楊蓉，楊文琦，張崢，詹發(fā)強(qiáng)，侯敏，侯新強(qiáng)， 包慧芳，王寧，龍宣杞

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

2株番茄早疫病拮抗菌的分離篩選與拮抗作用研究

楊蓉1，楊文琦1，張崢2，詹發(fā)強(qiáng)1，侯敏1，侯新強(qiáng)1， 包慧芳1，王寧1，龍宣杞1

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

【目的】從新疆昌吉、焉耆、喀什、烏蘇、吉木薩爾五地多年種植番茄的農(nóng)田土壤樣品，進(jìn)行拮抗菌的篩選，選取對(duì)番茄早疫病菌(Alternariasolani)有具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株。【方法】采用平板分離培養(yǎng)法從加工番茄的根際土壤中分離拮抗菌，平板對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初篩和復(fù)篩，根據(jù)培養(yǎng)特征、菌體形態(tài)及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行初步鑒定，顯微觀察法觀察拮抗菌對(duì)病原菌菌絲生長的拮抗作用，盆栽法測(cè)定相對(duì)防效?！窘Y(jié)果】共分離得到90株細(xì)菌菌株，初篩得到對(duì)番茄早疫病菌有明顯拮抗作用的細(xì)菌，復(fù)篩選取2株抑制作用顯著的細(xì)菌(J2-2、J2-4)，并初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)的萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的近似種；顯微鏡下觀察到2株拮抗菌的發(fā)酵液對(duì)番茄早疫病菌絲有明顯的致畸作用；在盆栽試驗(yàn)中，拮抗菌發(fā)酵液對(duì)番茄早疫病菌的相對(duì)防效可達(dá)到35%以上?！窘Y(jié)論】篩選到的2株拮抗菌對(duì)番茄早疫病菌表現(xiàn)出較好的拮抗作用，對(duì)番茄早期病害的生物防治具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

番茄早疫病；分離；篩選；鑒定

0 引 言

【研究意義】番茄種植過程中常見的真菌性病害番茄早疫病、晚疫病、番茄灰霉病、葉霉病、番茄枯萎病等，其中番茄早疫病[Alternariasolani(Ellis et Martin)Jones et Grout .](也稱為輪紋病)，較為常見，在番茄的苗期和成株期發(fā)病，危害較大，嚴(yán)重影響到番茄光合產(chǎn)物的積累以及果實(shí)的形成，給人們的生產(chǎn)和健康造成危害。番茄早疫病的防治措施一般以化學(xué)農(nóng)藥為主，對(duì)土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)造成破壞，存在環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留問題，而生物防治具有無毒、高效、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為防治番茄早疫病的新途徑和研究熱點(diǎn)。研究從根際土壤中篩選拮抗菌，為番茄早疫病的生物防治提供材料，以期減少農(nóng)藥的使用量，提高番茄品質(zhì)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】番茄早疫病的病原菌為茄鏈格孢菌[A.solani( Ell Martin). sorauer]，屬半知菌亞門鏈格孢屬真菌，能引起多種作物病害，如馬鈴薯早疫病、甘藍(lán)黑斑病、蘋果斑點(diǎn)落葉病、梨黑斑病、梨黑斑病煙草赤星病等。有關(guān)采用拮抗菌來進(jìn)行各種植物病害的生物防治比較常見，王杏芹[1]等針對(duì)甜瓜細(xì)菌性斑點(diǎn)病和甜瓜角斑病篩選到對(duì)有明顯拮抗作用的拮抗菌；劉淑芳[2]等篩選到兩株的拮抗菌表現(xiàn)出較好的對(duì)蘋果炭疽病原菌的拮抗作用；李偉杰等[3]分離篩選得到的拮抗細(xì)菌對(duì)番茄青枯病有拮抗作用；張洪濤等[4]篩選出高抗棉花黃萎病的細(xì)菌。研究表明，利用拮抗菌進(jìn)行植物病害的生物防治的機(jī)理主要是通過競爭、拮抗，交叉保護(hù)、寄生或捕食和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等途徑[5]。不同的微生物對(duì)病原菌的拮抗機(jī)制有所不同，即使是同一種微生物，其作用機(jī)制也可能同時(shí)有很多種。如芽孢桿菌就有競爭位點(diǎn)、拮抗病原菌和誘導(dǎo)植物抗性等抑菌機(jī)制[6]，同時(shí)有些微生物還能夠促進(jìn)植物生長或者提高營養(yǎng)利用率。【本研究切入點(diǎn)】新疆土壤類型多樣，光熱資源豐富，是世界上適宜種植番茄的地區(qū)之一。因此，利用資源優(yōu)勢(shì)，新疆番茄加工業(yè)迅速發(fā)展，加工番茄種植面積逐年擴(kuò)大，成為中國番茄加工業(yè)主要的生產(chǎn)地區(qū)，總產(chǎn)量占到世界產(chǎn)量的9.6%，番茄醬也成為新疆重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品[7]，中國成為僅次于美國、意大利的世界上第三個(gè)番茄醬生產(chǎn)及出口大國[8]。但隨著加工番茄連年種植，多種土傳性病害對(duì)作物的危害日益加重[9]，其中番茄早疫病引起落花、落葉、落果和斷枝，對(duì)加工番茄的產(chǎn)量影響很大，嚴(yán)重時(shí)甚至減產(chǎn)50%以上[10]，而且病果內(nèi)含有的毒素能夠?qū)е氯嘶佳翰?，危及健康[11]。研究篩選對(duì)番茄早疫病菌具有較強(qiáng)抑菌特性菌株。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究對(duì)采自新疆昌吉、焉耆、喀什、烏蘇、吉木薩爾五個(gè)地方多年種植番茄的農(nóng)田土壤樣品，進(jìn)行拮抗菌的篩選，選取具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株，并采用形態(tài)特征及16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析方法對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行初步鑒定；分析拮抗菌發(fā)酵液對(duì)番茄早疫病菌的拮抗作用，為進(jìn)一步的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，為番茄早疫病的生物防治提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病原菌

