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(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

秀麗線蟲對(duì)根際益生菌P13和S3-1傳播作用及對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

劉星星, 楊文武,陳佳佳,肖明*

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海200234)

通過緩慢殺線實(shí)驗(yàn)、偏好性實(shí)驗(yàn)和共培養(yǎng)毒性實(shí)驗(yàn)分析了秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)對(duì)熒光假單胞菌P13(PseudomonasfluorescensP13)和解淀粉芽孢桿菌S3-1(BacillusamyloliquefaciensS3-1)傳播的可能性.通過顯微觀察與平板稀釋涂布對(duì)秀麗線蟲細(xì)菌攜帶作用進(jìn)行了定性、定量分析,并對(duì)細(xì)菌—線蟲—植物三者交互作用進(jìn)行初步探究.結(jié)果發(fā)現(xiàn),P13和S3-1對(duì)秀麗線蟲的慢性致死率分別為12.12%和3.00%,每10s身體彎曲次數(shù)分別為4.68和4.33.相對(duì)于尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(OP50),線蟲對(duì)P13和S3-1選擇系數(shù)分別為0.13和0.52,P13、S3-1攜帶菌量分別為(4.02×103±47)和(9.67×102±22)CFU/條.攜細(xì)菌線蟲將細(xì)菌定向傳播至植物根際,細(xì)菌定殖菌量為105CFU,有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育.

秀麗線蟲; 根際益生菌; 熒光假單胞菌P13; 解淀粉芽孢桿菌S3-1

0 引 言

土壤自由生線蟲長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是土壤生態(tài)的主要參與者,約占土壤線蟲的90%[1],它們通過不斷捕食細(xì)菌獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),移動(dòng)能力較強(qiáng),通過體表攜帶、腸道內(nèi)攜帶與接觸傳染將細(xì)菌傳播到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的區(qū)域[2].植物根際益生菌 (PGPR),是一類能夠在植物根際存活定殖,增強(qiáng)植物防控病害能力或促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益微生物[3],已報(bào)道的具有防病促生潛能的根際益生菌包括假單孢菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、固氮菌屬(Azotobacter)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、沙雷氏屬(Serratia)等20多個(gè)種屬[4],其中芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和假單胞菌屬為主要菌群.植物根際益生菌產(chǎn)生的環(huán)境友好型代謝產(chǎn)物可以作為生物肥料、殺蟲劑等,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有重要的意義.本研究利用秀麗線蟲研究了土壤動(dòng)物與熒光假單胞菌P13(PseudomonasfluorescensP13,以后簡(jiǎn)稱P13)和解淀粉芽孢桿菌S3-1(BacillusamyloliquefaciensS3-1,以后簡(jiǎn)稱S3-1)的相互作用,引入擬南芥和小青菜研究了線蟲、細(xì)菌、植物三者間的交互關(guān)系,證明了土壤動(dòng)物在環(huán)境健康中的重要作用,為兩株根際益生菌的生物菌肥應(yīng)用打下基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 動(dòng)物和細(xì)菌

秀麗線蟲N2(CaenorhabditiselegansN2,以后簡(jiǎn)稱線蟲)野生型和標(biāo)準(zhǔn)食物尿嘧啶缺陷型大腸桿菌OP50(EscherichiacoliOP50),由華中科技大學(xué)吳政星教授提供.

P13具有鏈霉素抗性,S3-1由上海師范大學(xué)微生物分子生物實(shí)驗(yàn)室分離、純化[5].

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 5g,瓊脂15～20 g,1 000 mL ddH2O,pH=7.4～7.6.

KMB培養(yǎng)基:蛋白胨20 g,甘油10 mL,K2HPO4·3H2O 1.5 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,瓊脂粉15～20 g,1 000 mL ddH2O,pH自然.

NGM培養(yǎng)基:蛋白胨2.5 g,NaCl 3 g,瓊脂粉15～20 g,去離子水975 mL,滅菌后加入物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的 MgSO41 mL,物質(zhì)的量濃度為1mol/L 的CaCl21 mL,物質(zhì)的量濃度為1 mol/L 的KPO4緩沖液25 mL,質(zhì)量濃度為5 mg/mL的膽固醇1 mL,pH自然.

