努爾孜亞·亞力買買提，魏鵬，賈培松，羅影，郝敬喆，賈文捷

(農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091)

一種巴爾喀什蘑菇發(fā)酵料腐生菌的鑒定及其生物學(xué)特性研究

努爾孜亞·亞力買買提，魏鵬，賈培松，羅影，郝敬喆，賈文捷

(農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】制作巴爾喀什蘑菇培養(yǎng)料生產(chǎn)過程中，常發(fā)現(xiàn)一種腐生菌引起的病害，表現(xiàn)為棉籽殼發(fā)酵料發(fā)酵溫度持續(xù)偏低，料面濕滑。研究該病害的病原和生物學(xué)特性，為該病害的有效控制提供依據(jù)?！痉椒ā糠蛛x得到病原菌，觀察形態(tài)特征和分析rDNA-ITS序列?！窘Y(jié)果】該病原菌為粉紅菌寄生菌(Hypomycesrosellus)的分生孢子階段Cladobotryumnoes菌寄生所致巴爾喀什蘑菇粉紅菌病。該病原菌菌絲體最佳生長條件為20℃，屬低溫菌，pH 5.5偏酸性生長。葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，光照對菌絲體生長有一定抑制作用?！窘Y(jié)論】在食用菌生產(chǎn)過程中前期嚴(yán)格控制溫度條件，做好二次發(fā)酵，加強(qiáng)通風(fēng)和環(huán)境衛(wèi)生管理有助于預(yù)防巴爾喀什蘑菇紅菌病害發(fā)生。

巴爾喀什蘑菇；發(fā)酵料；腐生菌鑒定；粉紅菌；生物學(xué)特性

0 引 言

【研究意義】巴爾喀什蘑菇是新疆特有的野生食用菌品種，主要生長在中亞地區(qū)內(nèi)陸湖泊附近[1]，我國新疆部分地區(qū)有分布[2],目前還未能大規(guī)模人工栽培?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】培養(yǎng)草腐菌巴爾喀什蘑菇、雙孢菇等栽培食用菌常常受到病害的侵?jǐn)_，大多數(shù)致病真菌是霉菌類，具絲狀菌絲。這些病原真菌除腐生外，還具有不同的寄生性，多喜高溫、高濕和酸性環(huán)境，其中疣孢霉引起的褐腐病、輪枝霉引起的干泡病、輪指孢霉引起的軟腐病、頭孢霉引起的褶霉病、鐮孢霉引起的猝倒病等為當(dāng)?shù)囟嘁姵０l(fā)病害[3]。嚴(yán)重影響栽培的食用菌產(chǎn)量和品質(zhì)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2014年底，在阜康市職業(yè)技術(shù)學(xué)校雙孢菇生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)基地，馴化巴爾喀什蘑菇試驗(yàn)時(shí)，發(fā)生了一種病害，該病害的癥狀表現(xiàn)為，棉籽殼培養(yǎng)料發(fā)酵時(shí)料溫較低，料內(nèi)中心最高溫度僅60℃。將培養(yǎng)料置于栽培床上，料面濕滑有一層水漬，并伴有氨氣狀腥臭味。巴爾喀什蘑菇與雙孢菇菌種在培養(yǎng)料表面正常萌發(fā)，但前期萌發(fā)菌絲向培養(yǎng)料內(nèi)走菌緩慢或停滯生長，菌絲細(xì)弱，到生長后期料溫升高蘑菇菌絲發(fā)育能基本恢復(fù)正常。研究該病害的病原和生物學(xué)特性。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究該病害的病原菌種類與其發(fā)生危害程度，分析病原學(xué)及其生物性質(zhì)，為科學(xué)防治該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

病原菌分離自巴爾喀什蘑菇培養(yǎng)料棉籽殼。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL。通常稱PDA培養(yǎng)基。

馬鈴薯加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蛋白胨8 g，水1 000 mL。也稱PDA加富培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨8 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

基礎(chǔ)加富培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨8 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，VB1 10 mg，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 殺菌劑

50%咪酰胺錳鹽可濕性粉劑(上海生農(nóng)生化制品有限公司)、 50%苯菌靈可濕性粉劑(臺(tái)灣興農(nóng)中國有限公司)、70%甲基托布津可濕性粉劑(江蘇龍燈化學(xué)有限公司)、75%百菌清可濕性粉劑(江蘇科寧利民化工有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離純化

首先，在無菌條件下，用無菌水輕輕沖洗發(fā)病巴爾喀什蘑菇棉籽殼培養(yǎng)料3遍后，用滅過菌的濾紙吸干棉籽殼表面水分，將棉籽殼接種到PDA 培養(yǎng)基上，貼上封口膜后倒置于25℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，待長出菌落后進(jìn)行單孢分離純化，獲得純培養(yǎng)物，并進(jìn)行菌種fbj-1保藏[4]。