由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC)提供的番茄早疫病菌(Alternariasolani)。

1.1.2 采集根際土樣

2016年6月，在昌吉、焉耆、喀什、烏蘇、吉木薩爾的加工番茄種植地中(C、J、Y、W、K分別代表昌吉、吉木薩爾、焉耆、烏蘇、喀什土樣)，采集幼苗根系和根際土，牛皮紙袋保存后，帶回試驗(yàn)室，用無菌剪刀剪取番茄幼苗根部，放入盛有100 mL無菌水的500 mL三角瓶中，室溫下以180 r/min的轉(zhuǎn)速震蕩30 min，制成均勻的土壤懸液。

1.1.3 篩選培養(yǎng)基[12]

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，細(xì)菌培養(yǎng)基(LB)；

1.1.4 儀器與試劑

MSSPX-250型培養(yǎng)箱， SW-CJ-1F B型雙人單面凈化工作臺(tái)，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，E360K離心機(jī)，HWY-100恒溫振蕩培養(yǎng)儀。Bio-Rad Mode 200/2.0型電泳儀，Eppendorf No:5345型PCR儀，United-Bio型凝膠成像儀，TaKaRa Biotechnology 的PCR預(yù)混液，其余試劑選用分析純?cè)噭?/p>

1.2 方 法

1.2.1 拮抗菌的分離和篩選

1.2.1.1 梯度稀釋分離法

先采用梯度稀釋分離法獲得根際土壤懸液的稀釋液：將番茄根際土樣10 g放入90 mL滅菌水的三角瓶中，振蕩20 min 后靜置20～30 s，即為10-1稀釋液，然后通過梯度法分別稀釋成10-2到10-6的稀釋液。再采用平板涂布法進(jìn)行分離培養(yǎng)：各取0.1 mL 的稀釋液(10-3、10-4、10-5、10-6)分別涂布于PDA 和LB培養(yǎng)基上，分別于32和37℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)基上長出分離物，對(duì)長出的菌落分離純化進(jìn)行劃線，最后劃線斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 平板對(duì)峙法[13]篩選拮抗菌