TSB培養(yǎng)基:瓊脂粉15 g,胰蛋白酶大豆肉湯300 mg,1 000 mL ddH2O,pH自然.

MS培養(yǎng)基:MS固體粉2.215 g,瓊脂粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%,1 000 mL ddH2O,用于植物培養(yǎng).

堿裂解液:NaOH 2 g,體積分?jǐn)?shù)為9%的NaOCl 10 mL溶解于100 mL容量瓶配置成溶液,用于裂解蟲體.

M9緩沖液:NaCl 5 g,KH2PO43 g,Na2HPO46 g,物質(zhì)的量濃度為1 mol/L 的MgSO41 mL,1 000 mL ddH2O.

1.2線蟲對(duì)細(xì)菌傳播可能性分析

1.2.1 線蟲同步化

線蟲正常培養(yǎng)一段時(shí)間后,采用新配制的堿裂解液將蟲體裂解,獲得對(duì)堿裂解液具有抵抗力的蟲卵,將同步化后得到的卵液接種到覆有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上,20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)同步發(fā)育至L4期[6].

1.2.2 緩慢殺線實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Nina Neidig等[7]的方法,用緩慢殺線實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)P13、S3-1菌株對(duì)線蟲的毒性.

實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)24 h,用M9緩沖液洗下,稀釋懸液濃度直至OD600=0.5.按10 μL/孔接種到1/100 TSB培養(yǎng)基的24孔板上,28 ℃培養(yǎng)2 h,每組6個(gè)重復(fù).將L4期線蟲用M9緩沖液洗下,每孔添加20 μL(約60條)線蟲.記錄開始時(shí)和24 h后線蟲總數(shù)和死亡數(shù).沒有可見行動(dòng)的線蟲判斷為死亡.

1.2.3 共培養(yǎng)毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[8],共培養(yǎng)毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)苡脕泶_定S3-1和P13對(duì)線蟲的長(zhǎng)期影響.P13和S3-1在NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,接種混合蟲齡的線蟲,20℃培養(yǎng)5 d,記錄10 s內(nèi)線蟲身體彎曲的次數(shù).線蟲爬行過程中,身體沿垂直咽泵方向的一次改變?yōu)橐粋€(gè)身體彎曲.各組均隨機(jī)挑選10條線蟲測(cè)定.重復(fù)3次.

1.2.4 偏好性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[9],偏好性實(shí)驗(yàn)?zāi)苤苯臃从尘€蟲對(duì)不同菌株的捕食強(qiáng)度.采用直徑為90 mm 的NGM平板,將10 μL菌株接種在平板兩側(cè),距離板邊緣約1.5 cm,直徑約為0.5 cm的小孔內(nèi),中央接種20 μL(約50條)線蟲,20 ℃培養(yǎng)24 h,計(jì)數(shù)兩側(cè)菌落上線蟲數(shù).

選擇系數(shù)(CI):

C=1表示線蟲趨向于被測(cè)菌株1,C=-1表示線蟲趨向于被測(cè)菌株2,C=0表示無趨向.

1.3線蟲對(duì)細(xì)菌傳播能力測(cè)定

1.3.1 線蟲腸道P13熒光顯微觀察

P13能夠產(chǎn)生熒光色素,在紫外光下產(chǎn)生黃色熒光,將線蟲在P13菌苔中培養(yǎng)5 d后,通過熒光顯微鏡觀察線蟲腸道內(nèi)P13存在情況.將在OP50菌苔中生長(zhǎng)的線蟲接種至P13菌苔的NGM培養(yǎng)基中,20 ℃培養(yǎng)2 h,用M9緩沖液沖洗至容量為1.5 mL 的EP管,3 000 r/min離心3 min去上清液,重復(fù)3次,在熒光顯微鏡下觀察.

1.3.2 線蟲腸道細(xì)菌透射電鏡觀察

利用透射電子顯微鏡技術(shù)對(duì)線蟲腸道橫切面進(jìn)行觀察.將線蟲接種在涂布有P13和S3-1(菌落濃度為107CFU/mL)的NGM平板中培養(yǎng)20 h,收集線蟲;M9 緩沖液沖洗至容量為1.5 mL 的EP管,3 000 r/min離心3 min去上清液,重復(fù)3次.用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定,4 ℃保存,樣品進(jìn)行切片觀察.

