，加入0.5 mL濃度為0.6 mol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)過夜，次日收菌純化蛋白。

1.2.5 mbZHD重組蛋白的純化

將過夜表達(dá)的菌體離心收集，棄上清，加入30 mL重懸緩沖液，將細(xì)菌沉淀懸起后超聲破碎細(xì)菌，將破碎的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入高速離心管中，高速離心后把上清加入到Ni-NTA親和柱中，讓其流過親和介質(zhì)。用10倍柱體積的漂洗緩沖液漂洗親和介質(zhì)，洗掉非特異性結(jié)合的雜蛋白，用5 mL 洗脫緩沖液將目的蛋白從親和柱上洗脫下來，-80 ℃保存。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行mbZHD蛋白的表達(dá)純化分析。

1.2.6 ZEN降解酶活性測(cè)定

取純化的mbZHD蛋白50 μL，加入到含ZEN質(zhì)量濃度為10 μg/mL的eppendorf管中，以不加mbZHD蛋白的同濃度ZEN溶液作對(duì)照，37 ℃反應(yīng)6 h，100 ℃加熱10 min終止反應(yīng)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干反應(yīng)體系，加入1 mL甲醇，超聲萃取，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜檢測(cè)，根據(jù)ZEN濃度的變化來分析mbZHD蛋白對(duì)ZEN是否具有降解活性。高效液相色譜檢測(cè)ZEN的色譜條件為：色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，xbridge) ；流動(dòng)相：超純水/色譜級(jí)乙腈=50/50(V/V)；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；色譜柱溫度設(shè)定：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL； 熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)∶ 274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(Em)∶ 440 nm；采集時(shí)間：13 min。

ZEN生物降解率的計(jì)算方法：取純化的mbZHD蛋白，加入到含ZEN質(zhì)量濃度為10 μg/mL的eppendorf管中(反應(yīng)組)，以不加mbZHD蛋白的同濃度ZEN溶液作對(duì)照，終止反應(yīng)后，用高效液相色譜檢測(cè)，對(duì)照組樣品和反應(yīng)組樣品的ZEN收峰面積之差即為降解掉的ZEN。

測(cè)得的酶活性用酶活單位U/mL表示，1 U/mL酶活定義為1 mL純化后的酶液在1 min內(nèi)降解1 ng ZEN毒素。

2 結(jié)果與分析

2.1 mbZHD基因序列的獲得

以ZEN降解酶ZHD101(264 aa)為模板，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì)，獲得1個(gè)可能降解ZEN分子的降解酶基因mbZHD，該基因來源于1株真菌——楊盤二孢菌，表達(dá)產(chǎn)物為286個(gè)氨基酸。通過將mbZHD與ZHD101比對(duì)發(fā)現(xiàn)，mbZHD與ZHD101具有32%的同源性，如圖1所示。

2.2 mbZHD基因PCR

按表2的PCR反應(yīng)體系，以合成的mbZHD全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?，通過PCR方法擴(kuò)增mbZHD(1-286 aa)基因，PCR結(jié)果如圖2所示。

2.3 陽性克隆的獲得

將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布Kan抗性LB平板，挑取生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖3所示。PCR鑒定為陽性后，測(cè)序，準(zhǔn)確無誤后確定該克隆為陽性克隆。

注：黑色標(biāo)記的氨基酸為2蛋白中的相同氨基酸；黑色方框內(nèi)的氨基酸為2蛋白中性質(zhì)相似氨基酸；無標(biāo)記的氨基酸為2蛋白中不相同氨基酸。圖1 mbZHD與ZHD101蛋白序列比對(duì)圖

注：1泳道是目的基因mbZHD；M為DNA Marker。圖2 mbZHD基因瓊脂糖凝膠電泳

注：1泳道為空質(zhì)粒對(duì)照；2、3、4泳道為轉(zhuǎn)入含目的基因質(zhì)粒的單菌落；M為DNA Marker。圖3 陽性克隆的PCR鑒定

2.3 mbZHD蛋白的表達(dá)純化

將過夜表達(dá)mbZHD蛋白的菌體超聲破碎，轉(zhuǎn)入高速離心管中高速離心后，把上清用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白。因?yàn)槟康牡鞍譵bZHD融合有組蛋白標(biāo)簽，能與Ni-NTA親和介質(zhì)結(jié)合，從而與雜質(zhì)蛋白分開，然后用高濃度咪唑?qū)⒛康牡鞍讖腘i-NTA親和介質(zhì)上洗脫下來，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行mbZHD蛋白的表達(dá)純化分析，根據(jù)目的蛋白的大小判斷其在凝膠上的位置，結(jié)果如圖4所示。