1.2.2 病菌rDNA ITS 序列測定

(1)總DNA 的提取：采用CTAB 法提取病原菌菌絲體的總DNA。

(2)rDNA ITS序列測定和分析：ITS 序列擴(kuò)增選用真菌通用引物[5]。

PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：17.7 μL 雙蒸DD無菌水，2 μL 10×buffer，2 μL dNTP，引物ITS1 和ITS4 各1 μL，1 μL 模板DNA，0.3 μL Taq 酶。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank(NCBI，http://www.ncbi)對比，經(jīng)GenBank 中Blast 后，下載與本序列最相近的序列以及其他相關(guān)真菌序列共6條(表1)，經(jīng)MAFFT v7.037b進(jìn)行序列比對及手工校正后，保存為FASTA 格式[6]。使用MrBayes 3.2 進(jìn)行貝葉斯推理法(BI)分析[7]。同時(shí)在軟件MEGA 6中采用鄰近歸并法(neighbor joining)經(jīng)1 000次bootstrap 驗(yàn)證構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

1.2.3 病原菌生物學(xué)特性

1.2.3.1 溫度

將病原菌在PDA平板上培養(yǎng)5 d 后，用經(jīng)滅菌的直徑5 mm 的打孔器打取菌落圓片，將菌落圓片接種在直徑9 cm 的PDA 平板上，置于不同溫度下恒溫培養(yǎng)。溫度設(shè)置為5、10、15、20、25、30和35℃ 等7 個(gè)梯度，培養(yǎng)4 d 后采用劃“十”字法測量菌落直徑，計(jì)算菌絲體生長速度，每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.2.3.2 pH 值

在無菌條件下用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)PDA 的pH 值，pH值設(shè)置為：3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5，方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 碳源

以馬鈴薯加富培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，分別用蔗糖、麥芽糖、淀粉來代替葡萄糖作為處理組。方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 氮源

以馬鈴薯加富培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，分別用酵母粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉來代替蛋白胨作為處理組。方法同1.2.3.1。

1.2.3.5 光照

將1.4.1 制得的菌落圓片接種在PDA 平板上，置于25℃光照培養(yǎng)箱中，分別設(shè)完全光照和完全黑暗兩個(gè)處理，培養(yǎng)4 d后采用劃“十”字法測量菌落直徑，計(jì)算菌落生長速度，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。

1.2.4 致病性測定

平板對峙培養(yǎng)：在PDA平板培養(yǎng)基表面一端相隔5cm距離先接種雙孢菇菌株，3 d后菌株萌發(fā)定植后，接目標(biāo)菌株fbj-1。在25恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，觀察菌落之間有無抑菌帶以及抑菌帶的寬度和拮抗方向等。

1.2.5 殺菌劑抑菌性測定

以PDA為培養(yǎng)基定量分裝于三角燒瓶內(nèi)滅菌"待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)分別加入咪酰胺錳鹽、苯菌靈、甲基托布津和百菌清可濕性粉劑，各藥劑濃度稀釋1 000倍，搖勻后倒入培養(yǎng)皿。待凝固后分別接直徑為 5 mm的粉孢菌菌塊。以不加殺菌劑的培養(yǎng)基作空白對照。每一處理重復(fù)4次。接種 5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算病原菌菌絲生長抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

病菌在PDA 上生長迅速，培養(yǎng)3 d后直徑4～5 cm，菌落粉紅色，表面蠟質(zhì)，背面變黃(圖1A)。菌絲發(fā)達(dá)，纖細(xì)，具有隔膜(圖1B)。分生孢子梗枝狀分枝，芽殖單生產(chǎn)孢(圖1C)。分生孢子單生或成聚生，分生孢子卵圓形，單胞或雙胞，無色，大小為8～10 μm×18～20 μm(圖1D)。未見有性世代出現(xiàn)。形態(tài)鑒定該病菌為葡枝霉屬Cladobotryumnoes真菌屬粉紅菌[9]。

(A)病原菌菌落形態(tài)；(B)菌絲體形態(tài)(10X10)；(C)孢子梗與分生孢子(10X16)；(D)分生孢子(10X40)

A: Colony on PDA；Bmycelium(10X10);C： Conidiophores and conidia (10X16);D: conidias (10X40)

圖1 粉紅菌寄生的菌落和形態(tài)特征

Fig.1 Colony and morphology of Cladobotryum sp.