對(duì)照組進(jìn)行饑餓處理.在OP50菌苔中生長(zhǎng)的線蟲用M9 緩沖液沖洗至容量為1.5 mL的 EP管,3 000 r/min離心3 min去上清液,重復(fù)3次.將線蟲接種至鏈霉素質(zhì)量濃度為50 μg/mL的NGM無菌培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h.

1.3.3 線蟲攜帶細(xì)菌數(shù)量測(cè)定

將20 μL(約60條)線蟲添加到涂有P13和S3-1的NGM平板上,培養(yǎng)3 d.隨后將線蟲移出至無菌平板,10條成年線蟲轉(zhuǎn)移到容量為1.5 mL的離心管,進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量確定實(shí)驗(yàn).用以下方法計(jì)數(shù)線蟲體表和體內(nèi)的細(xì)菌:第一組在1 mL M9 緩沖液中稀釋,輕輕晃動(dòng)以洗下依附在線蟲體表的細(xì)菌;第二組加入無菌石英砂,微型杵搗碎,釋放線蟲身體攜帶的所有細(xì)菌.利用平板稀釋涂布法將菌懸液分別涂布在KB、LB培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)菌落.重復(fù)3次.

1.4線蟲傳播細(xì)菌對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

1.4.1 植物培養(yǎng)與線蟲接種

種子萌發(fā):取優(yōu)質(zhì)小青菜種子,在KMnO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的溶液中浸泡20 min進(jìn)行表面消毒,置于滅菌培養(yǎng)皿的濾紙上,用無菌水濕潤(rùn),常溫培養(yǎng),幼苗長(zhǎng)出2～3片真葉后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

在3種菌苔OP50、S3-1和P13中生長(zhǎng)的線蟲用M9 緩沖液沖洗至EP管,3 000 r/min離心3 min后去上清液,重復(fù)3次.將幼苗和20 μL(約60條)線蟲接種于NGM平板兩側(cè),20 ℃培養(yǎng)24 h后鏡檢.對(duì)照組只接種20 μL等量的菌懸液,不接種線蟲.

1.4.2 植物根部細(xì)菌數(shù)量確定

培養(yǎng)7 d后的,將植物根部完全浸入無菌水中,充分晃動(dòng)將根際表面細(xì)菌全部洗下,利用平板稀釋涂布法將菌懸液分別涂布在KB、LB培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)菌落.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.5數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0 和Origin8.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.誤差棒顯示標(biāo)準(zhǔn)誤差(P<0.05).所有重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近.

2 結(jié)果和分析

2.1線蟲對(duì)細(xì)菌傳播可能性

2.1.1 緩慢殺線實(shí)驗(yàn)

圖1 線蟲在緩慢殺線實(shí)驗(yàn)中的死亡率,多重字母標(biāo)記法表示顯著性差異(p<0.01)

圖1為緩慢殺線實(shí)驗(yàn)中根際益生菌P13和S3-1對(duì)線蟲短期致死率.數(shù)值為3次實(shí)驗(yàn)平均值.P13和S3-1對(duì)線蟲的慢性致死率分別為12.12%和3.0%.相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株OP50(死亡率為0%),P13表現(xiàn)出了殺線活性.S3-1與OP50差異不顯著,而P13組與S3-1組表現(xiàn)出顯著差異.但總體看來,兩株根際細(xì)菌并沒有表現(xiàn)出強(qiáng)烈的殺線蟲活性,與對(duì)照組相比,S3-1幾乎沒有殺線蟲能力,P13的殺線蟲能力一般.

