李朝煒+劉穎+王丹娜+陽秦婧+魏景芳

摘要：為研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚轉(zhuǎn)化的影響因素，以2個小麥品種石4185、科麥一號的成熟胚為轉(zhuǎn)化受體材料，分別以GV3101、EHA105、LBA4404等3種農(nóng)桿菌菌株（含有pCAMBIA1380雙元載體）為供體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，主要檢測成熟胚愈傷組織β-葡萄糖苷酸酶（GUS）報告基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，不同小麥品種對轉(zhuǎn)化體系的反應(yīng)各不相同，菌株、受體的基因型以及外植體的繼代時間和生理狀態(tài)等均對轉(zhuǎn)化效率有很大的影響。GV3101的侵染轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于另外2個菌株，石4185成熟胚愈傷對農(nóng)桿菌侵染的敏感性比科麥一號要高。繼代培養(yǎng)時間的延長會不同程度地影響小麥成熟胚愈傷的轉(zhuǎn)化效果。通過對轉(zhuǎn)化體系幾個影響因素的研究，有助于提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)成熟胚轉(zhuǎn)化體系的效率。

關(guān)鍵詞：小麥；成熟胚；農(nóng)桿菌；GUS表達(dá)率

中圖分類號： S512.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0045-03

lizhaowei79@163.com。小麥?zhǔn)鞘澜缛蠹Z食作物之一，種植較為廣泛，一直占據(jù)著世界糧食產(chǎn)量的重要地位。近年來，通過分子改良的方法對其進(jìn)行研究以緩解目前糧食短缺問題已逐漸成為研究重點[1]。在針對小麥的轉(zhuǎn)基因研究中，基因槍法是應(yīng)用最多的轉(zhuǎn)化方法，但同時也存在試驗成本高、轉(zhuǎn)化效率較低以及外源基因容易存在多個拷貝等缺點[2-3]，相比較而言，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化則具有操作簡單、成本較低、所轉(zhuǎn)移基因拷貝數(shù)少、可轉(zhuǎn)移較大DNA片段等優(yōu)點，近年來已成為研究者關(guān)注的熱點，成功獲得了眾多轉(zhuǎn)化植株[4-8]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥大多以幼胚作為外植體，可獲得相對較高的誘導(dǎo)率和再生率，但是取材會面臨諸多困難和限制；而以成熟胚作為外植體，具有取材便利、無氣候與季節(jié)性影響、可保證不同個體間生理狀況一致等優(yōu)點，具有較高的研究價值[9-10]。小麥的基因組非常復(fù)雜，不同基因型之間遺傳轉(zhuǎn)化條件差異較大，轉(zhuǎn)化體系的有效性及轉(zhuǎn)化機制等諸多問題尚待解決。目前用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化的體系與玉米、水稻等單子葉植物相比仍然存在明顯差距，而這種普遍較低的轉(zhuǎn)化效率也制約了小麥基因工程改良的進(jìn)一步發(fā)展[11-12]。本研究以小麥成熟胚為轉(zhuǎn)化受體，針對菌株、基因型、愈傷培養(yǎng)時間等幾個影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥的重要因素進(jìn)行比較和優(yōu)化，為進(jìn)一步提高侵染效果、改善農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系提供參考。

1材料與方法

1.1植物材料

供試小麥品種為普通冬小麥品種石4185和科麥一號，均由筆者所在實驗室保存。

1.2菌株及植物表達(dá)載體

農(nóng)桿菌菌株為EHA105、GV3101和LBA4404；植物表達(dá)載體為pCAMBIA1380，該質(zhì)粒T-DNA區(qū)帶有由CaMV35S啟動子驅(qū)動的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因、潮霉素（HYG）基因。均由筆者所在實驗室保存。

1.3方法

1.3.1種子滅菌與愈傷組織誘導(dǎo)選取無霉變的飽滿種子，經(jīng)75%乙醇消毒2 min，無菌水沖洗干凈，用0.1%氯化汞消毒8～10 min，再用無菌水沖洗3次，置于適量無菌蒸餾水中，25 ℃避光浸泡16～18 h。在超凈臺中取出種子，小心剝離出胚，盾片向上置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 2，4-D+30 g/L 蔗糖+8 g/L瓊脂，pH值5.8）上。置于培養(yǎng)箱中 25 ℃ 暗培養(yǎng)。愈傷誘導(dǎo)15 d后切去長出的芽，挑選長勢良好的愈傷組織，去掉胚后轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.4 g/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）+150 μmol/L 乙酰丁香酮+40 g/L麥芽糖+8 g/L瓊脂，pH值5.8）。如有需要每20 d在相同培養(yǎng)基上繼代1次。