采用平板對(duì)峙法進(jìn)行篩選：番茄早疫病菌經(jīng)PDA培養(yǎng)基斜面活化后備用。將分離出的拮抗菌株用LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后，制成菌懸液，于PDA培養(yǎng)基周圍4點(diǎn)接種4 μL，32℃下繼續(xù)培養(yǎng)1 d，待四周菌落長至1 cm左右，在平板蓋上加入三氯甲烷1 mL，將平板放置4℃冰箱過夜。次日取出平板，用打孔器制備番茄早疫病菌的菌餅，置于上述的PDA培養(yǎng)基平板中央，并撤換平板蓋。放入28℃培養(yǎng)5 d。根據(jù)有無抑菌圈及抑菌帶的大小，判斷其拮抗效果，初選得到拮抗菌株，并對(duì)其進(jìn)行二次對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，從中篩選出拮抗能力較強(qiáng)的菌株以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 拮抗菌的形態(tài)學(xué)觀察

將菌株在LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌落形狀、顏色、透明度、邊緣形狀、生長培養(yǎng)形狀等特征。

1.2.2.2 鏡檢

準(zhǔn)備干凈的載玻片，滴一滴無菌水，將平板上的單菌落挑少量涂在載玻片上，使其完全涂開，然后從火焰上干燥固定，用結(jié)晶紫染液染1 min，水洗2～3次，晾干。顯微鏡油鏡下觀察菌體的形態(tài)、是否有芽孢。

1.2.3 優(yōu)勢(shì)PGPR菌的16S rDNA序列擴(kuò)增與分析

選擇LB平板上培養(yǎng)2 d的少量單菌落，挑入盛有25 μL無菌水的離心管中，100℃下8～10 min，迅速置冰浴中5 min，10 000 r/min離心處理5 min，4℃保存，上清液備用[14]。

根據(jù)細(xì)菌的16S rDNA序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，正向引物為：5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'；反向引物為：5'-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3'。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，組分如下：24 μL premix Taq，引物各1 μL，模板 2 μL，無菌水 22 μL。擴(kuò)增條件為：94℃ 4min；94℃ 30 s，55℃ 90 s，72℃ 30 s，循環(huán)為30個(gè)；72℃ 7 min。得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約 1 500 bp)經(jīng)瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離，然后直接進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

將測(cè)序得到的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行BLAST 分析，獲取相近的16S rDNA序列，采用ClustalX軟件和 MEGA 4.1 中的Neighbor-joining 法來構(gòu)建拮抗菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)番茄早疫病菌的抑制作用[15]

1.2.4.1 對(duì)病菌菌絲抑制作用的顯微觀察

將番茄早疫病菌點(diǎn)接在PDA平板中央，培養(yǎng)2 d，在平皿四周等距離(2.5 cm)處放置含有拮抗菌株發(fā)酵液的濾紙片，28℃恒溫培養(yǎng)6 d，鑷取早疫病菌菌落邊緣的菌絲于在載玻片上，在顯微鏡下觀察其菌絲的形態(tài)變化并拍照。

1.2.4.2 盆栽試驗(yàn)測(cè)定防效

綜上所述，高齡STEMI患者常合并糖尿病、高血壓、血脂異常等危險(xiǎn)因素，易發(fā)生無痛性的心肌梗死；冠狀動(dòng)脈以側(cè)支建立、多支病變、顯著鈣化、重度狹窄、復(fù)雜病變及彌漫病變?yōu)橹鳌?/p>

對(duì)于經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到的1-2株高效的拮抗菌，采用盆栽試驗(yàn)法測(cè)定其拮抗菌株發(fā)酵液對(duì)番茄早疫病的防治作用。在裝土的營養(yǎng)缽中播種加工番茄種子(市售)，當(dāng)幼苗長至 4～5片真葉時(shí)，取生長一致的植株，用無菌剪刀損傷幼苗根部，然后放入早疫病菌懸液中30 min，移栽到盆中，再灌根加入 20 mL 供試拮抗菌的發(fā)酵液。每個(gè)處理設(shè)10個(gè)重復(fù)，空白對(duì)照為清水灌根處理。在 25℃下保濕培養(yǎng) 48 h 后，觀察發(fā)病情況，7 d 后調(diào)查發(fā)病率和病情，計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防效。

病情調(diào)查中采用十字測(cè)量法測(cè)量每個(gè)病斑直徑，以病斑大小作為病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

