江亞杰 汪中明 張 濤 賀培歡 李福君 曹 陽(yáng) 伍 祎

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院1，北京 100037) (河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院2，鄭州 450001)

基于DNA條形碼技術(shù)的儲(chǔ)糧害蟲碎片鑒定研究

江亞杰1,2汪中明1張 濤1賀培歡1李福君1曹 陽(yáng)1伍 祎1

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院1，北京 100037) (河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院2，鄭州 450001)

儲(chǔ)糧害蟲(螨)個(gè)體微小，種類繁多，與人類生活緊密相關(guān)，具有重要經(jīng)濟(jì)意義，儲(chǔ)糧害蟲快速鑒定是進(jìn)行儲(chǔ)糧害蟲綜合防治的前提和基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)糧食及食品中害蟲的非成蟲態(tài)和碎片的準(zhǔn)確鑒定，DNA條形碼是近年來(lái)出現(xiàn)的物種分子鑒定技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)昆蟲非成熟蟲態(tài)及碎片的快速鑒定。本研究利用DNA條形碼技術(shù)和聯(lián)合開(kāi)發(fā)的中國(guó)儲(chǔ)糧害蟲DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(GPDBIS)，針對(duì)某食品有限公司送檢的儲(chǔ)糧害蟲碎片樣品進(jìn)行了序列測(cè)定、比對(duì)和分析，最終實(shí)現(xiàn)碎片的快速準(zhǔn)確鑒定。結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的7個(gè)害蟲碎片樣品中，有4頭為銹赤扁谷盜CryptolestesferrugineusStephens，3頭為赤擬谷盜TriboliumcastaneumHerbst，DNA條形碼技術(shù)是儲(chǔ)糧害蟲快速準(zhǔn)確鑒定的有效手段。

儲(chǔ)糧害蟲 害蟲碎片 DNA條形碼 GPDBIS系統(tǒng) 分子鑒定

儲(chǔ)糧害蟲是一類與人類生活緊密相關(guān)，具有重要經(jīng)濟(jì)意義的害蟲。糧食儲(chǔ)藏期間，環(huán)境適宜、食源豐富，導(dǎo)致儲(chǔ)量害蟲頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響糧食的數(shù)量和質(zhì)量、種子的發(fā)芽率、糧油產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)儲(chǔ)糧害蟲的代謝物和蟲尸是成品糧的主要衛(wèi)生污染物[1-2]，為微生物在糧油產(chǎn)品上滋生提供有利條件，甚至導(dǎo)致人類過(guò)敏反應(yīng)。

儲(chǔ)糧昆蟲種類調(diào)查及其快速鑒定是進(jìn)行儲(chǔ)糧害蟲綜合防治的前提和基礎(chǔ)，截止2000年，全世界已記載的倉(cāng)儲(chǔ)昆蟲和螨類約500種，我國(guó)有383種，其中倉(cāng)儲(chǔ)昆蟲242種，螨類141種[3]。儲(chǔ)糧昆蟲種類多，個(gè)體微小，傳統(tǒng)的儲(chǔ)糧昆蟲(包括螨類)鑒定工作主要依靠形態(tài)學(xué)特征，區(qū)分不同昆蟲種類之間的形態(tài)學(xué)差別往往非常細(xì)微和復(fù)雜，需要嚴(yán)格的專業(yè)知識(shí)學(xué)習(xí)和培訓(xùn)，且很難對(duì)未成熟蟲態(tài)(卵、幼蟲及蛹)、殘損樣品以及形態(tài)相似種類進(jìn)行快速鑒定。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行儲(chǔ)糧昆蟲鑒定，不受樣品個(gè)體發(fā)育狀態(tài)和環(huán)境條件的影響，對(duì)非成蟲態(tài)昆蟲及形態(tài)特征不完整的樣品，可直接從DNA水平上得到準(zhǔn)確、可靠的鑒定。

近年來(lái)，隨著DNA檢測(cè)和分析技術(shù)的快速發(fā)展，各種分子生物技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于倉(cāng)儲(chǔ)害蟲的種類鑒定。在倉(cāng)儲(chǔ)害蟲中，已成功運(yùn)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)[4-5]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)[6-7]和基于PCR特異引物技術(shù)實(shí)現(xiàn)了物種的快速鑒定[8-10]。通過(guò)測(cè)定某個(gè)或某幾個(gè)基因的序列來(lái)進(jìn)行種類鑒定和區(qū)分的DNA條形碼(DNA barcode)技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展和使用[11]。分類學(xué)家 Hebert 等[12-13]首次提出“生物條形碼”的概念，認(rèn)為線粒體COI基因一段約700 bp的片段可作為動(dòng)物 DNA 條形碼，這一技術(shù)可以讓非專業(yè)人員在很短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行鑒定。