2.1.2 共培養(yǎng)毒性實(shí)驗(yàn)

圖2 線蟲在各菌株內(nèi)每10 s身體彎曲次數(shù)比較多重字母標(biāo)記法表示顯著性差異(p<0.01)

喂食S3-1、P13和OP50菌株5 d后,線蟲每10 s身體彎曲次數(shù)分別為4.33、4.68和5.50,如圖2所示.與標(biāo)準(zhǔn)菌株OP50比,P13和S3-1與對(duì)照組沒有顯著差異.雖然運(yùn)動(dòng)線蟲的身體彎曲頻率差異不顯著,但在P13菌苔中線蟲運(yùn)動(dòng)范圍較廣,且很少停在固定位置.而在S3-1菌苔中培養(yǎng)的線蟲多聚集在菌落周圍,有的會(huì)長(zhǎng)時(shí)間停留在菌落上進(jìn)行攝食不活動(dòng).共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,線蟲均能以根際益生菌S3-1和P13為食,且P13中線蟲生長(zhǎng)較快,成蟲較多.

2.1.3 偏好性實(shí)驗(yàn)

圖3為3種菌株相互對(duì)比的選擇性系數(shù)(CI)的平均值.從圖3中可以看出,隨機(jī)選擇幾乎不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.S3-1和P13相對(duì)OP50的選擇系數(shù)分別為0.52和0.13.與OP50相比,線蟲偏好捕食根際益生菌.同時(shí)存在S3-1和P13菌株時(shí),S3-1相對(duì)P13的選擇系數(shù)為0.32,即線蟲同樣偏好捕食S3-1.由此可知,線蟲顯著偏好S3-1,對(duì)P13表現(xiàn)出輕微偏好.實(shí)驗(yàn)中,線蟲在P13和S3-1菌株均沒有明顯的死亡現(xiàn)象,且線蟲可以正常生長(zhǎng)、繁殖.

2.2線蟲對(duì)細(xì)菌傳播能力測(cè)定

2.2.1 熒光顯微成像分析

P13能夠產(chǎn)生熒光色素,在紫外光下呈現(xiàn)黃色熒光,如圖4所示.喂食P13后,在線蟲的咽和中腸觀察到了黃色熒光,P13在線蟲腸道前部大量聚集.而經(jīng)饑餓處理的對(duì)照組其咽和腸道并沒有熒光現(xiàn)象.研究結(jié)果進(jìn)一步證明,線蟲能夠以P13為食物,且P13能夠聚集在線蟲的整個(gè)消化道中.

圖3 線蟲對(duì)細(xì)菌偏好性

圖4 線蟲腸道內(nèi)P13熒光觀察結(jié)果.(a) 饑餓處理對(duì)照組;(b) 線蟲與P13共培養(yǎng)

2.2.2 線蟲腸道細(xì)菌透射電鏡觀察

用透射電鏡對(duì)在兩株根際益生菌P13和S3-1中培養(yǎng)的線蟲進(jìn)行橫向切片觀察,在線蟲的腸道內(nèi)均觀察到兩種細(xì)菌,如圖5所示,經(jīng)過饑餓處理的線蟲腸道非常干凈,沒有菌體存在,說明線蟲腸道中食物全部清除(圖5(a)、5(d)).由圖可清楚地觀察到被鋨酸染成黑色的桿狀或短桿狀細(xì)菌(圖5(b)、5(c)).P13 菌苔中培養(yǎng)的線蟲腸道中可觀察到一些菌體細(xì)胞,但大部分菌體細(xì)胞已經(jīng)破碎、不完整,細(xì)菌長(zhǎng)度為1.4～1.7 μm,寬度為0.5～0.8 μm(圖5(e)).而在S3-1 菌苔中培養(yǎng)的線蟲腸道中,可觀察到許多完整的菌體細(xì)胞,及厚厚的莢膜(圖5(f)).據(jù)此推測(cè),線蟲對(duì)于P13 細(xì)菌消化水平較高,S3-1 菌體在線蟲腸道中的完整程度較高,這可能是由于P13為G-菌,線蟲易捕食和消化,而S3-1為G+菌,細(xì)胞壁較厚且受到芽孢保護(hù),不利于線蟲捕食并將其快速消化.