1.3.2小麥愈傷的農(nóng)桿菌侵染及共培養(yǎng)侵染前2～3 d挑取含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種于5 mL含有50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。再按1 ∶50的比例轉(zhuǎn)接到含有相同抗生素的液體YEB培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.6～0.8。離心收集菌體，重懸于侵染培養(yǎng)基（1/10MS+2.0 mg/L 2，4-D+400 mg/L MES+200 μmol/L乙酰丁香酮+40 g/L麥芽糖，pH值5.8）中，調(diào)整D600 nm為0.6。在超凈臺中選取淡黃色致密的愈傷組織，轉(zhuǎn)入鋪有滅菌紗布的培養(yǎng)皿中，倒入含有菌體的侵染培養(yǎng)基，將愈傷組織完全浸泡，室溫侵染40 min。隨后用滅菌紗布將愈傷組織托起并瀝干液體，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到鋪有3層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于24 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)2～3 d。

1.3.3脫菌與抗性愈傷篩選將共培養(yǎng)后的愈傷組織移入滅菌培養(yǎng)瓶中，用脫菌液（MS+2.0 mg/L 2，4-D+40 g/L麥芽糖+500 mg/L特美?。┣逑?次，每次浸泡30 min，最后棄去脫菌液，將愈傷組織移至滅菌濾紙上，在超凈臺中干燥1 h。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有300 mg/L特美汀的繼代培養(yǎng)基中，24 ℃ 黑暗恢復(fù)培養(yǎng)7 d。再將其轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基（2.0 mg/L 2，4-D+50 mg/L潮霉素+300 mg/L特美汀+40 g/L麥芽糖+8 g/L瓊脂）中，26 ℃黑暗條件下進(jìn)行篩選培養(yǎng)。

1.3.4GUS染色GUS活性的組織化學(xué)染色檢測，按 Jefferson 的方法[13]進(jìn)行。待經(jīng)過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的愈傷組織在含有潮霉素抗性的篩選培養(yǎng)基上篩選一段時間之后，每個小麥品種各挑取一部分抗性愈傷組織進(jìn)行GUS表達(dá)檢測。

1.3.5試驗結(jié)果分析統(tǒng)計本研究中相應(yīng)公式如下：

GUS表達(dá)率=（GUS表達(dá)受體組織塊數(shù)/感染總受體組織塊數(shù)）×100%；endprint

抗性愈傷率=（抗性愈傷數(shù)/供試愈傷數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同農(nóng)桿菌菌株對小麥成熟胚愈傷轉(zhuǎn)化的影響

本研究分別采用攜帶表達(dá)載體的3種農(nóng)桿菌菌株（EHA105、GV3101、LBA4404）對石4185和科麥一號的成熟胚愈傷組織進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入含有潮霉素抗性的篩選培養(yǎng)基中，篩選一段時間之后，挑選抗性愈傷組織進(jìn)行GUS基因檢測。結(jié)果顯示，3種農(nóng)桿菌菌株對小麥成熟胚愈傷的侵染轉(zhuǎn)化效果不同，EHA105和GV3101對愈傷的侵染效果要明顯優(yōu)于LBA4404（圖1）。經(jīng)EHA105和GV3101侵染轉(zhuǎn)化的愈傷組織，在抗性篩選5 d之后，2個小麥品種的絕大部分愈傷組織呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色。篩選20 d之后，愈傷組織GUS染色的面積明顯縮小、顏色變淡，并且僅有部分愈傷組織表面可見GUS基因表達(dá)。篩選5 d時，GUS基因仍屬于瞬時表達(dá)，此時呈現(xiàn)較深的藍(lán)色，說明以35S啟動的GUS基因在小麥愈傷組織細(xì)胞中得到了表達(dá)；篩選20 d時，不同處理中顯示藍(lán)色的部分均明顯減弱且面積變小，此時GUS基因已經(jīng)基本整合到植物基因組中。經(jīng)LBA4404侵染轉(zhuǎn)化的愈傷組織，抗性篩選5 d時GUS表達(dá)情況不強，整體染色較淺；而篩選至20 d時，大部分愈傷組織塊已無明顯GUS基因表達(dá)，說明此菌株對這2種小麥愈傷的侵染效果較差。

2.2不同基因型小麥成熟胚愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率比較

石4185和科麥一號這2個小麥品種經(jīng)過不同農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化并經(jīng)抗生素篩選20 d后，分別統(tǒng)計其愈傷組織的GUS表達(dá)率。圖2結(jié)果表明，GV3101菌株對石4185的轉(zhuǎn)化效果最好，GUS表達(dá)率達(dá)到64.3%；LBA4404菌株對這2種小麥成熟胚愈傷的侵染效果均較差，GUS表達(dá)率均不足30.0%，尤其是對科麥一號的轉(zhuǎn)化，GUS表達(dá)率僅為16.0%；EHA105菌株的轉(zhuǎn)化效果居中，并且對2種小麥的轉(zhuǎn)化效果差異不大。