0 級(jí)：葉片上無病斑；

1 級(jí)：病斑面積占葉片的 1/4 以下；

2 級(jí)：病斑面積占葉片的 1/4-1/2；

3 級(jí)：病斑面積占葉片的 1/2-3/4，近一半小葉枯死；

4 級(jí)：病斑面積占葉片的 3/4 以上，一半以上或全部小葉枯死；

相對(duì)防效(%)=[(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)] ×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離

經(jīng)平皿培養(yǎng)，得到可分離細(xì)菌。根據(jù)菌株的分離來源對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，從中得到細(xì)菌90株：C1-1、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C2-1、C2-2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、J1-1、J1-2、J1-3、J1-4、J1-5、J1-6、J1-7、J1-8、J2-1、J2-2、J2-3、J2-4、J2-5、J2-6、J2-7、J2-8、Y1-1、Y1-2、Y1-3、Y1-4、Y1-5、Y1-6、Y1-7、Y1-8、Y2-1、Y2-2、Y2-3、Y2-4、Y2-5、Y2-6、Y2-7、Y2-8、Y3-1、Y3-2、Y3-3、Y3-4、Y3-5、Y3-6、Y3-7、Y3-8、W1-1、W1-2、W1-3、W1-4、W1-5、W1-6、W1-7、W1-8、W2-1、W2-2、W2-3、W2-4、W2-5、W2-6、W2-7、W2-8、K1-1、K1-2、K1-3、K1-4、K1-5、K1-6、K1-7、K1-8、K2-1、K2-2、K2-3、K2-4、K2-5、K2-6、K2-7、K2-8。

2.2 拮抗細(xì)菌篩選

2.2.1 拮抗細(xì)菌初篩

從番茄根際土樣中共分離出90株細(xì)菌，采用平板對(duì)峙法，根據(jù)有無抑菌圈判斷其是否具有拮抗作用，初步篩選出對(duì)番茄早疫病菌具有一定拮抗能力的菌株。圖1

圖1 平板對(duì)峙試驗(yàn)初篩

Fig.1 Paired culture for preliminary screening

2.2.2 拮抗細(xì)菌復(fù)篩

對(duì)具有拮抗作用的菌株進(jìn)行二次對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，篩選出拮抗能力較強(qiáng)的菌株以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。復(fù)篩選取2株具有良好拮抗番茄早疫病菌作用的細(xì)菌分離物，分別為J2-2和J2-4，培養(yǎng)5d其能夠明顯地抑制番茄早疫病菌菌絲的生長，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩株菌的抑菌效果較為穩(wěn)定。圖2

2.3 菌落形態(tài)特征

復(fù)篩得到的拮抗菌菌株的菌落形態(tài)特征。表1，圖3

圖2 平板對(duì)峙試驗(yàn)復(fù)篩

Fig.2 Paired culture for second screening

表1 拮抗菌的培養(yǎng)特征及細(xì)胞形態(tài)

Table 1 Morphology of the colony and cell of antagonistic bacteria

菌株菌落特性及細(xì)胞形態(tài)J2-2菌落中小型，呈不規(guī)則圓形，邊緣不整齊，折皺，表面干燥不光滑，白色菌落，菌落直徑1-3mm，菌體桿狀，大量芽孢，芽孢中生。J2-4菌體中小型，圓形，邊緣矯正器，有環(huán)狀凸起，中間凹陷，表面平滑，乳白色，菌落直徑0 5～3mm，菌體桿狀，有芽孢，芽孢中生。

圖3 顯微鏡下的菌體形態(tài)

Fig.3Morphologyofbacteriacellundermicroscope

2.4 PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株J2-2和J2-4 16S rDNA PCR研究表明，擴(kuò)增條帶片段大小約為1 600 bp，與預(yù)計(jì)大小相當(dāng)，擴(kuò)增的樣品整齊度較高，目標(biāo)條帶清晰，無雜帶。

對(duì)所篩選的菌株J2-2和J2-4進(jìn)行16s rDNA基因序列分析，結(jié)果顯示同屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)在EZbiocloud中進(jìn)行檢索，利用MEGA5.0軟件對(duì)菌株16S rDNA序列跟同源性較高的幾株菌株的核酸序列進(jìn)行Neighbor-joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果表明，J2-2和J2-4菌株與芽孢桿菌屬(Bacillus)的序列同源性達(dá)到99.9%。因此，將J2-2和J2-4初步鑒定為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。圖4