基于線粒體上“生物條形碼”COI基因，國(guó)家糧食局科學(xué)研究院和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物入侵檢疫實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合測(cè)試了我國(guó)常見(jiàn)儲(chǔ)糧蟲螨條形碼序列，并且設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了中國(guó)儲(chǔ)糧害蟲DNA條形碼鑒定系統(tǒng)GPDBIS(the Grain Pests DNA Barcode Identification System)。該系統(tǒng)涵蓋了我國(guó)15個(gè)省市34個(gè)糧庫(kù)糧堆中42種儲(chǔ)糧蟲螨的COI條形碼序列，其中鞘翅目17種，嚙蟲目10種，螨類9種，鱗翅目3種，半翅目2種，膜翅目1種。GPDBIS是為我國(guó)儲(chǔ)糧害蟲(螨)DNA條形碼的獲得、分析及鑒定提供幫助的信息平臺(tái)。通過(guò)整合生物分子、形態(tài)、區(qū)域分布及防治的數(shù)據(jù)，為我國(guó)儲(chǔ)糧害蟲的綜合防治提供信息支持。

本研究基于GPDBIS系統(tǒng)，應(yīng)用DNA條形碼分子鑒定技術(shù)，對(duì)2015年某食品有限公司送檢的害蟲碎片樣品進(jìn)行mtDNA COI基因片段的序列檢測(cè)，序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)儲(chǔ)糧害蟲碎片的快速、準(zhǔn)確鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

儲(chǔ)糧害蟲碎片來(lái)自于某食品有限公司方便面包裝盒上，7個(gè)碎片，收集后液浸于100%的乙醇中并于-20 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)儀器

Leica M數(shù)字顯微鏡：Leica公司；MicroCL 17臺(tái)式離心機(jī)、VXE380超低溫冰箱：Thermo scientific公司；Veriti TM 96-well Thermal CyclerPCR儀：Applied Biosystems公司；Gel Logic 212 PRO凝膠成像系統(tǒng)：Kodak公司；DYCP-31D水平式電泳槽、DYY-7C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠；UV-Vis spectrophotometer Q5000微量核酸濃度檢測(cè)儀：Quawell公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

單一碎片樣品基因組DNA的提取選用天根生化科技(北京)有限公司商業(yè)化試劑盒“微量基因組DNA提取試劑盒”，提取過(guò)程參照試劑盒的使用說(shuō)明。提取完成后取1 μL DNA模板溶液，用微量核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)DNA的濃度和純度，剩余基因組DNA放置于-20 ℃保持備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

擴(kuò)增的目的片段是mtDNA中COI基因，約650 bp的一段序列，擴(kuò)增引物參考Folmer所使用的LCO-1490和HCO-2198[14]，LCO-1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′，HCO-2198 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，由北京奧科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)的總體積為52 μL，具體包含:6.0 μL 10×buffer緩沖液，3.0 μL MgCl2，2.0 μL dNTPS， 0.4 μLTaqDNA聚合酶，上下游引物各3.0 μL(10 μmol/L)， ddH2O 32.6 μL，DNA模板2.0 μL。反應(yīng)條件為94 ℃加熱3 min，然后進(jìn)行39次PCR循環(huán)：94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物保存于4 ℃。取4 μL PCR產(chǎn)物，加入1 μL 6×Loading buffer，混勻，在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)(1×TAE緩沖液，電壓100 V，30 min)，采用marker D2000作為分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，EB染色15 min后在紫外分光光度計(jì)下觀察PCR的擴(kuò)增結(jié)果。為保證獲取序列的準(zhǔn)確性，以同一碎片的DNA為模板，進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，將獲取的PCR反應(yīng)產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化并測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)在ABI-3730測(cè)序儀上進(jìn)行雙向測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將獲得的序列利用軟件Chromas 1.45[15]檢測(cè)序列峰圖，利用DNAMAN 5.2(Lynnon BioSoft)進(jìn)行序列雙向比對(duì)拼接，獲取拼接序列后去除兩端引物序列，得到單條準(zhǔn)確序列。然后在GPDBIS數(shù)據(jù)庫(kù)中的“序列比對(duì)和鑒定”功能進(jìn)行相似性比對(duì)，以確定所擴(kuò)增的序列的種類，然后查看鑒定結(jié)果以及相似性數(shù)據(jù)，最后利用MEGA 5.0[16]軟件采用最大似然法(ML)、鄰接法(NJ)和簡(jiǎn)約法(MP)構(gòu)建所檢測(cè)的7個(gè)碎片樣品與GPDBIS數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)儲(chǔ)糧害蟲種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以核實(shí)確定鑒定的結(jié)果，明確待鑒定種類在主要儲(chǔ)糧害蟲中的系統(tǒng)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察結(jié)果