從圖2還可以看出，石4185和科麥一號這2個小麥品種在相同農(nóng)桿菌菌株及轉(zhuǎn)化條件處理時的轉(zhuǎn)化效率有所差異。石4185對3種農(nóng)桿菌侵染的反應(yīng)效果均不同，經(jīng)GV3101菌株的侵染效果最佳，篩選20 d后的GUS表達(dá)率最高；經(jīng)EHA105菌株侵染的效果居中，GUS表達(dá)率為42.8%；經(jīng)LBA4404菌株侵染的效果最不敏感，GUS表達(dá)率為29.3%。3種農(nóng)桿菌侵染石4185的表達(dá)率差異明顯。科麥一號經(jīng)EHA105、GV3101菌株的侵染轉(zhuǎn)化效果差異不明顯，GUS表達(dá)率分別為32.7%、31.0%；經(jīng)LBA4404菌株侵染的效果最差，GUS表達(dá)率僅有16.0%。

2.3不同繼代培養(yǎng)時間對小麥成熟胚愈傷轉(zhuǎn)化的影響

在探索不同農(nóng)桿菌菌株及不同基因型小麥在轉(zhuǎn)化效率方面的差異之后，選取石4185作為受體材料，以GV3101為侵染菌株，進(jìn)一步分析繼代培養(yǎng)時間對成熟胚愈傷轉(zhuǎn)化效率的影響。在試驗中分別選取誘導(dǎo)后繼代培養(yǎng)不同時間的愈傷組織，每個處理條件接種120～150個愈傷塊進(jìn)行試驗，分別經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及潮霉素抗性篩選20 d后計算抗性愈傷的獲得率，隨后將抗性愈傷進(jìn)行GUS染色分析并統(tǒng)計表達(dá)率。

表1結(jié)果顯示，隨著繼代培養(yǎng)時間的延長，石4185愈傷的轉(zhuǎn)化效果會受到一定的影響，培養(yǎng)時間不同，石4185的抗性愈傷率和GUS表達(dá)率在0.05水平存在著顯著差異。在愈傷培養(yǎng)時間超過60 d后，抗性愈傷率和GUS表達(dá)率均隨培養(yǎng)時間的延長而下降。隨著培養(yǎng)時間的延長，GUS表達(dá)率比抗性愈傷率的下降程度更為明顯。因此，針對本試驗所采用的轉(zhuǎn)化體系，在進(jìn)行成熟胚愈傷的農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化時，愈傷的繼代培養(yǎng)時間不可過長，控制在2個月之內(nèi)為好。

3結(jié)論與討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前植物上應(yīng)用最為廣泛的基因轉(zhuǎn)化方法之一，自20世紀(jì)80年代出現(xiàn)以來，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于煙草、棉花、馬鈴薯等多種雙子葉植物和玉米、水稻等一些單子葉植物中。自Cheng等首次利用農(nóng)桿菌侵染獲得轉(zhuǎn)基因小麥以來[5]，近年來對其轉(zhuǎn)化體系的研究已取得不少成果。為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率，研究者在添加酚類物質(zhì)、調(diào)整菌體濃度和侵染時間、選用高滲處理或表面活性劑、采用不同共培養(yǎng)方式等方面做過很多有效的探索和嘗試。此外，菌株、受體基因型、外植體的類型、繼代時間和生理狀態(tài)等也被證實對轉(zhuǎn)化效率具有很大的影響[2-4，11-15]。

研究者普遍認(rèn)為，不同的農(nóng)桿菌菌株對小麥外植體的侵染能力存在差別，即使對同一基因型的小麥侵染能力也不同[2-3，6，11]。本研究中3種菌株GV3101、EHA105和LBA4404介導(dǎo)的對小麥成熟胚愈傷的轉(zhuǎn)化效果也體現(xiàn)出這一點。此外，從本研究可見，經(jīng)EHA105侵染的愈傷在抗性篩選5 d時GUS染色的效果較GV3101侵染時要略深一些，但篩選20 d后卻比GV3101表現(xiàn)要差一些。其原因是在篩選5 d時，GUS基因尚屬瞬時表達(dá)，EHA105的瞬時轉(zhuǎn)化效果更好，很可能是由于該菌株侵染毒力強；而在篩選20 d時，絕大多數(shù)顯示GUS染色陽性的愈傷組織已經(jīng)是穩(wěn)定表達(dá)，而GV3101的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效果要強于EHA105。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，LBA4404的轉(zhuǎn)化效果不佳，可能是由于與EHA105、GV3101的侵染毒性相比，LBA4404更為溫和。但也有研究顯示，LBA4404溫和的侵染毒性更適于進(jìn)行轉(zhuǎn)化[2]。而多數(shù)研究者的研究結(jié)果顯示，侵染毒性較強的農(nóng)桿菌菌株對小麥的轉(zhuǎn)化效果較好。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥的遺傳轉(zhuǎn)化中，不同基因型小麥之間也存在對農(nóng)桿菌敏感性的明顯差異。從本研究可見，利用3種菌株進(jìn)行侵染時，石4185的敏感性均優(yōu)于科麥一號，尤其對GV3101的敏感性最強，GUS表達(dá)率最高。因此，小麥基因型之間的差別，不僅是愈傷再生體系方面的主要影響因素，同時也對遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要影響，這也是小麥復(fù)雜性的又一體現(xiàn)[2-4，11，14]。本研究將不同小麥基因型與不同農(nóng)桿菌菌株對轉(zhuǎn)化效率的影響結(jié)合起來進(jìn)行對比研究，對于小麥轉(zhuǎn)基因育種水平的提高具有一定的現(xiàn)實意義。endprint