注：1泳道是表達(dá)mbZHD蛋白的菌體超聲破碎后的樣品；2泳道是從Ni-NTA親和柱上洗脫下來的樣品；M是Protein Marker。圖4 mbZHD蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.4 mbZHD蛋白對(duì)ZEN的降解活性測(cè)定

取純化的mbZHD蛋白50 μL，加入到含ZEN質(zhì)量濃度為10 μg/mL的eppendorf管中(反應(yīng)組)，以不加mbZHD蛋白的同濃度ZEN溶液作對(duì)照，37 ℃反應(yīng)6 h后，用高效液相色譜檢測(cè)，在上述色譜條件下，對(duì)照組樣品在保留時(shí)間RT=10.715 min處有強(qiáng)吸收峰，而反應(yīng)組樣品基本無ZEN目標(biāo)峰檢出，經(jīng)吸收峰面積計(jì)算，已有98%的ZEN分子被降解，降解酶酶活為2×102U/mL。

注：在保留時(shí)間RT=10.715 min處，無吸收峰(實(shí)線)的是反應(yīng)組樣品，有吸收峰(虛線)的是對(duì)照組樣品。圖5 反應(yīng)組樣品與對(duì)照組樣品HPLC圖

3 討論與結(jié)論

本研究以ZEN降解酶ZHD101(264aa)為模板，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì)，獲得1個(gè)可能降解ZEN分子的降解酶基因mbZHD，該基因來源于1株真菌——楊盤二孢菌，表達(dá)產(chǎn)物為286個(gè)氨基酸。通過構(gòu)建E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)，蛋白經(jīng)純化后對(duì)ZEN分子進(jìn)行降解活性試驗(yàn)，結(jié)合高效液相色譜檢測(cè)，證實(shí)了該蛋白具有降解ZEN活性，從而發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的ZEN降解酶基因，說明通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì)從而發(fā)現(xiàn)ZEN降解酶基因的方法確實(shí)可行。

通過將mbZHD與ZHD101比對(duì)發(fā)現(xiàn)，mbZHD與ZHD101具有32%的同源性。通過在相同降解酶濃度條件及相同的酶活定義下，比較ZEN降解酶mbZHD、ZHD101、ZEN-jjm對(duì)ZEN的降解活性發(fā)現(xiàn)，mbZHD對(duì)ZEN的降解活性為200 U/mL，而ZHD101與ZEN-jjm對(duì)ZEN的降解活性為mbZHD的2倍，即為400 U/mL。顯然，分析造成這些降解酶對(duì)ZEN降解活性存在差異的原因尤為重要。下一步的工作是試圖解析mbZHD的蛋白結(jié)構(gòu)，通過比較mbZHD與ZHD101的結(jié)構(gòu)差異以及對(duì)ZEN的降解活性差異，來判斷此類水解酶的哪些氨基酸殘基對(duì)降解ZEN分子起到關(guān)鍵作用，以此為依據(jù)對(duì)ZEN降解酶進(jìn)行分子改造，提高降解酶活性，為ZEN降解酶在消減糧食及其副產(chǎn)物中的ZEN污染提供基礎(chǔ)。

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Preliminary Study on Prokaryotic Expression and Its Degradation Activity of a New Zearalenone-Degradation Enzyme(mbZHD)

Chai Chengliang Chang Xiaojiao Wang Nanxi Wu Songling Sun Changpo

(Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037)

Zearalenone (ZEN) was a mycotoxin produced mainly by fungi belonging to the genusFusariumwhich frequently contaminated crops. ZEN had an intense estrogen-like effects and was extremely carcinogenic, which posed great threats to the health of animals and human. Through homologous alignment in NCBI, some homologous

sequences of ZHD101 degradation enzyme were found, and one of them which came from fungus -protein sequences ofMarssoninabrunnea-was found to be 32% homologic to ZHD101, and the gene size was 861bp. To determine its ZEN-degrading activity, the full-length gene was obtained by chemical synthetic method, and the protein expression was made by constructingE.coliExpression System HPLC results showed that the degradation rate of protein aganst 10 μg ZEN within 6 h was 98%; the enzyme activity was 200 U/mL and a new ZEN-degradation enzyme was successfully obtained.

zearalenone，ZEN-degradation enzyme，gene cloning，protein expression and purification

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAK43B01)，公益性行業(yè)(糧食)科研專項(xiàng)(201513006)

2016-06-17

柴成梁，男，1984年出生，助理研究員，生物化學(xué)與分子生物學(xué)

孫長(zhǎng)坡，男，1975年出生，研究員，糧油微生物與質(zhì)量安全

Q71

：A

：1003-0174(2017)08-0029-06