2.2.3 線蟲攜帶細(xì)菌數(shù)量測(cè)定

圖6顯示,線蟲體表攜帶3種細(xì)菌量分別為(3.38×102±12) CFU/條(OP50),(3.07×103±32) CFU/條(P13),(71±12) CFU/條(S3-1),體內(nèi)攜帶細(xì)菌數(shù)量分別為(8.84×102±30) CFU/條(OP50),(9.5×102±36) CFU/條(P13),(8.96×102±21) CFU/條(S3-1).線蟲體表攜帶P13細(xì)菌量最高,S3-1細(xì)菌攜帶量最低,對(duì)兩株菌攜帶量有顯著差異.線蟲體內(nèi)攜帶OP50、P13和S3-1細(xì)菌數(shù)量相差不大,約為102.線蟲對(duì)P13攜帶總量在三者中最高(4.02×103±47) CFU/條,其次為OP50(1.2×103±37) CFU/條,最低為S3-1(9.67×102±22) CFU/條.可能原因是經(jīng)線蟲長(zhǎng)期捕食后,細(xì)菌能夠穩(wěn)定地聚集在腸道中,導(dǎo)致含菌數(shù)量相差不大.比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),線蟲對(duì)G-菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的攜帶能力且體表和腸道均能被細(xì)菌所依附,而對(duì)于G+菌株的攜帶能力相對(duì)較弱且主要由腸道發(fā)揮攜帶功能.S3-1能夠形成莢膜和生物膜,將菌體凝聚在一起不易分開,再加上菌落本身具有粘性,致使S3-1不易在線蟲表面依附.

2.3線蟲傳播細(xì)菌對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

2.3.1 線蟲攜帶細(xì)菌趨向植物根際運(yùn)動(dòng)

首先利用模式植物擬南芥進(jìn)行了線蟲向植物的趨向性研究.在接種3種細(xì)菌和線蟲24 h后,根部就有線蟲出現(xiàn),而其他部位沒有線蟲,如圖7所示.線蟲表現(xiàn)出根部趨向性,3 d后擬南芥根部聚集了大量線蟲.

圖5 線蟲腸道橫切面透射電鏡圖.(a),(d) 饑餓處理線蟲;(b),(e) 線蟲與P13共培養(yǎng);(c),(f) 線蟲與S3-1共培養(yǎng)(il=intestinal lumen)

圖6 線蟲攜帶細(xì)菌數(shù)量對(duì)數(shù)平均值,多重字母標(biāo)記法表示顯著性差異(p<0.01)

選擇小青菜進(jìn)一步探索線蟲對(duì)于其他植物的趨向性運(yùn)動(dòng).在培養(yǎng)24 h后,線蟲本身攜帶的細(xì)菌長(zhǎng)出菌落.無線蟲細(xì)菌菌落不能在MS培養(yǎng)基上移動(dòng).當(dāng)細(xì)菌與線蟲共同接種后,P13 和S3-1細(xì)菌沿接種部位向周圍擴(kuò)散,如圖8所示.

2.3.2 線蟲向植物根部傳播細(xì)菌數(shù)量

P13和S3-1隨線蟲運(yùn)動(dòng)被運(yùn)送到植物根部,如圖9所示,7 d共培養(yǎng)后在根部分離出P13和S3-1.每株植物根際細(xì)菌定殖數(shù)量分別為(7.4×104± 3218) CFU(OP50),(7.5×104±3251) CFU(P13),(6.1×104± 3329) CFU(S3-1),平均每株細(xì)菌總量高達(dá)105CFU.

2.3.3 線蟲傳播細(xì)菌對(duì)小青菜生長(zhǎng)作用影響

與不經(jīng)菌株處理的對(duì)照(CK)相比,經(jīng)過菌株處理的小青菜的鮮重和干重均有明顯增加,如圖10(a)所示.接種P13、P13+線蟲、S3-1、S3-1+線蟲后,小青菜的鮮重分別增加了71.64%,85.07%,101.49%,176.11%.干重分別增加了12.12%,30.30%,42.42%,69.70%.說明根際益生菌和線蟲存在時(shí)能夠增加植物重量.P13組與P13+線蟲組植物鮮重和干重并沒有顯著差異.在4個(gè)處理組中,接種了線蟲和S3-1組植物的鮮重和干重達(dá)到最大值.