2.2 病原菌rDNA ITS 序列

基于ITS-5.8S rDNA 序列，擴(kuò)增和凝膠電泳檢測，獲得大小約600 bp 的片段。經(jīng)測序測試，確定供試菌株fbj-1(EC5DKXBJ016) 的rDNA ITS 片段長度為591 bp。經(jīng)與GenBank中相關(guān)基因序列進(jìn)行同源性比對，菌株fbj-1 與金黃菌寄生Hypomycesaurantius(KM509060.1 和FJ442642.1)的DNA 同源性達(dá)到97%以上。表1

通過系統(tǒng)發(fā)育分析，供試菌株序列與Cladobotryummycophilum和Hypomycesodoratus在同一分支上屬Cladobotryumnoes粉紅葡枝霉。圖2

表1 基因序列同源性比對

Table 1 results of gene sequence homology comparison

菌株類型Description相似率Ident(%)GenBank登錄號(hào)GenBankAccessionNo．寄主Host金黃寄生菌Hypomycesaurantius97KM509060 1斑玉蕈Hypsizygusmarmoreus金黃寄生菌Hypomycesaurantius98FJ442642 1雙孢蘑菇Agaricusbisporus金黃寄生菌Hypomycessubiculosus98EU280093 1雙孢蘑菇Agaricusbisporus樹狀葡枝霉Cladobotryummycophilum91JF693809 1雙孢蘑菇AgaricusbisporusHypomycesodoratus90KX098650 1樹狀葡枝霉Cladobotryumprotrusumi90KU237239 1雙孢蘑菇Agaricusbisporus

標(biāo)尺0.5 為進(jìn)化距離

scale 0.5 is evolutionary distance

圖2 基于rDNA ITS 序列構(gòu)建的fbj-1系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig 2 fbj-1 phylogenetic tree constructed based on rDNA ITS sequence

2.3 病菌生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對菌絲體生長的影響

研究表明，該菌在不同的溫度下生長速度存在顯著差異。該菌在5～35℃內(nèi)均可生長，最適溫度為20℃。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)菌絲體停止生長。

2.3.2 pH 值對菌絲體生長的影響

研究表明，該菌在pH 4.5～10 的范圍內(nèi)均可生長，最適pH為5.5。當(dāng)pH達(dá)到10以后，菌絲體停止生長。病菌菌絲體在酸性條件下生長良好。

2.3.3 碳源對菌絲體生長的影響

研究表明，該病菌對供試4種碳源均能利用，其中以葡萄糖為最好，其次為蔗糖和淀粉，對麥芽糖利用較差。

2.3.4 氮源對菌絲體生長的影響

研究表明，病菌對除尿素以外的其他4種氮源均可利用，以蛋白胨效果最佳，酵母粉和硫酸銨次之，硝酸鈉較差，尿素幾乎不利用。

2.4 致病性測定

經(jīng)對峙測定，發(fā)現(xiàn)靠近蘑菇菌落處，雙孢蘑菇菌絲變白濃密，似乎形成拮抗線。顯微觀察顯示兩者菌絲間未發(fā)現(xiàn)相互纏繞的絞殺現(xiàn)象，呈現(xiàn)出菌絲間的交叉重疊。二者是對營養(yǎng)和空間的競爭關(guān)系屬于競爭性雜菌。圖3

A：雙孢菇菌絲；B：病原菌菌絲

A:Agaricusbisporus; B:Cladobotryum

圖3 雙孢菇菌落與病原菌菌落對峙培養(yǎng)形態(tài)

Fig.3 Stand facing each other colony with pathogen and Agaricus bisporus

2.5 殺菌劑對病原菌粉孢菌菌絲生長的影響

4種殺菌劑對病原菌菌絲均有一定的抑制作用，其中咪酰胺錳鹽抑菌效果最好達(dá)73.73%，其次是苯菌靈和甲基托布津，抑菌成果均亦達(dá)到37%以上。百菌清抑菌效果不明顯僅有16.19%。差異性分析發(fā)現(xiàn)，不同殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用呈現(xiàn)顯著性差異。

表2 4種殺菌劑下病原菌菌絲生長變化

Table2 Effects of 4 fungicides on the growth of mycelium of pathogenic bacteria

殺菌劑名稱菌落直徑IIIIIIIV菌絲生長抑制率(%)差異顯著性0．050．01咪酰胺錳鹽1 251 501 361 2073 63dD苯菌靈3 182 813 022 8741 01cC甲基托布津3 102 953 303 2137 64bB百菌清4 084 154 404 2516 19aACK4 934 855 165 20---