2.5拮抗菌發(fā)酵液對(duì)番茄早疫病菌的抑制作用[15]

從拮抗細(xì)菌與早疫病病菌對(duì)峙的平板中抑菌圈邊緣挑取病菌菌絲，觀察發(fā)現(xiàn)挑出的菌絲，發(fā)現(xiàn)其在形態(tài)上發(fā)生了明顯的變化，菌絲多處都出現(xiàn)了溢縮，破裂的現(xiàn)象，有的部位還發(fā)生了畸變。扭曲變形、變粗、菌絲嚴(yán)重交聯(lián)并產(chǎn)生卵形或近圓形的厚垣飽子等現(xiàn)象，說明拮抗菌發(fā)酵液中具有抗菌活性成分，對(duì)病菌的菌絲有致畸作用。對(duì)照組沒有變化。圖6

通過盆栽試驗(yàn)，測(cè)定出拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病情的相對(duì)防效達(dá)到35%以上。表2，圖7

圖4 菌落16s rDNA PCR 結(jié)果(1：J2-2，2：J2-4)

Fig.4 The result of 16S rDNA PCR of colony(1: J2-2, 2: J2-4)

圖5 J2-2和J2-4 16SrDNA基因序列進(jìn)化樹

Fig.5 16SrDNAcladogramofJ2-2andJ2-4

圖6 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)番茄早疫病菌菌絲的影響

Fig.6 The effect of fermentation broth of antagonistic bacteria on A. solani mycelium

表2 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)番茄早疫病的防效作用(盆栽試驗(yàn))

Table 2 The control effect of fermentation broth of antagonistic bacteria on A. solani(pot incubation test)

處理Treated病情指數(shù)Diseaseindexes防治效果/%EfficacyJ2-25 17235 4J2-44 82839 65

圖7 盆栽試驗(yàn)

Fig.7 Pot incubation test

3 討 論

3.1 在我國的新疆、寧夏和內(nèi)蒙古等加工番茄主產(chǎn)區(qū)，加工番茄早疫病普遍發(fā)生，該病在番茄上的發(fā)病率達(dá)到30%，嚴(yán)重時(shí)可以達(dá)到50%以上，造成很嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10]。而且病果內(nèi)含有的毒素能夠?qū)е氯嘶佳翰?，危及健康[11]。番茄早疫病的危害十分嚴(yán)重，迫切需要高效和安全的防治措施，特別是生物防治措施，如利用拮抗菌來進(jìn)行防治。

3.2 拮抗菌中芽孢桿菌在植物病害生物防治方面的應(yīng)用十分廣泛，因產(chǎn)生內(nèi)生芽孢[16]，易于繁殖，與別的拮抗菌相比，芽孢桿菌抗逆性強(qiáng)，在土壤中的定殖能力強(qiáng)，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，對(duì)于拮抗菌制劑的實(shí)際生產(chǎn)有重要意義，具有很大的開發(fā)利用價(jià)值。馬平[17]等分離得到的枯草芽孢桿菌NCD-2，在溫室和田間中對(duì)番茄早疫病的防治效果顯著，田間防效達(dá)70%以上。研究對(duì)從新疆不同區(qū)域的土樣中分離90株細(xì)菌，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，得到2株拮抗能力強(qiáng)的菌株，經(jīng)過初步鑒定為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，在盆栽試驗(yàn)中，對(duì)番茄早疫病其發(fā)酵液表現(xiàn)出了較好的防效，其價(jià)值期待進(jìn)一步深入研究。研究從本地生境中分離得到的拮抗菌，適應(yīng)本地的生長環(huán)境及氣候特點(diǎn)，對(duì)于防治本地的番茄早期病害、提高作物產(chǎn)量、同時(shí)減少農(nóng)藥使用量以及構(gòu)建良好的生態(tài)環(huán)境具有積極的作用。

3.3 研究中的芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)于番茄早疫病的抑菌效果較好，但模擬對(duì)峙實(shí)驗(yàn)只針對(duì)植物體外，拮抗菌在自然環(huán)境下的拮抗能力能否持續(xù)？能否在土壤中定植？尚需要開展進(jìn)一步的應(yīng)用研究。