雖然GUS表達(dá)率并不能完全代表小麥農(nóng)桿菌侵染的最終轉(zhuǎn)化效率，但可以作為一項重要的參考指標(biāo)。以往研究顯示，能夠檢測出GUS基因表達(dá)的受體，分化再生之后對其進(jìn)行PCR檢測，一般也能夠檢測出目的基因；而即使GUS基因無表達(dá)時，目的基因也并非一定沒有轉(zhuǎn)化成功，可能是GUS基因表達(dá)很弱，肉眼觀察不到所致[16]。因此在本研究中選用這樣一項簡單直觀的報告基因來進(jìn)行轉(zhuǎn)化體系效率的分析，可以直觀地了解到轉(zhuǎn)化體系的效果。

綜上所述，不同的農(nóng)桿菌菌株對小麥的侵染轉(zhuǎn)化效果不同；同一菌株對不同基因型小麥的侵染能力也不同。因此利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行小麥轉(zhuǎn)基因研究時，應(yīng)當(dāng)針對具體所用的外植體狀態(tài)，采用適宜菌株，探索最佳轉(zhuǎn)化條件，才能獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。

參考文獻(xiàn)：

[1]奚亞軍，路明. 小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究現(xiàn)狀及在育種上的應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2002，18（3）：55-57，108.

[2]王永勤，肖興國，張愛民. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化幾個影響因素的研究[J]. 遺傳學(xué)報，2002，29（3）：260-265.

[3]宋成麗，王翾，徐虹，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚轉(zhuǎn)化的影響因素[J]. 麥類作物學(xué)報，2012，32（2）：209-214.

[4]張月琴，陳耀鋒，王麗，等. 小麥成熟胚培養(yǎng)條件的優(yōu)化及高效基因型篩選[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2014，32（5）：100-105.

[5]Cheng M，F(xiàn)ry J E，Pang S，et al. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Physio1，1997，115：971-980.

[6]Xia G M，Li Z Y，He C X，et al. Transgenic plant regeneration from wheat（Triticum aestivum L.） mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Acta Phytophysiol Sin，1999，25（1）：22-28.

[7]葉興國，Shirley S，徐慧君，等. 小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株的穩(wěn)定獲得和檢測[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34（5）：465-468.

[8]Wu H，Sparks C，Amoah B，et al. Factors influencing successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat[J]. Plant Cell Rep，2003，21（7）：659-668.

[9]劉香利，劉縉，郭藹光，等. 小麥不同外植體離體培養(yǎng)與再生研究[J]. 麥類作物學(xué)報，2008，28（4）：568-572.

[10]安海龍，衛(wèi)志明，黃健秋. 小麥幼胚培養(yǎng)高效成株系統(tǒng)的建立[J]. 植物生理學(xué)報，2000，26（6）：532-538.

[11]趙芳方，田保明，位芳. 基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響因素的分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（19）：8443-8445.

[12]李朝煒，姚彬，苗苗，等. 不同品種小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)與分化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（13）：3279-3282.

[13]Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants：the GUS gene fusion system[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1987，5（4）：387-405.

[14]王艷麗，葉興國，劉艷鵬，等. 農(nóng)桿菌敏感小麥基因型的篩選研究[J]. 麥類作物學(xué)報，2005，25（6）：6-10.

[15]武海娜，張永升，王小龍，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[J]. 麥類作物學(xué)報，2012，32（3）：421-426.

[16]郭志江，丁在松，王金明，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化敏感基因型小麥的篩選鑒定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（4）：81-84.胡云平，張靜，劉丹. 水肥耦合對春小麥葉片生態(tài)特性及產(chǎn)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（12）：48-52.endprint