圖7 4倍顯微鏡下植物根部的線蟲.(a) OP50;(b) P13;(c) S3-1

圖8 線蟲對(duì)根際益生菌傳播效果

圖9 植物根際細(xì)菌定殖數(shù)量對(duì)數(shù)平均值,多重字母標(biāo)記法表示顯著性差異(p<0.01)

圖10 線蟲傳播細(xì)菌對(duì)小青菜生長(zhǎng)的影響.(A) 質(zhì)量;(B) 長(zhǎng)度,多重字母標(biāo)記法表示顯著性差異(p<0.01)

圖10(b)為線蟲傳播細(xì)菌對(duì)小青菜根長(zhǎng)的影響.在所有處理組中,P13對(duì)根長(zhǎng)的促進(jìn)作用最低,線蟲存在時(shí),根長(zhǎng)恢復(fù)到了與對(duì)照組相似水平,可能是線蟲影響了菌株活性,降低了其毒性作用.S3-1和S3-1+線蟲對(duì)根長(zhǎng)的促進(jìn)效果明顯,較其對(duì)照組有顯著差異.P13+線蟲能夠顯著影響植株莖長(zhǎng)的生長(zhǎng).綜合結(jié)果,單獨(dú)接種P13時(shí),其促生效果不明顯,與對(duì)照組無顯著差異.當(dāng)有線蟲存在時(shí),能夠顯著緩解P13的毒性作用,發(fā)揮其促生效果.單獨(dú)接種S3-1時(shí),與對(duì)照組相比,可以有顯著地促進(jìn)根長(zhǎng)莖長(zhǎng).與對(duì)照相比,S3-1+線蟲組同樣能夠促進(jìn)植株根、莖伸長(zhǎng),同時(shí)比單獨(dú)接種S3-1時(shí),效果更佳.

3 討 論

土壤線蟲主要通過影響微生物和作物根系的生長(zhǎng)來改變土壤的微環(huán)境,促進(jìn)植物地上部分的生長(zhǎng),具有十分重要的生態(tài)功能.線蟲對(duì)細(xì)菌的傳播是線蟲與細(xì)菌相互作用、共同影響的.

在自然環(huán)境中,線蟲對(duì)不好吃或有毒的菌種會(huì)表現(xiàn)出排斥行為,直接影響其對(duì)細(xì)菌的捕食與傳播能力;而細(xì)菌對(duì)線蟲的吸引能力及其對(duì)線蟲的生長(zhǎng)、繁殖以及壽命的影響會(huì)直接影響線蟲對(duì)細(xì)菌的傳播.例如,一些細(xì)菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,如2,4-DAPG[7]、PCA[10]等抗生素,絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、膠原酶等胞外蛋白酶[11],氰化氫(HCN)等殺線蟲氣體[12]能殺死線蟲影響傳播.Brent等[13]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的酸化能激活PCA毒性并在幾小時(shí)內(nèi)殺死線蟲.P13具有廣譜抗菌作用,對(duì)油菜菌核病菌有較強(qiáng)的拮抗作,其輕微殺線蟲能力,可能與其能夠產(chǎn)生的HCN有關(guān).

一些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物能保護(hù)線蟲免受病原菌傷害.Iatsenko[14]研究了線蟲腸道中B.subtilisGS67對(duì)病原菌的作用,B.subtilisGS67產(chǎn)生的脂肽抗生素豐原素能直接抑制病原菌感染線蟲并增強(qiáng)線蟲對(duì)病原菌的抵抗能力.S3-1對(duì)多種真菌病害具有很好的抗性,能夠產(chǎn)生表面活性素和伊枯草菌素,沒有殺線蟲能力,可能與其能產(chǎn)生脂肽抗生素相關(guān).

線蟲在土壤中捕食細(xì)菌獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),通過體表攜帶[15]、腸道內(nèi)攜帶與接觸傳染[16]將細(xì)菌傳播到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的區(qū)域.有研究表明線蟲只吸收20%的食物,將其余80%排出體外[17],線蟲攝食的細(xì)菌通過腸道后大部分仍保持活性[18].Félix和Duveau[19]研究野外捕獲的線蟲通常庇護(hù)大量微生物于腸道內(nèi).Kenney等[20]發(fā)現(xiàn)線蟲腸道可以幫助細(xì)菌對(duì)抗環(huán)境壓力,甚至死后也具備保護(hù)能力.本研究中,線蟲短期內(nèi)能迅速捕食S3-1和P13,并能庇護(hù)約102活菌于腸道中,不能將兩種菌株完全消化.