4 結(jié) 論

4.1 實(shí)驗(yàn)中分離得到對(duì)番茄早疫病的拮抗作用的細(xì)菌90株，經(jīng)過復(fù)篩，獲得拮抗能力較高的菌株2株，初步鑒定為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

4.2 對(duì)拮抗菌發(fā)酵液的抑菌作用進(jìn)行了觀察和測(cè)定。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，拮抗菌和病原菌在平板上共培養(yǎng)時(shí)，病菌的菌絲從形態(tài)上發(fā)生了明顯的變化，菌絲多處都出現(xiàn)了溢縮，破裂的現(xiàn)象，有的部位還發(fā)生了畸變，如變粗、扭曲變形、菌絲嚴(yán)重交聯(lián)并產(chǎn)生卵形或近圓形的厚垣孢子等現(xiàn)象，說明拮抗菌發(fā)酵液中具有抗菌活性成分，對(duì)病菌的菌絲有致畸作用。盆栽試驗(yàn)表明，對(duì)于早疫病菌脅迫下的番茄幼苗，拮抗菌發(fā)酵液的相對(duì)防效達(dá)到35%以上。

4.3 拮抗菌發(fā)酵液在盆栽試驗(yàn)防治效果比較好，但其在田間生產(chǎn)中的實(shí)際表現(xiàn)還需要做進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)和應(yīng)用研究。

References)

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IsolationandScreeningfor2StainsofAntagonisticBacteriaagainstAlternariasolaniofTomatoandStudyonAntagonisticEffect

YANG Rong1，YANG Wen-qi1，ZHANG Zheng2，ZHAN Fa-qiang1，HOU Min1，HOUXin-qiang1， BAOHui-fang1，WANG-Ning1，LONG Xuan-qi1

(1.InstituteofMicroorganismApplication,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.CollegeofLifeSciences&Technology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

【Objective】 Screening for bacteria againstAlternariasolaniotomato from rhizosphere of processing tomato.【Method】Isolating antagonistic bacteriafrom rhizosphere of processing tomatoby culture on medium plate, preliminary screening and second screening are carried on by paired culture, preliminary identification is based on morphological characteristic, phylogenetic analysis of 16S rDNA, antagonistic effect of fermentation broth against mycelium ofA.solaniis observed under microscope，relative control effect of fermentation brothof antagonistic bacteria is observed by pot incubation test.【Result】90trains of antagonisticbacteria have been isolated,from them, 3 strainsofbacteriahave been screened by preliminary screening while 2 strains by second screening with obvious antagonistic effect (J2-2, J2-4), and then the two stains were preliminary identified as allied species ofBacillusatrophaeusandBacillussubtilis, teratogenic effect of fermentation brothagainst pathogenic mycelium has been observed under microscope, the relative control effect of fermentation broth has been determined above 35% in pot incubation test.【Conclusion】The result shows that the two isolates with significant antagonistic effect toA.solanicould provide potential solution for biological control of early blighttomato.

Alternariasolani(tomato); isolation; screening; identification

LONG Xuan-qi(1969-)，，(E-mail)longxq_xj@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.016

2017-04-08

新疆維吾爾自治區(qū)科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金項(xiàng)目“設(shè)施農(nóng)業(yè)多價(jià)復(fù)合菌劑的示范推廣”(201554113)；新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目“新疆加工番茄早疫病拮抗菌的分離與篩選”(xjnkq-2015027)

楊蓉(1981-)，女，新疆人，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)橥寥牢⑸铮?E-mail)Lingxuan2519@126.com

龍宣杞(1969-)，女，四川人，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橥寥牢⑸锱c微生態(tài)學(xué)，(E-mail)longxq_xj@sina.com

S188

：A

：1001-4330(2017)08-1496-09

Supported by: Special funds for the transformation of scientific and technological achievements of Xinjiang (201554113); Demonstration and Extension on Multiple Bacteria Preparation in Facility Agriculture；Academy of Agricultural Sciences Fund for Yong Scientists Fund (xjnkq-2015027) , Isolation and Screening of Antagonistic BacteriaagainstAlternariasolaniof Processing Tomato in Xinjiang.