通過(guò)數(shù)字顯微鏡觀察，待鑒定樣品缺乏主要的形態(tài)鑒定特征，初步確定7片送檢樣品為鞘翅目碎片，可能為赤擬谷盜/雜擬谷盜/銹赤扁谷盜/長(zhǎng)角扁谷盜/土耳其扁谷盜等(圖1)，通過(guò)形態(tài)鑒定無(wú)法鑒定到種的水平。

注：a 待測(cè)碎片，b 赤擬谷盜，c 銹赤扁谷盜。圖1 待測(cè)樣品形態(tài)鑒定

2.2 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后含有一段700 bp左右片段，結(jié)果如圖2所示，其中M泳道為Marker，1～7泳道為7個(gè)儲(chǔ)糧害蟲碎片的擴(kuò)增產(chǎn)物，第8泳道為陰性對(duì)照。條形碼基因擴(kuò)增結(jié)果條帶清晰，可作為測(cè)序和后續(xù)研究。獲得的序列經(jīng)過(guò)正反向拼接、同物種序列比對(duì)和人工校正，最終得到了長(zhǎng)度為650 bp的高質(zhì)量COI序列7條。

注：M為D2000 Marker，1～7為7個(gè)儲(chǔ)糧害蟲碎片,8為陰性對(duì)照。圖2 儲(chǔ)糧害蟲碎片COI基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 相似性比對(duì)鑒定結(jié)果

經(jīng)GPDBIS的分子鑒定結(jié)果為：7個(gè)碎片中包括了2種鞘翅目害蟲，其中4個(gè)為銹赤扁谷盜，3個(gè)為赤擬谷盜。銹赤扁谷盜有4頭，對(duì)應(yīng)上述PCR擴(kuò)增結(jié)果的第1、3、4、7泳道，其中1、4、7序列完全相同，序列單倍型命名為CF-Hap1；泳道3的銹赤扁谷盜序列命名為CF-Hap2、CF-Hap1與CF-Hap2存在5個(gè)堿基的變異(表1)。這2條序列與GPDBIS中收錄的銹赤扁谷盜比對(duì)均能找到相似性為100%的序列，其中與CF-Hap1完全一致的銹赤扁谷盜序列包括廣東、廣西、重慶，與CF-Hap2完全一致的序列來(lái)自廣東、海南。赤擬谷盜為3頭，對(duì)應(yīng)上述PCR擴(kuò)增結(jié)果的第2、5、6泳道，其中2、6序列完全相同，序列命名為TC-Hap1；泳道5的序列命名為TC-Hap2，TC-Hap1與TC-Hap2存在9個(gè)堿基變異(表1)。這2條序列與GPDBIS中收錄的赤擬谷盜比對(duì)，結(jié)果顯示廣東、廣西與TC-Hap1完全一致，而廣東、四川成都的種群與TC-Hap2完全一致。進(jìn)一步將獲得的2個(gè)種4條單倍型序列與GenBank上的數(shù)據(jù)比對(duì)分析，表明待鑒定的種分別為銹赤扁谷盜和赤擬谷盜。

表1 同一物種不同單倍型間的堿基差異

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

利用MEGA 5.0軟件，分別采用最大似然法、鄰接法和簡(jiǎn)約法構(gòu)建各條序列與GPDBIS數(shù)據(jù)庫(kù)中主要鞘翅目害蟲序列之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)基本相似，以鄰接法構(gòu)建的結(jié)果進(jìn)行分析(圖3)。分屬各物種的個(gè)體的聚集趨勢(shì)十分顯著，待鑒定的4條序列中，2條與銹赤扁谷盜聚為一個(gè)類群，2條與赤擬谷盜聚為一個(gè)類群，這表明同一物種的個(gè)體可以和其他物種的個(gè)體很好地區(qū)分開(kāi)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建更明了的展現(xiàn)了待鑒定害蟲碎片的種類，同時(shí)可直觀看出各個(gè)害蟲種類在系統(tǒng)樹(shù)上的關(guān)系，如4種扁谷盜聚類在一個(gè)大的分支，米象和玉米象，赤尼谷盜與雜尼谷盜等近似種分別聚在同一個(gè)大的分支上，且每一個(gè)種有其獨(dú)立的小分支。進(jìn)一步說(shuō)明運(yùn)用該方法和GPDBIS系統(tǒng)能準(zhǔn)確鑒定儲(chǔ)糧害蟲碎片。