Jun-ichiro等[21]證實(shí)線蟲對(duì)植物根部具有趨化性,植物根部能產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)吸引線蟲向根部運(yùn)動(dòng).他們研究了線蟲將有益細(xì)菌攜帶至植物根際的行為,在平板和盆栽條件下觀察了植物、根瘤菌和食菌線蟲的交互關(guān)系[22],發(fā)現(xiàn)植物根部分泌的VOCs吸引攜帶細(xì)菌的線蟲前往,在苜蓿根部形成根瘤.表明根瘤菌能在線蟲體內(nèi)存活,并有生理活性.本研究中,線蟲在24 h內(nèi)即可對(duì)植物根部作定向運(yùn)動(dòng),并且每株植物根際約有105CFU的根際細(xì)菌定殖.P13和S3-1在植物根際定殖能夠促進(jìn)植物根和莖的伸長(zhǎng),增加植物干重和鮮重.線蟲對(duì)于細(xì)菌的傳播促進(jìn)了植物生長(zhǎng),對(duì)其生長(zhǎng)有重要的促進(jìn)作用.

4 結(jié) 論

在實(shí)驗(yàn)室條件下,根際益生菌熒光假單胞菌P13對(duì)野生型秀麗隱桿線蟲N2表現(xiàn)出輕微殺線蟲活性,S3-1幾乎沒有殺線蟲活性.同等條件下,線蟲更偏好于捕食S3-1.與P13和S3-1共培養(yǎng)后,線蟲均能以體表攜帶和體內(nèi)攜帶的方式將根際細(xì)菌傳播至植物根際,促進(jìn)植物干重、鮮重增加以及根、莖的伸長(zhǎng).在一個(gè)開放的系統(tǒng)中,根際益生菌—線蟲—植物三者的互動(dòng)可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定也有積極意義,全面理解線蟲、根際益生菌的環(huán)境與生態(tài)效應(yīng)還需在多種作物和不同地域進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn).

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(責(zé)任編輯：顧浩然)

TheeffectsofCaenorhabditiselegansonplantgrowth-promotingrhizobacteriaandplantgrowth

Liu Xingxing,YangWenwu,ChenJiajia,XiaoMing*

(College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai200234,China)

The diversity and ecology functions of soil nematodes have gained comprehensive attentions.In this study,we conducted a series of experiments (the slow killing assay,long time toxicity experiment and preference experiment)to test whether nematodesCaenorhabditiselegans(C.elegans) may contribute to the spread of the P13and S3-1.Combining microscopic observation with dilution-plate method,we analyzed the bacteria carried byC.elegans.Furthermore,we preliminarily explored the interactions of bacteria,nematodes and plants.Death rates ofC.elegansin slow killing assay driven by two strains were12.12% (P13) and3.0% (S3-1),separately.The body bending frequencies ofC.eleganswere4.68/10s (P13) and4.33/10s (S3-1),respectively.Choice indexes of P13and S3-1were0.13and0.52,separately.The total numbers of bacteria carried byC.eleganswere4.02×103±47(P13) and9.67×102±22(S3-1).C.eleganscarried bacteria to the rhizosphere where the bacteria content was as high as105CFU per plant root.As a vector of rhizosphere bacteria,C.eleganscan carry P13and S3-1to plant rhizosphere and effectively promote plant growth and development.

Caenorhabditiselegans; plant growth-promoting rhizobacteria;PseudomonasfluorescensP13;BacillusamyloliquefaciensS3-1

2016-07-03

上海市2016年度“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”項(xiàng)目(16391902100)

劉星星(1989-)，女，碩士研究生，主要從事土壤微生物學(xué)、動(dòng)物學(xué)等方面的研究.E-mail:sjzliuxing2011@163.com

導(dǎo)師簡(jiǎn)介: 肖 明(1961-)，男，博士后，博士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境微生物、分子生物學(xué)以及微生物與植物相互關(guān)系等方面的研究.E-mail:xiaom88@shnu.edu.cn

Q932

:A

:1000-5137(2017)04-0460-09

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