3 討 論

巴爾喀什蘑菇是中亞地區(qū)包括我國新疆內(nèi)陸湖畔紅柳和蘆葦?shù)雀硨酉律L的一類大型食用菌，通常在每年的春秋兩季形成碩大的子實(shí)體。子實(shí)體通常埋生在地表下30～50 cm，很少暴露地面[1]，目前該菌尚不能人工栽培。實(shí)驗(yàn)以棉籽殼為主要栽培基質(zhì)培養(yǎng)巴爾喀什蘑菇，采用培養(yǎng)雙孢菇的開放式栽培方式。培養(yǎng)料通過自然發(fā)酵，改變內(nèi)部營養(yǎng)成分和消除雜菌[10-11]。由于環(huán)境和人為因素的影響形成二次污染。競爭性病害葡枝霉病在培養(yǎng)料表面可形成圓形的濃密白色粉狀菌絲區(qū)，偶爾侵染床面上殘留子實(shí)體，形成紅色或黃色的病菇，最終變成黑色或褐色，腐爛[12]。該病分布于有機(jī)質(zhì)豐富的有機(jī)殘?bào)w中，在溫度20～30℃，菇房濕度90%以上時(shí)易發(fā)病，可為害茶樹菇、滑子菇、杏鮑菇多種食用菌[13]，已在歐洲、美洲和亞洲等地區(qū)都有報(bào)道，是一種世界性病害應(yīng)引起雙孢菇生產(chǎn)部門高度重視。藥劑防治栽培食用菌競爭性雜菌，先了解感染蘑菇的病原菌對它的的敏感性非常重要，選擇高效低毒低殘留的殺菌劑用于控制食用菌競爭性雜菌[14]。咪酰胺錳鹽、苯菌靈和甲基托布津?qū)Ψ揽胤坻呔休^好的防效，其中防腐保鮮劑咪酰胺錳鹽防效達(dá)73.63%并且殘留低可以推薦使用。百菌清對該病原菌防治效果較低不敏感。物理防治有效的蒸汽蒸煮是目前防治該病原菌最好的方法，目前雙孢菇栽培場所推廣的二次發(fā)酵和三次發(fā)酵技術(shù)可以防控該病害發(fā)生。

4 結(jié) 論

分離得到的病原菌通過對峙實(shí)驗(yàn)表明屬于競爭性雜菌。通過組織形態(tài)學(xué)觀察與rDNA ITS 序列分析可以判斷是屬于葡枝霉菌的無性型階段粉孢菌Cladobotryumnoes。該病原菌的菌絲體生長階段最適生長條件是，溫度20℃，pH 5.5屬低溫菌。最適碳源葡萄糖，最適氮源蛋白胨。防腐保鮮劑咪酰胺錳鹽防效達(dá)73.63%并且殘留低，蘑菇栽培期間對該病害的防控應(yīng)在蘑菇生產(chǎn)過程中前期嚴(yán)格控制溫度濕度，凈化環(huán)境條件，做好二次發(fā)酵工作，同時(shí)加強(qiáng)通風(fēng)和環(huán)境衛(wèi)生管理有助于預(yù)防該病害發(fā)生。

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BiologicalCharacteristicsofCladobotryumsp.parasiticonFermentMaterialofAgaricusbalchaschensis

Nurziya Yalimaimaiti, WEI Peng，JIA Pei-song, LUO Ying, HAO Jing-zhe, JIA Wen-jie

(KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCorpVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgricultureSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 The new disease is always found in the production process ofAgaricusbalchaschensiscultivation, which results in continuous low fermentation temperature and wet surface. This project aims to study the pathogen and biological characteristics of the disease in order to provide basis for more effective control.【Method】Through morphological observation and its rDNA sequence analysis to obtain pathogenic bacteria.【Result】The pathogenic fungus was determined to be Cladobotryum.sp. Through the study on the biological characteristics of the pathogenic bacteria, it was found that its mycelium best growth conditions was 20℃ low temperature bacteria, acidic pH5.5 growth，glucose was its carbon source, peptone was nitrogen source, and light had a certain inhibitory effect on mycelial growth.【Conclusion】The prevention and control of the disease should be strictly controlled by the temperature condition in the early stage of the production of edible fungi, and the two fermentation work should be carried out. At the same time, strengthening the ventilation and environmental sanitation management will help prevent the disease.

Agaricusbalchaschensis; ferment material; identification of saprophytic bacteria,Cladobotryumsp. ; biological characteristics

JIA Wen-jie(1969-)，(E-mail ) 1612367472@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.015

2017-05-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560577); 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目( CARS-24)

努爾孜亞·亞力買買提(1977-)，女，新疆伊犁人，助理研究員，研究方向?yàn)樵耘嗍秤镁N質(zhì)資源保藏與病蟲害防控，(E-mail)823037554@qq.com

賈文捷(1969-)，男，河北邢臺(tái)人，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)槭秤镁耘啵?E-mail)1612367472@qq.com

S188

：A

：1001-4330(2017)08-1489-07

Supported by: Supported by Natural Science Foundation of China (31560577) ；Supported by China Modern Agricultural Industry Technology System (CARS-24).