圖3 NJ法構(gòu)建未知種及其相關(guān)種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

通過(guò)進(jìn)行線粒體DNA上COI基因700 bp序列的測(cè)定和基于GPDBIS系統(tǒng)的比較分析，送檢的7個(gè)害蟲碎片樣本得到了成功的鑒定和區(qū)分，其中銹赤扁谷盜4頭，赤擬谷盜3頭。本研究得到的序列可以作為DNA 條形碼序列補(bǔ)充進(jìn)GPDBIS系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以應(yīng)用于原糧、食品加工廠以及一線口岸的進(jìn)出口糧食及食品實(shí)際檢疫工作中的害蟲鑒定，這種方法的推廣在保證物種鑒定準(zhǔn)確性的同時(shí)，將大大降低非成蟲態(tài)及蟲尸碎片在實(shí)際鑒定工作中的難度，提高鑒定效率。同時(shí)，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了650 bpCOI基因片段序列可以對(duì)儲(chǔ)糧害蟲達(dá)到種水平的區(qū)分，從而實(shí)現(xiàn)有關(guān)物種的快速、準(zhǔn)確鑒定。

GPDBIS系統(tǒng)作為我國(guó)儲(chǔ)糧蟲螨的分子鑒定系統(tǒng)需要逐步的完善和改進(jìn)。首先，蟲螨的種類需要進(jìn)一步豐富，目前該系統(tǒng)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)僅包括42種儲(chǔ)糧蟲螨，雖然由于儲(chǔ)糧設(shè)施和技術(shù)的改進(jìn)，主要儲(chǔ)糧害蟲種類有所下降，但是我國(guó)建國(guó)以來(lái)進(jìn)行了6次倉(cāng)儲(chǔ)害蟲調(diào)查，每次的種類均在百種以上，因此要達(dá)到全面的應(yīng)用需要不斷豐富和增加蟲螨種類。其次，GPDBIS系統(tǒng)在功能上需要完善，系統(tǒng)目前僅包括單一的基因mtDNA COI片段，以后將逐步補(bǔ)充其他基因片段，以針對(duì)不同對(duì)象，選取合適的基因進(jìn)行鑒定、地理種群差異分析等。

各種DNA分子標(biāo)記已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于親子鑒定和個(gè)體識(shí)別領(lǐng)域[17]，在儲(chǔ)糧害蟲分子鑒定領(lǐng)域也有了長(zhǎng)足進(jìn)展[18]。某些物種在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，由于外界因素(溫度、濕度、光照以及地形地貌等)產(chǎn)生了地理隔離，形成了不同的地理種群品系，這種變異在形態(tài)上很難區(qū)分，但是會(huì)在基因水平上表現(xiàn)出來(lái)，通過(guò)分子技術(shù)手段得到直觀的體現(xiàn)。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，除了對(duì)物種的準(zhǔn)確快速鑒定外，未來(lái)將逐步實(shí)現(xiàn)不同區(qū)域、不同品系的鑒定和區(qū)分，這對(duì)追溯食品害蟲來(lái)源，保障食品安全將起到重要作用。

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Molecular Identification of Stored Grain Pest Fragments by DNA Barcoding

Jiang Yajie1,2Wang Zhongming1Zhang Tao1He Peihuan1Li Fujun1Cao Yang1Wu Yi1

(Academy of State Administration of Grain1, Beijing 100037) (College of Grain, Henan University of Technology2, Zhengzhou 450001)

Stored grain pest (mite) was small individuals with various species, which was related to human lifeclosely and has important economic significance. Rapid identification of stored grain pests was the prerequisite and foundation of integrated pest management. It was difficult to identify immatures and fragments of insect in grain and food by morphological characteristics. Emerging as a promising molecular technology of species identification, DNA barcodes could realize rapid identification of the immatures and fragments. In this study, in order to identify pest fragments samples collected from a food Co., Ltd., based on the DNA barcoding and GPDBIS system, a series of studies, including sequencing, alignment and analysis, were conducted. The results showed that four of the seven insect fragments specimens wereCryptolestesferrugineusStephens, and three of them wereTriboliumcastaneumHerbst.DNA barcode could be used to identify the species of stored-grain insects/mites rapidly and accurately.

stored grain pest, Insect fragments, GPDBIS, DNA barcode, molecular identification

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0401004)，糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201513002)

2016-06-20

江亞杰，男，1991年出生，碩士，農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治

伍祎，女，1980年出生，副研究員，植物保護(hù) 曹陽(yáng)，男，1958年出生，研究員，糧油儲(chǔ)藏

Q-1

：A

：1003-0174(2017)08-0131-05